抽象
肺癌化疗患者预后差。基质金属蛋白酶(MMP)基因中的单核苷酸多态性(SNPs)可通过改变凋亡途径影响治疗结果。6个基因中8个已知或怀疑表型效应的snp (MMP1,MMP2,MMP3,MMP7,MMP9和MMP12)进行了调查。
对于349高加索例原发性肺癌,接收一线化疗,三个不同的端点进行了分析:第二周期之后响应,无进展存活(PFS)和总生存率(OS)。
使用多个逻辑回归对所有病人和histology-,阶段 - 和治疗相关 - 的亚组分析的SNP的预测价值。采用Cox回归方法计算危险比率估计PFS和OS。
所有被调查的多态性在整个患者群体中都没有显著地改变反应。
然而,肿瘤阶段IIIB变体等位基因携带者MMP2 C-735T表现出显著恶化的反应。PFS在被显著延长MMP1 g - 1607 gg变异等位基因携带者和OS在小细胞肺癌患者中携带MMP12 - 82 g变异等位基因。
综上所述,本研究在MMP1,MMP2,MMP7和MMP12为进一步研究肺癌患者化疗结果的可能预测因素。
随着约135万确诊,每年新发病例,肺癌是最常见的癌症全世界1。这是主要的发病率和预后不良续传的疾病。虽然早期非小细胞肺癌(NSCLC)可以采用手术治疗,晚期非小细胞肺癌和小细胞肺癌(SCLC)的情况下接受化疗作为选择的治疗2。多态性,其减少或抑制细胞凋亡,可引起化疗耐药3.。队列研究,以便用于在宿主基因组生物标志物之间的相关性阐发,显示出相关的病人的结果,和治疗反应。
基质金属蛋白酶(MMP)的表达与多种疾病尤其是各种恶性肿瘤的发生发展密切相关。他们参与促进转移,癌症的化疗耐药和不良的治疗结果已经在以前的研究中被证明4,5。
MMPs的高表达通常与癌症发生和发展的所有阶段相关。MMP3、MMP7和MMP9也被报道影响Fas/ fasl介导的外源性凋亡通路,以及p53/PKC介导的内源性凋亡通路6,7。通过纤溶酶原和XVIII胶原的裂解,MMP12是血管生成抑制剂血管抑制素和内皮抑制素的最有效的产生者之一8。此外,它还会影响纤溶酶的水平和MMPs(如MMP3和MMP9)的后续激活9。MMP2,也称为明胶酶A,是参与迁移和侵入的过程和也似乎对化疗反应的影响。它已被证明在大鼠模型,基于铂的化疗具有更高的响应率,当动物共同处理与普啉司他,具体的抑制MMP210。MMP1是高表达的间质胶原酶,降解纤维胶原。肿瘤组织中MMP1的过表达被认为与肿瘤的侵袭和转移有关11。
多态性在MMP的基因已被证明会影响蛋白质的表达模式。的启动子区域的一个多态性MMP2(c - 735 t)被报道由于sp1结合位点的破坏而导致该蛋白的低表达12。据,直到...为止MMP3, ins/del多态性的变异等位基因(6 - 1171 5)与较高的转录速率相关13。对于MMP7,两个单核苷酸多态性(SNP)(C-153T和A-181G)在功能上,其特征在于,在两种情况下,变体等位基因导致的增强的表达14。另一个SNP在MMP9基因(c - 1562 t)通过阻断抑制因子结合位点来增加转录12。在多态性MMP12基因(- 82 g;A1082G)也被证明会影响癌症患者的预后。启动子多态性通过破坏ap1结合位点来降低转录15,而多态性A1082G尚未被证明有表型效应。功能的GG等位基因MMP1 g - 1607 gg多态性与MMP1的更高的表达水平,并与易感性增加头颈部癌和肺癌相关联16,17。
本研究着重于在MMP基因的多态性和三个定义的临床结果的端点之间的关系:1)整体响应率(ORR),以第二周期之后化疗;2)总生存率(OS);和3)无进展存活(PFS)。我们假设,遗传背景,如gDNA的多态性会影响治疗结果。我们也认为这样的背景下,对早期的端点,如ORR一个更为直接的影响,比临床上更相关的后期终端,操作系统和PFS,由于克隆选择遗传变异的肿瘤特异性积累在治疗的许多周期。
6个snp中有8个MMP的基因的349名肺癌患者队列进行分析,其中包括187 NSCLC,SCLC 161和一个患者的具有混合组织学,接受一线化疗。
患者和方法
研究群体
1999年3月至2004年10月在海德堡的Thoraxklinik医院招募了349例经组织学证实的原发性肺癌患者,这些患者均有资格接受一线化疗。随访的截止日期为2005年3月。所有患者从未接受过抗肿瘤化疗,也从未被诊断为其他恶性肿瘤。在可能的情况下,根据国际癌症控制联盟的临床肿瘤、淋巴结、转移(cTNM)确定诊断时的肿瘤分期18使用医院的记录。对于一些SCLC患者的基础上,退伍军人管理局肺癌研究组标准的肿瘤分期被列为限制或广泛的疾病19。在统计学分析中,局限期和广泛性疾病分别被认为是III期和IV期(表1)⇓)。
根据RECIST(实体肿瘤反应评估标准),在第2周期一线化疗后评估肿瘤反应为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定疾病(SD)或进展性疾病(PD)。20。无进展存活(PFS)被定义为化学疗法的开始和记录进展(未经审查观察)之间的时间间隔(以天计)。如果没有进展被记录在案,PFS计算,直到不论该病人是否丢失的跟进或以后是否发生死亡的最后一个无进展审查(审查观察)。OS定义为化疗开始至死亡(未经审查观察),或者当死亡日期是未知的,最后的日期时,病人还活着(审查观察)的记录日期之间的时间间隔(天)。
60% of the 187 NSCLC cases died during the observation period, the median OS time was 410 days (95% CI 353–514). The median PFS time was 216 days (95% CI 189–251), and the median observation time was 812 days (95% CI 499–1120). 63% of the 161 SCLC patients died during observation, the median OS time was 405 days (95% CI 347–557). The median PFS time was 271 days (95% CI 239–314), and the median observation time was 777 days (95% CI 648–838). All participants signed informed consent forms and most study subjects completed a self-administered questionnaire with detailed information on pre-treatment, smoking habits and occupational exposure. The study was approved by the ethical committee of the Medical Faculty of the University of Heidelberg (Heidelberg, Germany) (Ref.-Nr.199/2001). Blood samples were collected prior to chemotherapy.
DNA提取
EDTA中5ml静脉血中的Buffy被归档于-80°C。基因组DNA的分离使用QIAamp DNA blood midi试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany),或根据制造商的说明使用MagNA Pure System (Roche, Basel, Switzerland)上的自动DNA提取协议。
基因分型
对于检测多态性MMP3 6A-1171 5A,MMP12 A-82G和MMP12 A1082G设计了基于荧光的熔融曲线分析方法(LightCycler480)(见表2)⇓)。每个PCR与最后一卷10μL执行96 -孔板(罗氏,曼海姆,德国)∼20 ng的基因组DNA为模板。在95°C的初始孵育2分钟后,进行45个后续循环,95°C 5 s, 56°C退火10 s, 72°C延伸15 s。浓度为多元反应的MMP12 - 82 g和MMP12 A1082Ggenotyping were 1× PCR Buffer, 5 mM MgCl2,200 μM dNTPs, 0.5 U Qiagen Polymerase, 0.7 μM forward primer (- 82 g),0.2μM反向引物(a - 820.1 G),μM正向引物(A1082G),0.7μM反向引物(A1082G0.2)和四探针μM。浓度为MMP36 - 1171 5一个0.1μM向前引物pcr和0.5μM反向引物,2.5毫米MgCl2,200年1×PCR缓冲μM核苷酸,0.5 U Taq(英国Eurolone)和两个探针0.2μM每个。所有的引物和探针(TIB MOLBIOL, Berlin, Germany)详见表2⇓。
对于LightCycler480方法的验证和质量控制,PCR限制性片段长度多态性(RFLP)是为进行MMP12 - 82 g21。另一个PCR-RFLP分析,MMP12A1082G新开发和实施总量的20μL 400海里的每个引物(正向引物5′-GATGACAAATACTGGTTAATTAGGA-3′;反向引物5′-CTGGTTATCTACAAAGAAGT-3′), 200μM核苷酸,1×PCR缓冲,0.8 U taq和5毫米镁。循环条件如下:最初在95°C变性3分钟之后35周期94°C的变性30年代,退火30年代在59°C, 72°C伸长了30年代的温度转变速率每秒20°C和最终伸长步骤2分钟的72°C。结果进行了比较,至少200个样本,并显示100%的一致性。所有基因分型均在数据分析前进行盲法。10%样品进行两次基因分型质量控制,结果无差异。采用以前发表的PCR-RFLP方法MMP1 g - 1607 gg,MMP3 6 - 1171 5,MMP2 C-735T,MMP9 C-1562T,MMP7 C-153T和MMP7 - 181 g12,14,17,22。
位于11号染色体上的长臂的多态性连锁分析是使用HAPReg软件计算。单倍型和单倍型的效果评价Logistic回归的计算是用Thesias软件进行23。
统计分析
的等位基因频率和它们的组的所有患者的标准偏差分别计算和基因型分布从使用卡方检验Hardy-Weinberg平衡(HWE)的偏差进行测试。采用多因素Logistic回归分析的SNP的预测价值。胜算比通过在应答者(CR和PR)和一线化疗的第二周期之后的非应答者(SD和PD)比较基因型频率计算。
95%置信区间的危险比(HR)估计值是使用Cox比例危险模型对PFS(根据肿瘤分期调整)和OS(根据肿瘤分期和性别调整)进行计算的。绘制Kaplan-Meier生存曲线,使用log-rank检验检验PFS和OS的差异。在单因素分析中,肿瘤分期对NSCLC患者第二周期后的反应(p = 0.0012)和本研究中所有肺癌患者的PFS和OS均有统计学意义(p<0.001)。因此,我们在所有的分析中都将阶段作为调整因素。性别对所有肺癌患者OS有显著影响(p = 0.044),但对PFS无显著影响(p = 0.982),对化疗反应无显著影响。因此,它只作为OS的调整因子。年龄对三种临床结果均无显著影响(反应p = 0.59, OS p = 0.88, PFS p = 0.82)。ECOG测量的性能状态(响应p = 0.61, OS p = 0.81, PFS p = 0.13)也观察到相同的结果。因此,这两个参数都没有被用作混杂因素。
所有349名肺癌患者进行了这种分析。此外,它是为SCLC和NSCLC的两个组织学亚群分别进行。野生型基因型被认为是作为参考。我们分析为基础的治疗,子集包括:接收吉西他滨的患者(143;所有的非小细胞肺癌),依托泊苷(161; 158 SCLC,NSCLC 2和1的混合)和基于铂的治疗(256; 117 SCLC和139 NSCLC)。另外,我们分析了早发(IIB + IIIA)和晚期(IIIB + IV)患者以及IIIB和IV分别在组织学亚组。
采用国际亥姆霍兹礼俗的网站进行了计算等位基因频率24。所有其他计算均使用SAS 9.1.3版统计软件包(SAS研究所,Cary, NC, USA)进行。
结果
本研究共纳入349例接受一线化疗的肺癌患者。我们分析了三个不同的终点:第2个周期(R)后的反应、PFS和OS,每个终点代表整个患者组,以及两个亚组,SCLC和NSCLC。
所分析的SNPs基因型分布如表3所示⇓。对于所有SNP,基因型的分布Hardy-Weinberg平衡中(MMP1 g - 1607 ggp = 0.65;MMP2 C-735Tp = 0.57;MMP3 6A-11715Ap = 0.39;MMP7 C-153Tp = 0.11;A-181Gp = 0.18;MMP9 C-1562Tp = 0.71;MMP12 - 82 gp = 0.97; andA1082Gp = 0.99). The calculated frequencies of the wild-type alleles wereMMP2 C-735T0.88±0.015,MMP3 6A-11715A0.49±0.024,MMP7 C-153T0.93±0.012,A-181G0.46±0.022,MMP9 C-1562T0.86±0.016,MMP12 - 82 g0.85±0.017,A1082G0.93±0.012。这些频率可比以前由其他组公布了这些白种人5,12- - - - - -14。
虽然SCLC,化疗是首选各阶段的治疗,早期NSCLC患者优先手术治疗。This is reflected in table 1⇑与非小细胞肺癌患者相比,SCLC患者的反应率也高得多。
优势比及其95%置信区间描述了多变量分析后变等位基因携带者无应答的风险,如表3所示⇑。
在所有肺癌患者组中,所有检测到的多态性均未显著改变第二周期后的化疗反应;仅观察到临界显著效应MMP7C-153T多态性(OR 1.79, 95% CI 0.99–3.20; p = 0.05). Among stage IIIB patients, the risk of being a nonresponder was significantly increased in the aggregated groups of variant allele homozygotes and heterozygotes forMMP2c - 735 t(OR 2.79, 95% CI 1.06–7.41; p = 0.02) andMMP36 - 1171 5(OR 10.37, 95% CI 1.32-81.46;(p = 0.01)(表3⇑)。
,作为一个无应答的提高风险还发现了IIB-IIIA患者中SCLC队列携带MMP2C-735T多态性(OR 12.75, 95% CI 1.39-167.39;p = 0.03),以及IIIB期NSCLC患者携带该基因的变异等位基因MMP36 - 1171 5多态性(OR 7.78, 95% CI 1.35–147.84; p = 0.03) (tables 4⇓和5⇓)。
PFS是显著影响组NSCLC患者,谁收到吉西他滨作为一线化疗药物的并的变异等位基因携带者MMP12A1082G多态性(HR 1.88, 95% CI 1.02–3.46; p = 0.04). Individuals with the variant genotype ofMMP9c - 1562 t在整个队列的晚期患者中(HR 1.36, 95% CI 1.00-1.84;p = 0.05,数据未见)及中晚期SCLC患者(调整HR 1.72, 95% CI 1.02-2.89;p = 0.04)(表6⇓与野生型相比,PFS明显缩短。描述所有患者无进展生存期的Kaplan-Meier曲线也显示出显著的调节MMP9多态性(图。1⇓)。在整个队列中携带GG等位基因的个体MMP1 g - 1607 gg与参考基因型携带者相比,等位基因的PFS明显更长(HR 0.72, 95% CI 0.55-0.95;p = 0.04),早期SCLC的PFS和OS较长(表6)⇓和7⇓)。
讨论
治疗的肺癌治疗的治疗的选择是目前依赖阶段,组织学和患者的性能状态。鉴于有一些化疗的,这会影响治疗的成功,应考虑到宿主遗传多态性选择。因为它是因为只需要血液样品的快速,可靠和微创手术疗法之前的基因分型是可行的。量身定制的治疗可提高患者生存率和生活质量,因此对未来非常可取的。
因此,我们进行基因分型等五种基质金属蛋白酶基因多态性7在假设驱动的方法,分析其对三个端点的影响:第二个周期,PFS和OS化疗后的反应。在小细胞肺癌和非小细胞肺癌的应答率是众所周知的强烈不同,也依赖于接受治疗。因此,我们对于分层组织学,治疗协议和阶段数据。阶段已显示与MMP表达强烈相关。
本研究的特别之处在于对化疗反应、PFS和OS这三个终点的分析。对于SCLC和NSCLC的单独分析,这些数据是足够的。本研究的一大局限是缺乏足够的样本数量在阶段亚组。这可以通过以下事实来说明:由于无应答组中缺乏野生型携带者,SCLC队列中某些or和HRs对于MMP3多态性是不可计算的。小样本量的分期亚组也导致了一些不一致的结果之间的整个队列和组织学亚组;例如MMP2变异等位基因携带者的化疗反应的无显著性点估计在非小细胞肺癌IIIA期患者中具有保护作用,但与所有IIB期、IIIA期和IIIB期患者无反应的显著风险相关。然而,在不同的子组中,一些影响即使不是显著的,也是一致的。
MMP1 g - 1607 gg变异等位基因携带者比个人纯合子G等位基因较长的PFS。该结果不与该假说认为,GG等位基因,代表更高MMP1表达,具有治疗过程中和之后端点有害影响的一致性。我们观察到,在整个人群,尤其是在早期阶段SCLC一个显著的保护作用。该结果在优选较大的组群的进一步研究,以进行验证。
的变异等位基因MMP2在IIIB和SCLC早期患者较差的响应和变异等位基因显著相关因素MMP3相关因素显著,与IIIB患者,尤其是NSCLC较差响应,但不是第四阶段的患者的化疗的第二个周期之后。
关于MMP2,结果不反映T等位基因,这是预期会导致低表达的假设的益处。这是不符合刘et al。10,其中大鼠与普啉司他,特定MMP2抑制剂组合基于铂的治疗,有较高的响应。为什么这种影响在logistic回归分析看到的是不明确的,应当在其他研究中得到证实。
为MMP3和MMP7的显著结果表明大的置信区间,这意味着作用大小的点估计是精确的要少得多。然而,他们是按照由Blons出版物et al。6提示通过改变MMP3表达来调节化疗反应。其原因可能是Fas配体从细胞表面被增强裂解MMP7和MMP325,从而抑制外源性凋亡途径的。
一个可能的解释为什么这种影响,在这种情况下MMP7C-153T多态性仅在早期患者中观察到,治疗结果的基因型依赖性调节预期在广泛转移前更强。众所周知,MMP3和MMP7都参与了转移。在已经发生转移的IV期患者中,存在其他非特异性的耐药机制MMP3和MMP7可能对化疗第二周期后的反应更重要。本研究的结果表明,在早期肺癌治疗方案中存在一种基因型特异性调节,这需要在进一步的药物遗传学研究中加以证实。
Kaplan-Meier对所有肺癌患者的评估显示,位于启动子区域的T等位基因具有显著的有害作用MMP9和代表高表达26,在无进展生存。这与之前的文献一致,文献显示MMP9的高表达与转移和患者预后相关。然而,这一结果不能被相应的危险比所证实MMP9 C-1562T分析。
的MMP7 - 181 g多态性没有表现出协同效应C-153Tlogistic回归。携带变异SCLC患者等位基因甚至开始化疗后具有更长的寿命。这是不符合的假设,这两个基因多态性对转录类似的效果14。然而,单倍型分析显示GT单倍型的有害影响,这是由于高表达等位基因的组合。其原因尚不清楚,需要进一步的研究来验证这一结果。
由于MMP12的抗血管生成功能27据预测,假设低表达的G等位基因对总生存期和无进展生存期有有害影响。我们的数据无法证实这一点。相比之下,在分析SCLC患者的总体生存期时,显示出明显的保护倾向。
低表达水平也代表更高的纤溶酶水平和在MMP3依赖性方式MMP9的更高从而活化率,这可能会促进肿瘤的生长和缩短PFS和存活28。一些研究表明MMP12表达的各种癌症有益8,29。然而,也有研究表明,MMP12高表达的NSCLC患者复发较早三十。一种用于这种效果的原因可能是有高的MMP12的表达之间的联系,特别是在肺中的巨噬细胞31,COPD,炎症和癌症进展32- - - - - -34而较低的表达指示患者一个更好的结果。这也将预示尤其是男性,其中慢性阻塞性肺病的情况下,更频繁地出现组织的依赖。
外显子基因多态性的功能MMP12目前仍不清楚,但在本研究中,它与接受吉西他滨化疗的NSCLC患者预后不良有关。对这种效应的解释仍是推测性的,但血凝蛋白样结构域氨基酸序列的改变可能改变其亲和性或特异性。
当然,总体生存和PFS是其中最具临床相关参数。然而,从长远来看,它衡量化疗反应基因型的影响研究可以,如果结果是由较大的独立研究证实同伙,有助于更好的治疗方案。据我们所知,这是对MMP和第一药理学研究肺癌是与早期肿瘤反应的评估肿瘤进展和患者生存率的互补分析。结果优先MMP1,MMP2,MMP7,MMP9和MMP12作为候选基因进行进一步研究化疗对肺癌患者的临床结果的可能预测。
支持声明
这项工作在一定程度上得到了德国Krebsforschungszentrum (DKFZ)癌症研究合作项目、“德意志Krebshilfe”和“德国Krebsforschung e. V.”协会的支持。
感兴趣的语句
无声明。
致谢
作者感谢Thoraxklinik GmbH(德国海德堡)的所有患者和工作人员,是他们使这项研究成为可能。他们也感谢那些参与样品和/或数据收集和归档,o . Landt编著(TIB的MOLBIOL,柏林,德国)协助LightCycler探针设计,r . Rausch(部门生物统计学,德国癌症研究中心,海德堡)协助统计分析以及m . Timofeeva和l . Knoefel(这两个部门的表观基因组学和癌症风险因素,德国癌症研究中心,海德堡)有价值的讨论。
- 收到了2008年8月14日。
- 接受2009年7月13日。
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