抽象的
需要研究上皮细胞系和原发性上皮,使呼吸疾病观察到的气道上皮的结构异常潜在的机制,包括哮喘和慢性阻塞性肺病。
新型电池 - 基板阻抗检测技术用于监测细胞粘附/展开,屏障功能和伤口愈合。将原发性支气管上皮与气道上皮细胞系16HBE14O-,BEA-2B,NCI-H292和A549进行比较。
与16HBE14o细胞相比,BEAS-2B、A549和原代细胞形成融合单层的速度更快。相比之下,16HBE14o-细胞形成更强的细胞间接触,其抗性是BEAS-2B、A549和NCI-H292细胞的10倍,是原代细胞的5倍。16HBE14o-细胞中黏附分子occludens-1和E-cadherin的表达最高。在16HBE14o-和原代细胞中,这些分子都定位于细胞间连接。最后,与16HBE14o细胞相比,BEAS-2B细胞损伤后屏障功能的恢复受损。
总之,上皮细胞类型显示出显着的表型差异,因此应该用于解决特定的研究问题。16HBE14O-细胞出现最适合对屏障形成的研究,而原发性和BEA-2B的附着和A549细胞的相似性使后者对细胞 - 基质接触的翻译研究更为重要。
气道上皮在各种肺病的发病机制中起着核心作用,包括哮喘,慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化。在健康受试者中,呼吸上皮充当有害吸入物质的物理障碍,例如过敏原、香烟烟雾和病原体。上皮屏障功能通过所谓的粘附连接(AJ)和紧密连接(TJ)中的细胞间接触形成来维持。AJs通过粘附分子E-钙粘蛋白在相邻细胞上的同型相互作用调节粘附,提供TJs所需的结构1.TJ是更自体的,包括相互作用的蛋白质闭塞蛋白,克劳德汀和ZONO闭塞(ZO)-1并限制锥虫渗透性。在病理条件下,上皮完整性和/或效率低下的上皮修复的破坏可能导致环境因素增加,例如过敏原,到上皮下层。事实上,哮喘患者的气道上皮经常受损,通透性增加,E-cadherin和ZO-1表达缺失2-4..上皮屏障的破坏也可能与结构异常和上皮重塑有关,IE。如COPD所观察到的粘液增生和鳞状细胞元增生5.那6..
上皮屏障在损伤后的快速恢复至关重要,在哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病患者中,这一屏障可能被扭曲。气道上皮的完全再生需要上皮细胞的迁移、增殖和重建成分化良好的上皮细胞,形成功能细胞间连接。因此,更好地描述生长和修复过程中的细胞粘附是寻找新的治疗策略的关键。此外,使用具有高翻译价值的细胞系对免疫组化具有重要意义体内情况。由于不同的细胞系的能力变化以形成细胞 - 细胞触点7.比较支气管上皮细胞16HBE14o-、BEAS-2B、黏液表皮样癌细胞NCI-H292、肺泡ii型癌细胞A549和原发性支气管上皮细胞(PBECs)的粘附能力。上皮电阻(R.ep)的测量采用了一种新的技术,即电池-衬底阻抗传感(ECIS),允许精确的实时监测R.ep,能够区分不同的过程,这些过程有助于其中的变化,IE。细胞附着和外细胞间隙的形成8..此外,利用ECIS系统可重复性和定量研究电穿孔损伤后上皮修复和屏障恢复的差异。最后,研究气道上皮细胞类型的差异是否与细胞-细胞接触分子表达的差异有关。
方法
细胞培养
人支气管上皮细胞系16HBE14o-由D.C. Gruenert(加利福尼亚大学,旧金山,CA, USA)提供,在Eagle最低必需培养基(EMEM)/10%胎牛血清(FCS;Biowhittaker, Verviers,比利时)在胶原蛋白涂层烧瓶上,如前所述9..在胶原涂的烧瓶上以RPMI培养基/ 10%FCS培养人支气管BEA-2B细胞。癌细胞系NCI-H292和A549在RPMI培养基/ 10%FCS中的未涂覆烧瓶上培养。所有培养基均补充了100 u·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素。如前所述,从哮喘、COPD和健康对照者的支气管刷拭中获得和培养PBECs10-12.细胞在激素补充的支气管上皮生长培养基中培养(BEGM;longza, Walkersville, MD, USA),装在涂有胶原蛋白和纤维连接蛋白的烧瓶中13,并用于第2节的实验。来自健康供体的上皮细胞用于ECIS和免疫检测/染色(n = 3)。来自COPD和哮喘患者的上皮细胞用于免疫检测/染色(n = 3)或ECIS (n = 1)。
ECIS
使用ECIS测量培养细胞的抗性,如前所述8..所有测试的细胞系都生长在胶原蛋白涂层阵列上,而原代细胞生长在纤维连接蛋白+胶原涂层阵列上。细胞粘附测量是基于不同频率下施加在电极阵列上的电流的电阻/电容变化(应用生物物理学,Troy, NY, USA)。进行了频率扫描,以测试在哪个频率上差异最大R.ep在细胞覆盖和无细胞电极之间获得。基线使用培养基建立(400μl·井-1),并与在400 μL培养基中单层细胞覆盖电极所得值进行比较。研究电阻的最佳频率为400hz。为了测量电阻/电容,细胞接种在7.5×104. cells·well-1,除非另有说明,每份400 μL一式两份。用5 V 40 kHz电压脉冲电穿孔30 s进行创伤。
气液界面
对于气液界面(ALI)培养,细胞在5.0×10上生长、收获和播种4. cells·insert-1在半透明膜上(Transwell; Corning Incorporated,剑桥,美国;孔径0.4μm;直径12毫米)涂有30g·ml-1胶原蛋白和10 μg·mL-1牛血清白蛋白。细胞在Dulbecco's modified Eagle培养基(Lonza)和添加视黄酸的BEGM (Sigma, St Louis, MO, USA;ng·15毫升-1),浸泡至合流(4-7天),之后再暴露于ALI 2-4周。暴露于ALI后14至26天观察到粘液纤毛分化。R.ep使用伏安计(EVOM;世界精密仪器公司,萨拉索塔,FL,美国),其不同于ECIS的表面面积(1.12厘米2用于多孔膜插入件与5×10-4 cm2对于ECIS系统中的电极),施加电流(20与在ECIS系统中为1μA),并且无法测量不同频率,从而区分细胞 - 细胞和细胞矩阵触点。
小干扰RNA下调E-Cadherin
如前所述,通过小干扰RNA (siRNA), E-cadherin基因在16HBE14o-细胞中的表达下调9..简单地说,细胞在5×10上播种4. cells·well-1并以最终浓度为20%的E-钙粘蛋白靶向siRNA/非靶向控制寡核苷酸(Eurogentec,Liège,比利时)转染 μM使用寡fectamine(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen公司)。
蛋白质印迹免疫检测
将细胞重悬在Laemmli缓冲液中,获得细胞总裂解液,并按照前面所述进行免疫检测9.,采用抗E-Cadherin(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)和抗ZO-1(Zymed,San Francisco,CA,USA)。
免疫荧光染色
在Lab-Teks (Nunc, Rochester, NY, USA)上培养的细胞用PBS/CaCl洗涤2那fixed in ice-cold acetone (90%) for 30 min, blocked in PBS/5% BSA for 60 min, incubated for 60 min with primary antibodies (1:200) and then subsequently incubated for 60 min with fluorescein-isothiocyanate-labelled anti-rabbit (1:200, Dako Diagnostics, Mississauga, ON, Canada) or rhodamine-labelled anti-mouse immunoglobulin G conjugates (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA; 1:400) or rhodamine-labelled phalloidin (Cytoskeleton, Inc., Denver, CO, USA; 1:200) in the presence of 4’,6-diamidino-2-phenylindole (1:500) and analysed as described previously14.
结果
16HBE14o附着和细胞-细胞接触形成的特征
首先通过监测高频(40kHz)的单层和低频率(400Hz)的电阻来测试人支气管上皮16HBE14O-细胞。这R.ep细胞粘附区电流的大小取决于施加电流的频率。韦格纳et al。8.研究表明,当监测生长和附着时,在低频(低频电阻)下测量电阻最为敏感。低频(200–5000 Hz),阻力在初始附着和扩展阶段增加,经历一段缓慢增加的时期,然后上升到最终水平,这被认为是由于TJs的建立。相反,电容测量值对低频变化似乎相对不敏感,当移动到更高频率时,由于细胞附着/扩散而变得更敏感。与电阻相比,电容测量几乎不受细胞间连接形成的影响。这些数据表明,高频电容的变化很可能是由细胞附着、扩散和生长引起的,而低频电容的变化,如果与高频电容的变化不平行,则很可能是细胞间连接形成的结果。
细胞接种密度为7.5×104.-10.0×104. cells·well-1在30-50分钟后达到汇合点 h、 通过初始降低,然后高频电容稳定(图。 1b⇓),与抵抗相反。在前40小时内的细胞的初始扩散/附接期间,在低频电阻中只能观察到最小的增量(图1A⇓),并且在40-60至80小时之间稳定电容的标记增加可能反映了间细胞间接触的建立。为了确认在此期间的低频电阻增加是形成细胞间隙的反射,研究了接种后连接蛋白ZO-1和E-Cadherin的定位。如所预期的,在72小时后观察到ZO-1和e-Cadherin的连续圆周定位,而在24小时后,这些蛋白质的结仍然仍然裂片这些蛋白质的连接表达(图1C-F.⇓).
其密度为2.5×104.-5.0×104. cells·well-1, 60-80 h时达到融合,经目视显微镜分析证实(数据未显示);然而,正如低频电阻(图1a)所示,在本实验的时间范围内,细胞无法有效地形成紧密的细胞间连接⇑).因此,接种7.5×104. cells·well-1用于本手稿中所描述的所有进一步的实验。
e-cadherin介导的细胞 - 细胞接触形成和低频电阻
为了证实细胞间连接参与了16HBE14o-细胞低频阻抗的增加,我们监测了siRNA下调E-cadherin后的变化。在高频率(40khz)下的电容也被测量,这应该对细胞间接触的变化相对不敏感。E-cadherin表达在转染后第1天就已经有效下调,并且在实验过程中(≤72 h)保持下调(图2c)⇓). 低频电阻从24增加到60 对照细胞中的h(图。 2a⇓).用E-cadherin靶标分子转染的细胞显示出远不太明显的增加(图2A⇓).相反,高频电容测量不受E-Cadherin的下调的影响(图2B⇓),表明e -cadherin介导的连接缺失特别影响低频电阻测量。据报道,TJ密封是电阻的主要决定因素15,而可能需要先前形成AJ,以便适当组装TJS16.因此,我们分析了TJ蛋白ZO-1的表达,并在siRNA下调E-cadherin时观察到其表达水平降低(图2d)⇓).
为了找到进一步支持低频电阻对细胞间连接形成的敏感性,16hbe14 -单分子层Ca被清除2+,由于上皮结是完全加利福尼亚州2+端依赖。Ca2+剥夺导致低频电阻向裸露电极水平的显著降低(图2e)⇑).免疫荧光染色显示E-cadherin完全丧失了连接表达(图2f)⇑和g)。
16HBE14o-、BEAS-2B和H292细胞与PBECs的比较
研究不同类型人气道上皮细胞的特异性黏附特性是很有趣的,并且观察到明显的差异。与16HBE14o-细胞相比,BEAS-2B细胞在细胞间连接的形成方面效率相对较低,这反映在其电阻降低了10倍(图3a)⇓).相比之下,BEAS-2B细胞更迅速地建立了融合的单层细胞,在接种后3小时内电容显著下降(图3b)⇓).在稳定电容之后,低频电阻仅略微增加至最大值的〜2.5倍,相反,16HBE140-细胞的屏障紧密性的强劲增加。A549细胞显示出与BEA-2B细胞相似的特征,具有快速形成汇合层。在此之后,低频电阻进一步没有增加,表明初始增加仅是由于电极的覆盖率而发生,而不形成TJ(图3C⇓).NCI-H292细胞在建立细胞间隙时也效率低下(图3E⇓f),随着时间的推移,低频电阻缓慢而微弱地增加,这与高频电容的动力学一致。
在所有测试的细胞类型中,PBEC显示电容最快的初始初始减少,在2小时内达到最小值(图3H⇑).值得注意的是,在数值再次开始下降之前,这是一个暂时的增加(图3h)⇑).这些动态似乎是PBEC的特定标志,并且可能是由细胞形状的改变引起的,具有初始附着/展开,然后采用较小的细胞形状,例如准备扩散。在前48小时期间,主电池仅显示低频电阻的适度增加,与高频电容观察到的类似波动。在55-60小时(细胞是激素/生长因子剥夺)(图3G⇑),导致较初始值增加4 - 7倍(与16HBE14o细胞增加25倍)。最后,R.ep在ALI生长PBECs的测定中,由于PBECs可以分化成这些条件下极化粘膜纤毛上皮17,形成紧密的上皮屏障。使用ECIS测量在反式孔膜上生长的细胞的电阻是不可能的。因此,使用传统的Voltohmmeter。R.ep在ALI条件下生长的PBEC中显着增加,从151-190Ω·cm2淹没条件下汇合处最高可达560-784 Ω·cm2在粘蛋白分化后。16HBE14O-细胞,相反,建立R.ep高达672 - 1120 Ω·cm2(与60 - 100Ω·厘米2(数据未显示)使用ECIS电极)时浸没条件(EMEM / 10%FCS)下生长的测定,但没有进一步增加它们的屏障密封性也不分化成ALI条件下粘膜纤毛细胞。
结论,而PBECs坚持超过16 hbe14o -细胞和类似于A549和BEAS-2B细胞在这方面更密切,PBECs更类似的障碍闷16 hbe14o——细胞,但他们的屏障只有16 hbe14o变得一样紧——细胞当PBECs阿里条件下生长。
上皮连接的形成、表达和细胞粘附分子的定位
然后测试单个单层屏障功能的差异是否与连接蛋白的表达平行。与屏障紧密性一致,ZO-1的最高表达证实了16HBE14o-细胞形成细胞间连接的能力(图。 4a⇓),而在A549、NCI-H292细胞和PBECs(健康供体)中观察到ZO-1水平降低,而在BEAS-2B细胞中表达水平最低(图4a)⇓).E-cadherin在16HBE14o-、NCI-H292和原代细胞中高表达,尽管NCI-H292形成细胞间连接的能力较低。BEAS-2B和A549细胞表达低水平的E-cadherin(图4a)⇓).
为了验证ECIS系统是否可以是上皮细胞系的粘合特性的比较中的有用工具,研究了来自不同个体的上皮细胞。来自哮喘,COPD和健康受试者的PBEC中观察到类似水平的e-cadherin。相反,ZO-1的表达在哮喘上皮中显着降低(图4A⇑;代表三个独立的实验)。因此,可以观察到,与健康和COPD培养物相比,来自哮喘患者的上皮细胞的低频阻力最低(图4b)⇑;孤立的观察)。尽管可以在该实验中汲取哮喘的上皮阻隔功能没有结论,但是本数据表明ECIS是定量不同患者组之间的上皮阻挡性密封性的差异的有希望的工具。
由于NCI-H292细胞表达了相对较高水平的ZO-1,尽管其屏障功能较低,因此我们也对ZO-1和E-cadherin的定位进行了研究。ZO-1和E-cadherin在细胞间连接的连续周向定位是形成封闭连接的细胞的特征。正如所料,16HBE14o-细胞也观察到这种情况(图5a)⇓b)。相反,在NCI-H292细胞中,ZO-1和E-cadherin的表达片段化和不连续,这解释了形成紧密屏障的能力受损(图5d)⇓和e)。在BEA-2B细胞中,通过免疫染色几乎不能检测到E-Cadherin,尽管可以观察到ZO-1的微弱的细胞间表达(图5G⇓和h).这可能是BEAS-2B的屏障紧密度增加的原因与NCI-H292单层。E-Cadherin和ZO-1的定位在A549细胞中类似于NCI-H292细胞的表达模式(图5J⇓在PBECs中,虽然E-cadherin的膜表达不如16HBE14o细胞强烈,而且ZO-1并没有将相邻的细胞分开(图5m),但通过明确表达ZO-1和E-cadherin来判断,细胞间连接是存在的⇓和n)。
细胞骨骼肌动蛋白细丝中的动态被认为是细胞延伸,细胞外基质上的细胞延伸,扁平化和附着的驱动力18.BEAS-2B、A549与原代细胞在丝状肌动蛋白(F-actin)的细胞骨架组织上有显著差异与16HBE14O-和NCI-H292细胞。F-actin以PBECS和A549和BEA-2B细胞的应力纤维状图案组装,而其主要平行于16HBE14-和NCI-H292细胞(图4C)⇑,f,i,l和o)。通过高频率电容测量,这些差异可以与细胞扩散和附件的差分动力学相关联。
总之,E-钙粘蛋白、F-肌动蛋白,特别是细胞间连接处ZO-1表达的范围和连续性似乎与细胞的粘附特性相关。桌子 1.⇓综述了细胞系的粘附特性。
伤害时上皮屏障的迁移和恢复
为了表征的细胞迁移和在BEAS-2B和16HBE14o-细胞再生响应(其不同强烈在其细胞粘附特性),电场诱导的细胞死亡被施加和随后的形态伤口愈合反应监测。使用ECIS系统,高度可再现的伤口的程度仅限于小的250微米电极,导致电池几乎完全分离电池19,通过在脱离死区后通过显微镜确认(图6E⇓).这是伴随着一个戏剧性的下降R.ep以及相应的电容增加(图6a)⇓和c)。2以内 h、 细胞再次开始在电极上扩散和迁移(图。 6f⇓),导致电容减小(图6C⇓)和电阻增加(图6a⇓).通过高频电容测量,16HBE14o- cell在2 h内完全覆盖电极。从单层融合重建开始,低频电阻继续向初始值缓慢增加,表明细胞间连接重建(图6a)⇓).相比之下,一旦电容稳定,就没有进一步增加了低频电阻的进一步增加,这比16hbe14 - 细胞长3〜2小时(图6B⇓和d)。这表明上皮电阻的增加仅仅是由于电极的重新填充,并且BEAS-2B细胞无法在这种类型的损伤后恢复其TJ。因此,BEAS-2B和16HBE14o-细胞粘附特性的差异反映在它们的伤口愈合反应中。
讨论
本研究表明,ECIS系统是用于在生长和修复期间监测气道上皮细胞中细胞粘附的各个方面的多功能工具。测量R.ep是一种有用的渗透性测定方法的替代品,但由于溶质的扩散可能存在困难。此外,ECIS的一个主要优点是可以在不同频率下进行无创实时测量。这表明,高频电容主要在初始细胞扩散和附着时发生变化,但对细胞间连接的变化几乎不敏感。后者是最敏感的测量电阻在一个低频率,使区分细胞间和细胞基质接触。
不同气道上皮细胞黏附特性存在较大差异,这可能与ZO-1和E-cadherin的表达和/或定位有关(表1)⇑).虽然A549、BEAS-2B和原代细胞的扩散/附着速度较快,但当达到汇合时,16HBE14o-细胞构成的屏障紧密度最大。PBECs表现出适度的TJs和AJs的形成,这可以通过ZO-1和E-cadherin的连接表达体现出来。目前的研究结果进一步表明,ZO-1在紧密上皮屏障的形成中比E-cadherin更重要的决定因素。哮喘中上皮屏障形成减少的孤立观察与健康的上皮细胞与ZO-1的表达减少一致,其他人也观察到这一点2那3..我们将在未来的研究中进一步研究哮喘患者的屏障功能。
BEAS-2B、A549和原代细胞附着速度更快与16HBE14o-和NCI-H292细胞可能是由于肌动蛋白丝组织动力学的差异,这被认为有助于细胞扩散/附着反应18.事实上,尽管F-actin在16HBE14o-和NCI-H292细胞中显示皮质定位,但在PBECs和BEAS-2B细胞中观察到应激纤维。除了其附着功能外,f -肌动蛋白细胞骨架被认为是调节细胞运动的20.BEAS-2B细胞对损伤的迁移反应比16HBE14o-细胞慢,表明在BEAS-2B细胞中观察到的f -肌动蛋白排列更有利于细胞附着而非细胞运动。
使用ECIS进行伤口,电池仅需要迁移,但不增殖,以重新填充电极,因为电极相对较小。与刮伤缠绕法相比,这不仅可以获得更相关但更精确的迁移响应的研究,其中在24小时内发生增殖和迁移以关闭相对大的伤口。在活的有机体内,细胞外基质的相互作用和重塑在伤口修复期间在上皮细胞迁移,增殖和恢复中起着核心作用。这应该记住翻译到体内情况。然而,气道上皮的完全再生需要重建细胞间的接触。ECIS测量表明,这一点得到了很好的反映,因为16HBE14o-单层的再生涉及屏障的迁移和重建。相反,正如其低频电阻所预期的那样,BEAS-2B细胞在受伤后重建细胞间接触方面效率低下。
总之,为上皮细胞类型在气道上皮屏障功能研究中的不同应用提供了提示性证据。BEAS-2B和A549细胞的使用可能在细胞附着机制的研究中具有较高的翻译价值。然而,BEAS-2B、A549和NCI-H292细胞系的功能性TJ缺陷妨碍了它们在上皮屏障形成研究中的应用。16HBE14o-细胞可作为研究支气管上皮在屏障功能、细胞-细胞接触形成、通透性、上皮-间质转化和损伤后细胞间连接重建方面行为的合适模型。
支持声明
该研究得到了荷兰哮喘基金会(雷斯登,荷兰)和Glaxosmithkline的荷兰哮喘基金会的第3.2.05.039号赠款。
兴趣表
有关这项研究的兴趣声明可在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl.
- 收到了2009年4月21日。
- 公认2009年9月1日。
- ©ers Journals Ltd