摘要
卡介苗Calmette-Guérin (Bacille Calmette-Guérin, BCG)接种可混淆结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)反应,诊断潜伏性结核感染(LTBI)。
将TST与A进行比较结核分枝杆菌在德国一所警察学院的一次MTB感染爆发中进行的特异性酶联免疫斑点(ELISPOT)分析。
参与者根据与首例病例密切接触(n = 36)或偶然接触(n = 333)的LTBI风险分组。在TST方面,密切接触者的应答率为53%(36人中有19人),偶尔接触者的应答率为16%(333人中有52人)。共有56例tst阳性接触者(71人中56例,占78.9%)和27例tst阴性对照(298人中27例,占9.1%)进行了ELISPOT检测。两组中ELISPOT阳性检测结果的比值比(OR)分别为29.2(95%可信区间(CI) 3.5-245.0)和19.7(95%可信区间(CI) 2.0-190.2)。在369名接触者中,158人(42.8%)以前曾接种卡介苗。TST与ELISPOT总体一致性较低,TST阳性反应与卡介苗接种混杂(OR 4.8 (95% CI 1.3-18.0))。相比之下,在偶尔接触者中使用10mm的TST硬化边界显示,在未接种者中TST和ELISPOT之间具有很强的一致性。
在Bacille Calmette-guérin接种疫苗的个人身上结核分枝杆菌特异性酶联免疫蛋白酶测定是潜在结核病感染风险的更好指标,而不是结核蛋白皮肤测试。
当前感染了大约三分之一的人类结核分枝杆菌(MTB),导致显着的发病率和死亡率> 200万人死亡·YR−11.结核病控制规划旨在通过阻断结核分枝杆菌的传播来降低结核病的发病率。追踪接触者和治疗潜伏结核感染(LTBI)患者是结核控制规划的关键组成部分。此外,结核病控制的其他重要关键组成部分是,通过提供更好的获得有质量保证的结核病痰液显微镜以及结核病治疗中的直接观察治疗短期策略,改善结核病症状患者,特别是艾滋病毒感染者的病例发现。后者通过在直接观察下的标准化短期化疗中不间断地提供抗结核药物,达到更高的治愈率2.
通过应用经典流行病学和分子毒株分型技术,以人群为基础的研究最近显示,即使在结核病发病率较低的国家,结核分枝杆菌的传播频率也很高3.- - - - - -7.Mantoux引进的结核菌素皮肤试验(TST)已被广泛用作一种筛查试验,以识别LTBI个体。在筛查LTBI时,TST阳性结果的预测价值(阳性预测值(positive predictive value, PPV))是TST阳性结果接触者真正感染并因此可能从化疗中获益的概率8.这种单一参数一方面结合了该方法的敏感性和特异性,另一方面,在检查的群体子集中的TB感染的患病率。在密切的触点中,感染的患病率在确定PPV时只起了次要作用,因为它们的MTB传输风险超过了一般人群的风险。因此,在接触研究步骤之后,PPV主要受测试方法的特异性的影响:特异性越高(即。低水平的假阳性结果),阳性结果的PPV越高。
Mantoux试验临床适用性的一个问题是它与其他分枝杆菌抗原的交叉反应性,如分枝杆菌M. Bovis.Bacillus calmette-guérin(BCG)疫苗菌株和环境分枝杆菌物种。这种交叉反应性导致假阳性结果并降低TST的PPV。因此,已经探索了检测LTBI的替代诊断工具。MTB的一种抗原,其在实验模型中诱导强干扰素(IFN)-γ分泌CD4 T细胞免疫应答9,10.,而这在M. Bovis.BCG和大多数其他不合理的分枝杆菌,是早期分泌抗原靶6(ESAT-6)。通过检测IFN-γ-点状细胞计数ESAT-6-反应性外周血单核细胞(PBMC)已成功地用于识别有活性和潜在MTB感染的人11.- - - - - -16..
而mtb特异性ELISPOT检测的敏感性似乎与TST相当17.,该检测的特异性实际上可能优于经典的TST。然而,迄今为止,针对这一问题的研究要么是在MTB发病率中等的国家进行的18.(而在大多数欧洲国家和美国,结核分枝杆菌的发病率很低)或与儿童一起19..到目前为止,尚未对低发病率环境中与单一来源病例直接相关的成人接触者进行ELISPOT检测。
从2004年1月开始,在德国联邦石勒苏益格-荷尔斯泰因州的Eutin镇的一所警察学院,有必要对青年和中年成年人进行广泛的接触追踪。2003年9月中旬,其中一名学员(一名31岁的未婚前宪兵,1973年接种过卡其布疫苗)抱怨咳嗽不断,身体虚弱。在接受广谱抗生素治疗后,病人的病情暂时好转,2003年12月出现咯血。当时的胸片显示在右上叶有广泛的浸润和空洞,他被送进了肺部诊所。痰标本经Ziehl-Neelsen染色显示3+抗酸杆菌。分离株经文化确认为结核分枝杆菌,对一线药物敏感。尽管进行了标准的四联抗结核药物治疗,痰涂片上仍然存在抗酸杆菌,并且在开始治疗2个月后痰液中仍然可以培养出结核分枝杆菌。因此,该患者必须被认为是首例患者,可能与警察学院营房的人接触长达4个月,具有高度传染性。
本作者参与了警察学院营房的联系方式,并与TST和基于ESAT-6的ELISPOT之间的协议进行了比较,以识别LTBI。
材料和方法
研究人群
警察学院的联系调查在自2003年9月以来,由于接触指数案件,共有369人患有LTBI的风险。其中287名曾出生于前西部,74(20.1%)在前东方德国和八人是外国出生的,并迁移到德国。
触点的平均值(范围)年龄为28(15-62)。联系人主要是雄性(n = 265; 71.8%)。没有主题报告在接触指数案件之前与TB的人有任何接触。三十六个人(9.8%)被认为是密切的触点(图1⇓);这些包括35名警察学员,他与索引案例(第一年集团5和6)和一名教师(见下文)共享相同的课堂和睡眠区,他们在心肺复苏中培训了索引案件。
另外333个触点在他假定的传染期期间仅偶尔接触着指数案例,并且在暴露时间或接近程度方面没有显着变化。这些联系人包括187名进一步的Cadets,46名教师和100个人作为车辆维护人员,行政管,厨房人员,清洁剂或统一储存器的成员(图1⇑)。
根据目前德国接触者追踪国家指南的要求20.所有这些接触者都在最后一次可能接触指示病例12周后接受了初步Mantoux TST检测。在前臂掌侧行TST, 48-72小时后读取结果。对tst阳性接触者进行了胸片检查,并回顾了临床和影像学表现,以寻找活动性结核病的证据。没有一个接触者报告说他们的HIV血清呈阳性,接受血液透析,目前正在接受皮质类固醇或其他免疫抑制剂治疗,或已知患有恶性疾病或糖尿病。未接种疫苗的接触者之前均未参与过接触者追踪或在与就业有关的调查中给出阳性结果。
在所有369个联系人中,158名(42.8%)有以前的BCG疫苗接种疫苗;因此,由于LTBI治疗的功效高度依赖于真正的MTB感染的比例,因此提供了由ELISPOT进行测试的皮肤测试阳性的可能性,以便提供有关Mantoux测试的PPV的更多信息.出于实际原因,仅通过随机化选择了ELISPOT测试的每一个TST阴性个体,以提供对照组。所有个人都同意参加该研究。
细胞培养物
通过从肝素化血液的Ficoll-hypaque密度梯度离心来制备PBMC,并在含有100μl的RPMI 1640培养基中投入培养物-1青霉素,100μg·ml-1链霉素、2更易·L-1l- 谷氨酰胺和5%胎牛血清(培养基)。
ELISPOT测定
人体IFN-γ的ELISPOT测定是根据制造商的指南(Autoimmun Diagnostika(AID),Strasberg,德国)进行的。简而言之,在96孔板上在96孔板上镀过夜,预先用小鼠抗人IFN-γ抗体,每孔预先涂覆200,000pbmc。细胞未刺激(阴性对照),用10 ng·mL刺激-1抗cd3单克隆抗体(克隆X35;beckman coulter、Krefeld、德国;阳性对照),取10µg·mL-1结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD;血清研究所,哥本哈根,丹麦)和5μg·mL-1ESAT-6抗原(由AID提供)37℃培养20 h后,洗涤平板,然后在生物素化的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体存在下室温孵育2.5 h。再次反复洗涤,然后与链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶孵育2小时后再次洗涤,底物缓冲液(含3-氨基-9-乙基咔唑和H2O2) 加入。通过加入水在20-30分钟后停止反应。用水反复洗涤后,使板干燥。通过使用AID ELISPOT读取器系统ELR02(AID)来执行对斑点的可视化和分析。如果测试良好含有比阴性对照阱至少五个斑点,则认为刺激培养物的响应被认为是阳性的,并且该数量至少是阴性对照孔中的两倍。负控制孔中的斑点的斑点总是每孔<5个点。
统计分析
使用卡方检验比较分类数据(或Fisher’s exact检验,当预期细胞大小小于5时)。使用κ系数评估TST和ELISPOT检测结果的一致性。值<40%表示弱相关性(如果有);0.41-0.60表示一致性良好,>值为0.6表示一致性较强21..
由于没有测定LTBI的金标准,分析的重点是估计暴露程度、即。接触者与病例来源的接近程度。在密切接触组和偶尔接触组之间的比较中,使用后勤回归程序来估计每项试验的优势比(ORs)结果。除暴露程度(分层)外,变量还包括年龄、出生来源(东德或西德)、ELISPOT和TST结果以及卡介苗接种史。所有测试都作为双边测试执行。
结果
369个触点的总共71(19.2%)在TST部位开发了5%≥5mm:36个关闭触点(52.8%)和333个非卷曲触点中的52个(15.6%; P <0.001)。根据目前的德国指南19.在美国,这个大小被作为测试中阳性的临界值。TST结果阳性的患者平均年龄±1岁sd25.9±11.0yrs,比含有负TST的显着较小(29.1±11.5,P <0.05)并且具有类似的性分布,但在原产地不同。总共有20分中,出生于前东德国的74名(27.0%)有一个积极的TST结果,但在前西德国出生的287名(16.0%,P <0.001)中只有46人这样做了。在德国东德国出生的74人(89.2%)中,六十六人以前在德国西德国出生的287名(30.7%)中有88名疫苗接种疫苗(P <0.001)。
2004年春季春季(2005年4月13日诊断)开发了39年代的男性讲师的密切联系人,开发了结核性胸膜炎。DNA指纹结果已可用,并且可以确认由于索引案例引起的最近传输(图2⇓)。联系跟踪后,没有其他联系人在接触后开发了活跃的TB。在德国汉堡大都市的正在进行的人口流行病学研究中,距离eutin镇~60公里,通过在1997 - 2004年研究期间的IS6110 DNA指纹和Spoligotyping进行分子菌株调查1,205名患者的分离物。联系跟踪结果和额外的患者访谈已被用于进一步的流行病学分析。在所有患者中,基于相应分离株的相同指纹图案分组〜40%。限制片段长度多态性簇的尺寸范围为2至45个分离物;然而,大多数集群仅包括两个分离株22.,23..在Eutin接触调查中涉及的特殊菌株在研究期间造成了包括5名患者的暴发。
平均大小±sd在BCG接种的TST阳性中,TST为13.8±6.7mm,在未接触的接触中为16.2±8.0mm,但这种差异在统计学上没有统计学意义。
共有83例接触者接受了ELISPOT检测(图3)⇓;table 1⇓);71例tst阳性接触者中有56例(78.9%)被随机选取,298例tst阴性接触者中有27例(9.1%)被随机选取。15例tst阳性接触者拒绝ELISPOT检测。总而言之,TST与ELISPOT的一致性较低(κ = 0.16, 95%可信区间(CI) 0.1-0.25;P = 0.006), 83人中只有40人(48.2%)有一致的结果,即。56名TST呈阳性的接触者中有13名(23.2%)(19名TST呈阳性的密切接触者中有8名(42.1%),37名偶尔接触者中有5名(13.5%)),27名学生中有27名(100%)TST呈阴性。在未接种者中,ELISPOT和TST结果一致(κ = 0.5, 95% CI 0.4-0.6;p = 0.001)。18例TST阴性的非接种接触者均为ELISPOT阴性。18例tst阳性患者中有9例(50%)ELISPOT阳性
卡介苗接种与elisa结果无相关性(κ = 0.04)。
在所有联系人中,369个(42.8%)的158人从未接受过BCG疫苗接种。其中44(27.8%)给出了阳性TST结果。然而,在没有接受BCG疫苗接种的211个接触中,只有27(12.8%)给出了阳性结果(P <0.0001)。
38例既往接种卡介苗的tst阳性接触者进行ELISPOT检测,其中4例(10.5%)为阳性,18例未接种的tst阳性接触者中9例(50%)为阳性(p<0.01)。
由于接受TST测试和ESAT-6测试的接触者人数差异显著,使用logistic回归分析分别估算暴露程度与TST或ELISPOT反应之间的比值比(OR)。已列入83个获得ESAT-6结果的联络人(表2)⇓)。与偶尔接触指数案例的人群相比,发现阳性ELISPOT试验的风险较高29.2倍(95%CI 3.5-245.0; P = 0.002),以及具有正面TST的风险当个体与索引案件密切接触时,更高的19.7倍(95%CI 2.0-190.2; P = 0.01)。然而,与ESAT-6测试相比(没有显着的或),这种结果被BCG疫苗接种(或4.8(95%CI 1.3-18.0; P = 0.02)强烈混淆;表3⇓)。
按照目前的指南,所有TST (>5 mm硬化)阳性的患者接受9个月的异烟肼预防治疗。
讨论
在德国警察学院的TB爆发的联系人研究中,与在ELISPOT测定中的PBMC中的MTB特异性T细胞的检测比以阳性TST反应的检测更密切相关。这种发现与年龄,性别和BCG接种疫苗接种状态无关。在过去的TB的低发病率,具有大量与BCG接种的人,ELISPOT允许在真正的感染和交叉反应性之间允许更好的歧视,因此可以规避BCG对TST的不可预测的影响。然而,这项研究是在健康的年轻人中进行的,这并不允许在患有慢性潜在疾病的年龄较大的人群中评估该测试的有用性。
在369名接受调查的接触者中,71人(19.2%)呈tst阳性。虽然TST仍被认为是诊断LTBI的金标准,但TST只能间接诊断LTBI,并能产生大量的假阳性检测结果13..然而,官方指南24.要求在检测结果呈阳性后进行治疗。然而,这项研究揭示了两个关键因素,它们会影响在TST阳性的基础上对假定LTBI进行化疗的决定。首先,从绝对数字来看,偶尔接种者中tst阳性的人数多于密切接触者,而相对而言,曾接种过疫苗的接触者中tst阳性的人数是密切接触者的两倍多(158人中有44人(27.9%))。相对211个(12.8%)中的27个),表明由于交叉反应性而产生假阳性反应的可能性M. Bovis.BCG。
本研究表明,当将TST的硬化切断设定为5mm直径时,在56 TST正触点之间的TST和ELISPOT测定的结果之间的相关性差和ELISPOT测定之间的相关性差。由于对照组显示出优异的一致性(κ= 1.0),因此无法解释这种显着的差异。此外,令人惊讶的是,80%的联系人同意ELISPOT测试未能确认正常的TST结果。这表明了三种可能性。首先是ELISPOT不足以确认真正的LTBI。其次是,代表阳性结果的TST的切断由于高估了接触的真实程度的曝光而且必须升高。第三是,如在BCG疫苗接种的情况下,甚至由于可能存在的众多物种,甚至通过实验室调查,甚至可以确定感染患病率的其他分枝杆菌的交叉反应性。
这项研究中长大的大多数联系人在前东德国成长,如果TST控制在早期青春期期显示重新转化为阴性,则在出生时接种了BCG疫苗接种。然而,BCG疫苗接种仅在德国均匀地进行。TST-和MTB特异性ELISPOT的结果对传染性源情况的接触程度敏感。然而,由于BCG疫苗接种的混淆,在外周血中检测外周血中的MTB特异性T细胞似乎是较好的方法,当相当多的触点之前是接种疫苗的。这些调查结果与儿童的研究一致13.,19.在BCG接种的情况下,TST更容易在非累积儿童中接种阳性,而MTB特异性T细胞的INF-γ产生与BCG疫苗接种状态无关。
最近在成人中研究了预先对LTBI的TST-和MTB特异性IFN-γ释放测定对TST-和MTB的特异性IFN-γ释放测定的影响19.,18.,25..在这些研究中,并且仅在本研究的结果一致中,仅在BCG-Unvacalinal的个体中,阳性MTB特异性IFN-γ释放测定与阳性TST结果高度呈正相关。BCG疫苗接种是TST的混淆,但不是IFN-γ释放测定13.,18.,25..最近,一种mtb特异性ELISPOT与美国结核病患者接触者的TST进行了比较。在209例未接种卡介苗的人群中,TST阳性和ELISPOT阳性的频率基本一致。即使在未接种卡介苗的人群中,ELISPOT与指示病例的接触程度也往往比TST更密切相关26..
目前的研究旨在探讨BCG疫苗接种对成人MTB传播的影响;然而,与BCG-Unvaccald的个体相比,接受BCG疫苗接种的个体的阳性MTB特异性ELISPOT的频率降低。如最近提出的,这种差异可能是由于BCG疫苗接种对MTB感染的保护作用27..与该低入射区域中的其他菌株相比,涉及该爆发的菌株具有正常的毒力水平。然而,只有369个触点中的只有13个可以通过ELISPOT确认,使LTBI只有其中一个(7.7%)在后续后2岁内发育活性TB。与其他爆发相比,这是略微较低的次要速率(如。在19.,97个ELISPOT确认的LTBI病例(9.2%)中有九种次要病例)。在丹麦的一项研究中,在32个与LTBI的32个联系人中没有发生TB的继发情况13.,TB的发生率也很低。值得注意的是,先前的BCG疫苗接种不能防止该研究中的MTB感染。
目前的德国指南20.区分密切接触者和偶尔接触者,但在评估TST反应时不区分不同的截止尺寸。然而,当真正发生结核分枝杆菌感染的统计可能性受到短时间暴露的限制时,小的TST硬化代表假阳性反应的可能性就会增加。因此,本文作者认为,在TST中采用较高的阳性分界点可能会导致两种检验之间较高的一致性。遵循美国胸科协会(ATS)的现行指导方针28.,截距提高到下一个推荐直径,即。≥10毫米。这是为风险增加但不是密切接触者的人建议的截止直径。这导致总体上的κ值增加到0.29,对于未接种疫苗的接触者,κ值增加到0.61,表明两种测试之间的一致性很强。logistic回归分析显示,BCG混杂消失,TST阳性的OR值为25.9 (95% CI 2.8 ~ 238.1;表4⇓)。
偶尔接触的截止至10 mm的事实也导致TST的结果与非申报人群中的ELISPOT之间的强烈一致性似乎支持BCG作为一个混杂者的影响和所扮演的部分暴露在源的实际持续时间。这对应于其他研究的结果,其中当从一开始时使用10毫米的直径时,可以看到TST和ELISPOT之间的强烈一致性29..因此,在对结核病接触者进行TST追踪时,如ATS/疾病控制和预防中心和目前的德国指南所述,在接种了卡介苗的个人和/或偶然接触者中,截点为10毫米而不是5毫米的TST应被视为阳性。然而,即使在没有卡介苗接种史和TST >10 mm的个体中,mtb特异性IFN-γ释放试验可能是比TST更好的LTBI风险指标。对于决定启动针对LTBI的化疗,TST > 10mm应通过连续的mtb特异性IFN-γ释放来确认,这进一步减少错误分类为mtb感染的接触者数量。
近年来,通过ELISA或ELISPOT检测mtb特异性t细胞产生的IFN-γ,在诊断活动性和潜伏性结核病方面显示出非常有前景的结果11.,16.,18.,30.- - - - - -38.使用MTB特异性抗原的测试,例如ESAT-6和MTB基因组中的差异(RD)-1区域中的培养的滤糊蛋白-10具有比用PPD抗原的测试更好的特异性28.,35,36,39.rd-1在最不合适的分枝杆菌中不存在(除了M. Marinum,M. Szulgai和m . kansasii),因此与基于ppd的TST相比,假阳性结果的可能性较小。这些试验的敏感性可以通过使用两种抗原的组合来提高,这是本研究的局限性。然而,即使只使用ESAT-6抗原,这些检测的特异性也接近100%11.,15.,36.目前目前尚不清楚使用ELISA和ELISPOT的测试结果是等同的,并且需要研究与TST同时进行比较。
总之,这里提供的数据表明结核分枝杆菌- 特异性酶联免疫蛋白优于延迟结核病感染的结核蛋白皮肤测试,并且是考虑向早期接受芽孢杆菌疫苗接种疫苗接种和/或其接触状态的人施用化疗的可能性时选择的测试.对于偶尔和芽孢杆菌植物植物疫苗接种接种接触,应从5至10 mm升高结核蛋白皮肤测试切断,以最小化误阳性结果的数量。这项研究表明,芽孢杆菌的疫苗接种状态的知识在潜在结核病感染的诊断中是重要的。
致谢
作者谨此感谢R.Reichenbach和J. Schenck在研究中心Borstel和警方Schleswig-Holstein的医疗服务人员提供技术援助,以获得帮助。
- 已收到2005年9月12日。
- 接受2006年2月7日。
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