抽象的
肺实质中的淋巴卵泡是慢性阻塞性肺病(COPD)的特征。报道报道了COPD肺中的CD4 T-incualety细胞数改变,但尚未研究COPD肺组织特异性卵泡内的这些细胞的位置。
CD4的存在+Foxp3.+通过联合免疫荧光和免疫组织化学评估来自12个COPD患者的手术切除肺组织,11名吸烟者,11名吸烟者评估T-incumety细胞。
在所有三组患者中观察组织淋巴卵泡,以及缺乏组织的淋巴簇。与吸烟者(10%)和非料理(8%)相比,COPD(16%)卵泡中的CD4细胞的CD4细胞的百分比显着增加(p = 0.02)。相比之下,在簇中的T-调节细胞的百分比或基团之间的亚脑中没有变化(p> 0.05)。
慢性阻塞性肺病患者的淋巴滤泡增加了t调节性细胞。因此,慢性阻塞性肺病淋巴滤泡内的t调节活性可能被改变。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征在于进行渐进式气道炎症。改变的自适应免疫被认为在这种疾病的病理生理学中发挥作用,如CD8增加+在COPD患者的气道中发现T细胞和B淋巴细胞编号与对照相比1-3.,这些细胞的数量也随着疾病严重程度而增加1那4..有人提出慢性阻塞性肺病有自身免疫成分5.那6.,但引起淋巴细胞活化的抗原刺激尚不清楚。可能包括呼吸道中的病原体,如病毒或细菌,或吸烟改变自身抗原(包括弹性蛋白)的表现4.那6..COPD患者肺淋巴细胞活性的调节尚未完全理解。
调节性T细胞是CD4细胞的子集,其通过释放抑制剂分子,例如白细胞介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β或通过细胞对细胞接触机构来抑制活化淋巴细胞7.那8..Foxp3是一个成员叉或翼螺旋转录因子家族,被认为对t调节细胞的发育和功能至关重要9.那10,被认为是t调节细胞最特异的可用标记物11那12.
包括FOXP3在内的t调节标记物已被用于表明吸烟者支气管肺泡灌洗液中t调节细胞的数量增加13那14与非吸烟者相比。其中一项研究还表明,与肺功能正常的吸烟者相比,慢性阻塞性肺病患者的t调节数量减少,表明慢性阻塞性肺病患者的t调节功能下降。据报道,与对照组相比,肺气肿患者分散的肺组织淋巴细胞中t调节细胞数量减少,与全组织FOXP3 mRNA水平和IL-10的产生减少相关,进一步支持了t调节功能在COPD患者中降低的概念6..
被炎症组织部位吸引的淋巴细胞可以形成称为三级淋巴滤泡的有组织结构。据报道,这些病变存在于肠道和关节等组织中15那16,并在COPD患者的肺实质内观察到4.那17.这些卵泡具有B细胞芯,周围周围的T细胞17.树枝状细胞也存在于这些卵泡中,表明这些结构是慢性抗原呈现给淋巴细胞的部位17.已经提出,树突细胞参与了COPD卵泡内的异常免疫应答18.据我们所知,COPD患者肺淋巴卵泡中的T-incumatory细胞尚未研究过。
我们研究了中度COPD患者的肺部实质内的T-incormatory细胞数,专注于淋巴卵泡。我们假设具有正常对照组的COPD患者的实质T-调节细胞数将改变。使用双重荧光免疫细胞化学我们描述了CD4的特定位置+Foxp3.+COPD患者肺实质中的t调节性细胞。
材料和方法
研究科目
总共,30名患者接受疑似或确诊肺癌手术切除(表1⇓)被招募了。COPD诊断为≥10包 - YRS的吸烟史,典型症状(生产咳嗽,呼吸困难或喘息)和气流梗阻,定义为1 s中的强制呼气量(FEV1) <80%预测,FEV1/强迫肺活量(FVC)比值<0.7。这些患者均为中度COPD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) stage 2)。非COPD患者分为吸烟者和非吸烟者,其中包括有≤1年吸烟史的前吸烟者。所有受试者均给予书面知情同意。该研究得到了当地研究伦理委员会(南曼彻斯特研究伦理委员会)的批准。
组织取样和处理
从相同肺的相邻区域获得两个组织块,尽可能远离肿瘤,然后福尔马林固定和石蜡包埋。对于每位患者,染色两种组织块以用于免疫组化分析。所用的主要抗体如下:CD3(克隆PS1,Novocastra,Newcastle,UK,英国),CD4(克隆IF6,Novocastra),CD8(克隆C8 / 144B,Dako,Glostrup,德国),CD20(L26,Vector Labs),CD62L(克隆9H6,Novocastra)和Foxp3(AB10563,Abcam,剑桥,英国)。
将肺组织切成4μm截面,并抬起在孔涂层玻璃载玻片上。在Tris-EDTA缓冲液pH 8(10mM TRIS基碱,1mM EDTA,0.5%TWEEN 20)中,在1.5%正常血清中稀释的800W抗体,将肺截面微针在1.5%血清稀释(载体实验室,彼得伯勒,英国)在4°C施用过夜。通过在3%H中孵育部分淬灭内源过氧化物酶2O.2室温甲醇中30分钟。FOXP3的检测使用生物素化山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(Vector Labs),结合亲和素-生物素过氧化物酶复合物(Vector Labs)和二氨基联苯胺底物。切片用Meyer氏苏木精染色(Sigma, Poole, UK)。在染色方案中省略一抗和用同型对照抗体替代一抗(Vector Labs)作为阴性对照。
联合免疫荧光和免疫组化
如上所述,用Tris-EDTA缓冲pH8预处理切片,用正常的山羊血清封闭,然后在小鼠抗人CD4(1:10; Novocastra)或小鼠抗人类CD62L(1:50; Novocastra)中孵育在4°C下过夜。在使用Alexa 568缀合的山羊抗小鼠IgG(1:200; Invitrogen,Paisley,UK)部分进行检测并在兔抗人FoxP3(1:800; Abcam)中在4℃下在4℃下孵育并如上所述检测。然后在4',6-二脒基-2-苯基吲哚(Invitrogen)中孵育部分,以充当荧光核核心。在平行部分进行一个或其他一抗或两者的省略以提供对照。
图像分析
CD4的数量+Foxp3.+在炎性滤泡和簇内以及小气道的上皮下层内计算t调节细胞;无软骨和腺组织的气道,内部周长< 6mm。为了获得双标记图像,从同一个区域捕获亮场和荧光图像并进行数字合并以确定CD4+Foxp3.+细胞。数码显微照片使用尼康Eclipse 80i显微镜(尼康英国有限公司,英国萨里),配备QImaging数码相机(Media Cybernetics, Marlow英国)和ImagePro Plus 5.1软件(Media Cybernetics)。使用ImagePro Plus 5.1软件对单个细胞计数、滤泡大小和气道管腔周长进行定量。在100µm上皮下计数与小气道相关的CD4细胞。计算细胞计数并将其标准化为阳性细胞数·mm-2感兴趣的领域(群体,卵泡或遗迹)。
统计分析
数据不是正态分布的,因此使用非参数方差分析进行组间的三方比较。当方差分析发现显著差异时,定义为p<0.05,随后进行Mann-Whitney u检验进行双向比较。使用GraphPad InStat 3.06版本(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)进行分析。
结果
三淋巴结分布
从每个患者组的样品中观察到三级淋巴卵泡。检测到毛线与气道壁相关联(图1A⇓)并且还作为肺实质内的分离结构(图1B⇓),如前所述4.那17.这些有组织的卵泡由位于同心层中排列的密集细胞组成(图1C-F.⇓).卵泡有一个大的CD20+外层为CD3的b细胞核心+T细胞,包括CD4+和CD8+细胞。也观察到无组织结构的炎性团簇(图1g)⇓和h)。在簇中,T细胞群不再与外层相关,而是始终分布或分散。大多数卵泡(89.4%; 85个)和簇(86.4%)在肺部进行植物中检测到植物,其余与气道相关联(表2⇓).
在30个受试者的60个样本中(IE。COPD,吸烟者和非助手合并)在COPD患者中观察到每种样品的卵泡数量的数值增加,具有重要意义(P = 0.068)。组之间的簇数没有显着差异(p = 0.11)。
CD4分布
Anova分析显示COPD,吸烟者和非助手之间的显着差异,CD4的数量+卵泡内的细胞(p = 0.004)。Mann-Whitney U-Tests显示CD4的数量+COPD滤泡细胞增多(中位4,390个细胞·mm)-2)相比吸烟者(中位3,370个细胞·mm-2;p = 0.0009)。虽然CD4的数量也有差异+COPD和非摩尔卵体内的T细胞,这些在统计学上没有统计学意义(P = 0.1)。
Anova分析显示COPD,吸烟者和非助手之间的显着差异,CD4的数量+上皮下细胞(p = 0.02;表3⇓).随后的Mann-Whitney U-Test分析显示CD4的增加+COPD上皮下t细胞(中位448个细胞·mm)-2)与吸烟者(中位数200个细胞·mm)相比-2;P = 0.015)和非摩托车(中位数260个细胞·mm-2;P = 0.04),但吸烟者与不吸烟者之间无差异(P >0.05)。
Anova分析显示COPD,吸烟者和非闻名者之间的差别在CD4的数量之间+细胞集群。
CD4+Foxp3.+t调节细胞
CD4+Foxp3.+t调节细胞主要分布在炎症滤泡周围(图2a)⇓),而在簇中,观察到T-调节细胞以散落。CD4的绝对数量+Foxp3.+小气道上皮下细胞较低(图2a-c)⇓和表3.⇑).观察到FoxP3免疫反应性与细胞核有关。所有foxp3+鉴定的细胞也是CD4+.CD8+Foxp3.+未鉴定细胞(图2F⇓).在相邻的连续切片上,当协议中省略FOXP3一抗或用同型对照抗体替换时,未观察到免疫反应产物(图2g)⇓和h)。
与吸烟者和非吸烟者相比,COPD患者的卵泡中t调节细胞数量增加,无论是以CD4细胞总数还是百分比表示(表3)⇑).Mann-Whitney U-Tests表明CD4的百分比+Foxp3.+来自COPD的卵泡内的细胞(中值160个细胞·mm-2)显著增加(中位100个细胞·mm-2;P = 0.032)和非闻名者(中位数80个细胞·mm-2;p = 0.027)。吸烟者和非莫克斯卵泡没有区别(P = 0.36)。
无论是否表达为CD4细胞的总数或百分比,簇中的T-inuctionboration细胞数没有显着差异(表3⇑).
在COPD患者中,CD4种群的百分比为FOXP3+与簇或亚病程相比,卵泡中显着增加(表3⇑).在吸烟者和非吸烟者中,Foxp3的总CD4种群的百分比没有差异+在卵泡,簇和亚脑膜炎之间(表3⇑).
T-incumenty细胞的CD62L表达
来确定CD4是否+Foxp3.+t调节性细胞表达次级淋巴组织归巢受体CD62L,每个患者在一个区进行CD62L和FOXP3的双重标记表达(图2e)⇑).CD62L的百分比差异无统计学意义+Foxp3.+组间细胞数(p = 0.68)。COPD、吸烟者和非吸烟者的中位(范围)分别为47(6 - 75%)%、42(22 - 50%)%和46(4 - 75%)%。
讨论
这是第一项量化和描述CD4本地化的研究+Foxp3.+COPD患者人肺实质内的T-incumencation细胞。以前的研究表征了来自支气管肺泡灌洗液(BALF),分散的肺细胞和外周血的T-调节细胞6.那13那14.主要的发现是CD4+Foxp3.+与具有正常肺功能的吸烟者和非吸烟者相比,中度COPD患者的炎性卵泡内T-调节细胞显着增加。
我们观察到在COPD肺组织内出现为未经用化的结构(称为簇)的炎症淋巴胚。类似地,已经描述了可以代表未成熟卵泡的松散有组织的肠炎簇19.我们假设我们研究中观察到的炎症簇也可能反映未成熟或早期的三级淋巴卵泡。
与吸烟者和非吸烟者相比,COPD患者卵泡内的T型调节细胞比例增加。然而,在簇和蜂窝中,群体之间的T型调节细胞比例没有差异。已经假设COPD卵泡内的树突细胞未诱导适当的T细胞应答,而是主要诱导CD8+t细胞增殖18.这些CD8细胞离开滤泡,在气道和实质内聚集18.因此,COPD滤泡内的局部免疫微环境似乎涉及多种细胞类型,我们的观察也提示了t调节性细胞在该微环境中的作用。我们推测,COPD滤泡中t调节细胞数量的增加,抑制了树突状细胞和t细胞之间导致CD8增殖的相互作用。这一假设有待进一步研究。
最近的研究还描述了类风湿性关节炎患者的第三节淋巴卵泡内的T-incumatory细胞15,以及炎症肠病患者的粘膜活检16.由于卵泡具有B细胞核心,已经提出了Foxp3+T-调节细胞可以直接介导B细胞活性20..我们推测t调节细胞在COPD淋巴滤泡中的另一个可能作用是抑制b细胞的激活。
我们调查了肺组织中t调节性细胞的数量,需要进一步研究这些细胞的功能,如调节性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。据报道,COPD患者肺组织中IL-10的生成减少,提示t调节活性降低6..虽然我们观察到COPD淋巴卵泡中的增加的T-调节细胞,但它们的功能能力是否保存是一个关键问题。
以前的研究表明,与BALF中的非吸烟者相比,吸烟者增加了T-incumonatory细胞数量。有一项研究的证据,但在自己进行的研究中,COPD患者与具有正常肺功能的吸烟者相比,COPD患者的患者减少了T-incormatory细胞数。在使用分散的肺淋巴细胞的不同研究中,与吸烟者和非吸烟者的混合对照组相比,肺气肿患者的T-incumatory细胞的数量降低。相比之下,我们目前的观察表明COPD患者中的T-incualcoration细胞数增加。研究之间的差异可能是我们专门研究淋巴卵泡的事实,与通过灌洗采样气道腔的研究相比。这些不同隔室内的细胞可以具有不同的特征。以前的研究用流式细胞术用CD4CD25高表达作为评估T-incualetcent细胞数的主要方法。然而,已知一些CD4CD25high细胞被激活而不是调节淋巴细胞,并且调节T细胞的最佳标记是目前研究中使用的一种,即FOXP3。
Foxp3.+T-调节细胞已被分类为次级淋巴归巢T细胞或非含糊组织归索FOXP3+T细胞20.那21.转运受体(包括CD62L)的差异表达已被用于区分淋巴归巢t调节性细胞21.在目前的研究中,在滤泡和簇中发现的t调节性细胞表达CD62L,表明t调节性细胞募集类似于次级淋巴结21那22.COPD的存在没有改变CD62L的表达,表明COPD卵泡内的T-调节细胞数增加不是由于该贩运受体的表达。
只有约50%的FOXP3+t调节性细胞为CD62L+,可能是由于趋化因子受体切换,在迁移到淋巴器官时发生在淋巴细胞上21.卵泡内的抗原呈递可能导致辅助趋化因子受体开关,使淋巴细胞能够有效地迁移到非糊组织中23.我们的发现仅是表达CD62L的调节性T细胞的50%可能是由于趋化因子受体切换。
本研究的主要目的是分析卵泡内的T-调节细胞数。我们还收集了来自COPD患者和对照的样本中的卵泡数量的数据。如前所述,我们识别与小气道相关的卵泡4.那17,以及如前所述肺实质内的滤泡17.但是,我们有意进一步研究组之间的卵泡数的差异,因为这在使用较大的样本尺寸的其他地方在其他地方广泛报道,而不是目前的研究4.那17.此外,我们只包括中度COPD患者,而先前的研究包括更多的患者,包括严重(黄金第3阶段)和非常严重(金阶段4)患者。这与铰齿很重要等等。4.表明,严重和非常严重的COPD患者的卵泡数量急剧增加。铭记目前在疾病范围内研究的限制,很明显,我们的研究不会在卵泡流行率方面通知我们任何新颖。我们会强调我们没有出发才能调查这一点。
先前的研究表明,吸烟者的卵泡数量比不吸烟者多24,但吸烟者和温和至适中的COPD之间没有区别4.那25.我们的研究显示,与吸烟者相比,中度COPD患者卵泡内t调节细胞数量增加。我们推测这是中度COPD患者的卵泡内含有抗原呈递树突状细胞、CD8细胞和大量b细胞的免疫活性增加的一个指标。据推测,慢性阻塞性肺病与自身免疫有关5.那6.因此,中度慢性阻塞性肺病患者t调节活性的增加可能是控制自身免疫的一种尝试。慢性阻塞性肺病由中度发展到重度,与滤泡数量的急剧增加有关4.,可能因监管机制而抑制自身免疫的失败。
参与本研究的受试者正在接受疑似肺癌的调查。我们不能完全排除肺癌可能对我们的结果产生的任何效果。然而,我们的观察结果> 80%的三级淋巴卵泡分布在肺实质内,而不是支气管相关的淋巴组织是根据最近使用来自肺还原手术和肺移植患者的非癌症肺组织的研究17.
总之,我们观察到在中度COPD患者实质滤泡中t调节细胞的比例增加。正常情况下,t调节性细胞调节持续的免疫反应并防止自身免疫。这些T调节细胞的功能或数量的改变可能与免疫调节的变化有关。t调节性细胞在COPD淋巴滤泡中的确切作用需要进一步关注。
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2008年7月3日。
- 公认2009年1月20日。
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