文摘
他汀类药物提出了一个潜在的治疗肺动脉高血压。如果引入临床实践,他汀类药物会与现有的疗法结合使用。我们调查的影响,结合辛伐他汀和5型磷酸二酯酶抑制剂,西地那非,低氧诱导的肺动脉高压大鼠模型。
老鼠被分配到:1)一个预防协议,接受辛伐他汀20毫克公斤−1·天−1腹腔内注射或西地那非75毫克公斤−1·天−1口头或组合(或车辆)2周开始在暴露于低氧(10%灵感氧气);或2)治疗协议,同样的特工被管理在过去2周的四周时间的缺氧。
在这两种协议,西地那非和辛伐他汀会大大降低肺动脉压力,产生了更大的减少右心室肥大和肺血管muscularisation比药物。此外,结合显著增强内皮一氧化氮合酶表达与肺癌和右心室的cGMP水平以上,由药物RhoA活动的独立和导致更大的抑制作用。
这些数据表明,辛伐他汀能有效结合西地那非治疗肺动脉高血压达到更大的治疗效果。
的多效性的影响有相当大的兴趣3-hydroxy-3-methylglutaryl辅酶A (HMG - CoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)心血管系统以外的福利应计单从降低胆固醇。这种兴趣延伸到肺动脉高压(PAH)1,2。而多环芳烃的治疗方案,特别是特发性多环芳烃,近年来有所改善,与许可批准授予两种口服药物,磷酸二酯酶5型(PDE5抑制剂)和内皮素受体拮抗剂,除了前列腺素类、多环芳烃的前景最为严峻的形式仍然是穷人3,4。新的治疗方法是必需的。
原则上,他汀类药物可能有益影响的过程中多环芳烃的水平。这些包括改善或恢复血管内皮功能、抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,和减少血管炎症和氧化应激5- - - - - -7。此外,他汀类药物的影响并不局限于脉管系统。最近的动物和人类的研究表明,这些药物也可能直接有益对心肌的影响6。他汀类药物已报告减少心肌质量和纤维化,增加毛细血管网络密度和减弱过分生长的电不稳定的心8。
他汀类药物的多效性的影响主要取决于,在抑制类异戊二烯的合成中间体farnesylpyrophosphate geranylgeranylpyrophosphate,翻译后isoprenylation必不可少的,膜的本地化和激活Ras和ρ小GTP-binding蛋白质分别家庭。这些gtpase调节许多细胞功能和一些膜生长因子受体细胞内途径影响细胞增殖6,7,9。RhoA及其下游中介Rho-kinase PAH的治疗已成为一个有吸引力的目标2,7。Rho-kinase抑制剂,如fasudil、抑制肺动脉高压的发展实验模型7。有趣的是,营地,cGMP-dependent蛋白激酶有关键的作用在调节ρ在血管平滑肌细胞激活和表达10,11。抑制RhoA / Rho-kinase信号通路可能的贡献,因此,建立治疗的有益作用,如PDE5抑制剂西地那非,在肺动脉高压的治疗12,13。
他汀类药物减弱肺动脉高压的发展实验动物模型14- - - - - -18已报告和逆转肺动脉高压和血管重塑,诱导通过肺切除术和野百合碱治疗19或慢性缺氧20.。这似乎是通过增加细胞凋亡以及减少平滑肌细胞的增殖阻塞性血管病变17,19。影响骨骨髓来源的动员和自导progentor细胞也被提出21。因此,他汀类药物已成为有吸引力的潜在的治疗多环芳烃。最近的一次不受控制的观察研究表明,辛伐他汀是不同类型的肺动脉高压患者的耐受性良好,但还不清楚是否改善他们的条件可以归因于药物治疗22。
如果他汀类药物治疗在PAH的治疗作用,它将用于建立结合治疗,而不是作为一个唯一的疗法。因此,我们审查的影响结合辛伐他汀与共同的首选治疗PAH,西地那非,在大鼠低氧诱导肺动脉高压。具体地说,我们研究了这种组合的影响肺动脉压(P巴勒斯坦权力机构),右心室肥大(RVH)和肺血管重塑。此外,我们探讨任何相互作用的可能机制通过内皮一氧化氮合酶(以挪士)cgmp RhoA信号通路。
方法
动物和实验设计
男性Sprague-Dawley老鼠(280 - 400 g)从查尔斯河(马尔盖特、英国)是用于所有实验。所有研究依照英国内政部进行动物(科学程序)法案1986(英国伦敦)。
动物被分成4组(每组6到8)为每个协议:1)normoxia控制;2)缺氧控制(腹腔内车辆盐0.2毫升·老鼠−1·天−1);3)缺氧+辛伐他汀20毫克公斤−1·天−1i.p。14;4)缺氧·加西地那非75毫克公斤−1·天−1(饮用水中);5)缺氧+辛伐他汀和西地那非的组合。每隔一天动物体重和治疗剂量计算通过使用最新的平均身体重量。注射是在大约相同的时间每一天。西地那非剂量监测了每天喝瓶称重,并在必要时调整浓度维持剂量。所有的动物都有免费的食物和水,暴露在一个正常的12 h / 12 h光/暗周期。
老鼠被暴露于慢性缺氧10%氧气normobaric室如前所述23。两个不同的协议了。在一个,预防研究协议,动物被预处理的2天,治疗期间继续2周的缺氧。其他的治疗研究协议,动物暴露在缺氧4周,治疗2周后开始缺氧暴露。
血液动力学的测量
在实验结束时,动物称重和犀牛(Hypnorm 0.25毫升·kg−1;咪达唑仑·25毫克公斤−1i.p。)。P巴勒斯坦权力机构测量通过通过正确的颈静脉pre-curved导管插入,通过右心室肺动脉。系统性血压(SBP)是通过测量颈动脉插管。这些充满液体的导管连接到PowerLab压力传感器的数据采集系统(Chalgrove ADInstruments有限公司、英国)和压力测量记录从稳定的轮廓。
牺牲后,等离子体收集,心是收获和心室室仔细解剖和体重。RVH从右心室的比例来评估左心室,加上隔质量。正确的肺在液氮快速冻结和储存在-80°C生化测量下面几节详细讨论。左肺受到通货膨胀10%福尔马林固定在磷酸盐,嵌入在石蜡和组织学切片。
组织学分析
组织学评估血管重塑了如前所述24。横向肺部分染色使用范Gieson弹性的方法。船只的比例< 100μm直径双弹性薄片占领> 50%的周长,量化每个动物在两个独立的部分,表示为一个百分比的总血管数(每分肌血管)。计数进行盲目的治疗的大鼠部分是派生的。
以挪士免疫印迹
肺被单一化提取缓冲(50毫米Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,0.1% SDS, 0.5%钠脱氧胆酸盐,1% non-idet p 40, PMSF 1毫米,1毫米二硫苏糖醇,蛋白酶抑制剂)。等量的蛋白质溶解产物(15μg)是解决使用sds - page和转移到硝化纤维素膜(止动剂™- p;微孔,沃特福德,英国)。膜是孵化与纯化小鼠单克隆抗体对人类以挪士氨基酸1025 - 1203(英国有限公司正欲BD诊断,牛津大学,英国)稀释(1:1,000)6%的脱脂牛奶PBS-Tween (PBS, 0.1%渐变20)一夜之间在4°C。洗后(6×10分钟),他们孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体稀释(1:20,000)6%的脱脂牛奶在室温下PBS-Tween 1 h。然后他们被呈现再次洗和蛋白质化学发光(SuperSignal;皮尔斯,英国Cramlington)。光密度测量个人的乐队。以挪士表达正常化为肺癌和β-actinα-actin右心室。给出的数据是按分常氧控制值的意思。
测量RhoA表达式和活动
内生的affinity-precipitation测定GTP-loaded(积极)ρ通常被认为是一个可靠的活性蛋白质含量的测定,测定反映组织RhoA活动。GTP-loaded RhoA水平测定谷胱甘肽重组年代-transferase-rhotekin Rho-binding域(GST-RBD)绑定到谷胱甘肽珠子(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典),如前所述25。肺癌和右心室的碎片被单一化,悬浮在冰冷的裂解缓冲和旋转去除细胞碎片。制备溶菌作用的详细协议/洗缓冲区用于ρ拉化验北部生物技术,提供的是英国沃特福德(ρ激活试验装备)。100μg GST-RBD添加到上层的孵化和旋转60分钟在4°C。珠子被离心收集,清洗三次裂解/洗缓冲区,和affinity-precipitated RhoA被西方墨点法解决通过sds - page和检测。小鼠单克隆抗体anti-RhoA(圣克鲁斯生物技术,温布利,英国)是用于稀释1:1,000和一只山羊多克隆anti-mouse免疫球蛋白G HRP-labelled抗体(Dako、伊利、英国)下。GTP-RhoA表达水平正常化总RhoA蛋白表达水平,提出了按分意味着normoxia控制的价值观。
cGMP测量
肺癌和右心室组织样本单一化在寒冷的6%(重量/体积)三氯乙酸2 - 8°C包含IBMX(2.5毫米)。离心后,上清液与水饱和乙醚洗了四次。水提取lyophilised。干提取物被再溶解在分析缓冲区和cGMP水平衡量cGMP Enzymeimmunoassay Biotrak (EIA)系统(通用电气医疗集团,Amersham,英国)根据制造商的指示。
统计数据
数据表示为均值±扫描电镜个人的价值观。数据分析使用单向方差分析,其次是土耳其的多重比较检验或未配对t检验,两组之间建立个人组的差异。统计学意义是在p < 0.05。
结果
增加一个类似的意思P巴勒斯坦权力机构观察缺氧暴露4周后,符合我们之前的经验,最大的效果是在2周左右23。西地那非治疗,结合生产的辛伐他汀显著降低但辛伐他汀单独影响很小(图1 b⇑;表1⇑)。没有显著的影响出现在SBP在研究协议(图1 c⇑和d)。
对血细胞压积的影响
缺氧暴露2和4周诱导显著增加血球容积计(56±3%和69±2%;p < 0.001),而与normoxia控制(40±1%)。与辛伐他汀治疗,但不是西地那非,与低氧诱导的减少polycythaemia(表1所示⇑)。
讨论
当前PAH的治疗方法是将药物从不同的类实现的期望更大的治疗中获益。这项研究提供了令人信服的证据表明,西地那非的组合和辛伐他汀治疗的潜力。在老鼠模型中使用所有药物疗法的临床前评估批准PAH迄今为止,辛伐他汀和西地那非,是否在2周后开始接触缺氧或低氧诱导的肺动脉高压,与RVH的减少和肺血管重塑大于单独用药或。肺循环的组合也表现出特异性。此外,这些反应都伴随着更明显增加肺癌和右心室以挪士表达和cGMP水平和更大的减少GTP-RhoA水平(RhoA激活蛋白的标记),这些组织:生化效果符合已知的PDE5行动和HMG - CoA还原酶抑制。
辛伐他汀已被调查的不同实验模型的肺动脉高压。Girgis和同事14,20.显示之前,辛伐他汀(20 mg·公斤−1·天−1)预防和退化低氧诱导肺动脉高压,RVH在老鼠和血管重塑。Nishimura和同事17,19报道称,辛伐他汀·2毫克公斤−1·天−1口服预防和逆转肺动脉高压和neointima形成和改善生存在一个具有挑战性的肺动脉高压大鼠模型是由野百合碱诱导和肺切除术。最近,马克穆特et al。26发现辛伐他汀(2 mg·公斤−1·天−1强饲法)更少的令人印象深刻的野百合碱模型,制动肺动脉高压和RVH的发展4周,但不影响生存。Taraseviciene-Stewartet al。27报道,辛伐他汀(10 mg·公斤吗−1·天−1强饲法)导致积极的显著改善增殖形成严重的肺动脉高压引起的慢性血管内皮生长因子受体封锁(SU5416)结合慢性缺氧。在我们的研究中使用的剂量的辛伐他汀在先前的研究中使用的范围的高端。尽管如此,单独使用,我们观察到适度下降P巴勒斯坦权力机构和低氧诱导polycythaemia相比之下,这些报告14,20.。上有一个显著影响RVH和血管重塑,虽然它不是完全逆转。可能缺乏的影响P巴勒斯坦权力机构被降低肺血管阻力和改善心输出量,但在这项研究没有测量。
辛伐他汀对RVH的影响更加突出和血管结构相比P巴勒斯坦权力机构可能反映了直接antitrophic行动和缺乏血管活性的性质,尽管血管收缩和血管重塑的相对贡献低氧诱导肺动脉高压是辩论的主题28。然而,西地那非是一个更有效的vasorelaxant代理,与一些抗增殖特性。西地那非已被证明是有效的大鼠缺氧肺动脉高压模型但不倒退P巴勒斯坦权力机构,RVH和肺血管重塑正常23。辛伐他汀的西地那非治疗减少维护P巴勒斯坦权力机构并演示了额外antitrophic效果。值得注意的是,在这项研究中使用的剂量的西地那非(75 mg·公斤−1·天−1口头)是位于或接近这个药物的剂量反应曲线的鼠缺氧模型,生产没有更大的减少P巴勒斯坦权力机构比25 mg·公斤−1·天−1。因为增加剂量的西地那非没有进一步的影响,获得的额外好处结合辛伐他汀最有可能反映了一个真正的药效学作用。
西地那非是介导的心血管效应主要是由环鸟苷酸。西地那非和辛伐他汀增加以挪士表达和两种药物的组合更为显著的影响以挪士表达式和大于添加剂影响组织cGMP水平。此外,两种药物的组合明显减少GTP-RhoA表达式。水平的激活RhoA蛋白在肺和右心室显著增加2和4周后缺氧,同意发表的数据12,29日。辛伐他汀和西地那非减毒GTP-RhoA表达式在肺癌和右心室接触缺氧、增强相结合两种药物产生影响。RhoA被认为是主要的上游ρ激酶活化剂。RhoA由中介可能导致肺动脉高压血管收缩剂,如血管紧张素ⅱ的影响,endothelin-1和乙酰胆碱和/或表达下调以挪士在内皮细胞表达和一氧化氮产量30.,31日。RhoA和ρ激酶是重要的血管平滑肌细胞的分化和生存和长期抑制这些细胞发生凋亡在体外32。ρ蛋白质还可以调节细胞外基质生产在不同的细胞类型33。RhoA已经成为药物开发的目标在肺动脉高压34。静脉注射管理ρ激酶抑制剂fasudil或y - 27632减毒肺动脉高压和肺血管重塑和强化以挪士表达式在啮齿动物的野百合碱和慢性低氧诱导的PH值35- - - - - -37。有趣的是fasudil更有效地降低慢性低氧诱导肺动脉高压eNOS-deficient小鼠与野生动物相比,表明ρ激酶信号是依赖于以挪士37。此外,他汀类药物的心血管效应似乎也涉及以挪士38,39。我们的数据将支持eNOS-RhoA-cGMP的论文是一个收敛的信号通路调节相结合,增强西地那非和辛伐他汀的影响P巴勒斯坦权力机构,RVH和血管重塑的肺动脉高压大鼠模型。
这项研究有一些局限性。首先,目前尚不清楚我们是否取得了最大的辛伐他汀的药理作用缺氧模型。具体地说,辛伐他汀的影响P巴勒斯坦权力机构比之前报道和polycythaemia症状不明显,尽管使用相同的剂量的辛伐他汀14,20.。然而,我们注意一些外部表面粒度辛伐他汀治疗动物的肝脏,暗示我们接近可能引起肝毒性的剂量。此外,我们没有评估肺血管阻力和心输出量。第三,一个药代动力学相互作用需要在将来的研究中研究辛伐他汀和西地那非。
总之,添加西地那非的辛伐他汀显著保护作用和显著逆转低氧诱导肺动脉高压和改造。影响,尤其是营养对RVH和血管重塑的影响,药物结合时更加明显比独自一人。这种反应可能解释,至少部分由一个添加剂影响以挪士表达式和cGMP水平在肺和右心室,和更显著的抑制RhoA活动。
支持声明
这项工作是由英国心脏基金会。
感兴趣的语句
语句对j·沃顿和核磁共振可以找到威尔金斯www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 收到了2008年9月19日。
- 接受2009年3月26日。
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