摘要
导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)发生的遗传因素尚不清楚。已经提出了许多候选基因,包括保护肺免受氧化应激的酶,如微粒体环氧化物水解酶(EPHX1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)。迄今为止,大多数报道的结果都是针对EPHX1的,特别是与环氧化物中间体的快速和慢速代谢相关的功能性变体。本研究旨在确定这些基因的变异与COPD易感性或严重性的任何关联。
总体而言,1017名白色COPD患者和912个未患病年龄和性别匹配吸烟对照的基因型为EPHX1 6个单核苷酸多态性(SNP)(包括快和慢变量和相关的单倍型),并在编码GCL两个基因8个SNP。GCL是谷胱甘肽合成的限速酶,的主要贡献者在肺中的抗氧化剂保护。
未发现EPHX1或GCL变异与COPD易感性或疾病严重程度相关。
这是迄今为止报道的最大的研究,为发现以前提出的关联提供了良好的动力。目前的数据表明,这些基因变异不太可能与白色慢性阻塞性肺疾病患者的易感性或疾病严重程度有关。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是西方世界发病率和死亡率的第六大原因,随着人口年龄的增长,该疾病的患病率呈上升趋势1. 在西方社会,吸烟是导致这种疾病的主要环境因素∼15%的吸烟者患上了这种疾病,这表明遗传因素在决定易感性方面起了作用。除了严重的α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)的缺陷,这些遗传因素知之甚少。
鉴于>那些谁开发慢性阻塞性肺病的95%是吸烟者和氧化应激被认为是在疾病的发病机制很重要,在防止烟雾诱导的氧化应激肺酶的遗传变异一直研究的显著焦点。微粒体环氧化物水解酶(EPHX1),参与环氧化物中间体的首过代谢的酶,已受到特别关注作为基因的两个功能性变体,其赋予慢速和快速的代谢活性,已经确定2.慢变异降低活性约40-50%,而快变异增加活性约25%。自从首次报道COPD易感性增加与“慢”变异位点(第3外显子Tyr113His)的His-His纯合性之间的关联以来3.,随后的研究在不同程度上支持了这种联系4.-6.,或已报告与疾病严重性而非易感性相关7.; 未观察到该多态性与疾病易感性或严重性之间的关联8.-10;或者报道了这种多态性的保护作用11.“快速”变异(His139Arg在外显子4)的研究结果也存在类似的差异,据报道,拥有小变异与保护有关12那13或者没有效果3.那11.
这些研究中缺乏复制和不一致很可能反映了一系列问题,这些问题可能会在复杂疾病的病例对照研究中产生假阳性或假阴性结果,而在这种情况下,单基因与疾病之间的关联相对较弱14.其中包括由于病例和对照数量不足而导致的力量不足,病例和对照匹配不佳,特别是在吸烟方面15,并在不同的研究人群之间的遗传异质性。最近的研究还表明,使用限制性片段长度多态性(RFLP)技术时,从基因型分型的单核苷酸多态性(SNP)中的Lys119存在附近的外显子3缓慢多态性所产生的错误可以导致His113纯合子的显著高估10在研究人群中缺乏Hardy-Weinberg (HW)平衡。事实上,在先前的研究中,忽略了非HW平衡人群的meta分析中,His113纯合性被报道为预防COPD的发展11.
为了解决其中许多问题,在先前的一项研究中,本研究作者从1017名白人COPD患者和912名非疾病对照吸烟者队列中收集了样本,按种族、年龄和性别匹配16.这代表了迄今为止在候选基因方法中报道的最大的集合。通过匹配来自欧洲每个中心的病例和对照组,将人口分层的风险降至最低。来自全基因组关联研究的最新数据表明,至少在英国人口中,迄今为止分析的近3000个对照中,几乎没有分层的证据。相对少数的基因在等位基因频率上显示出显著差异,这表明种群是相对同质的,而不像之前认为的那样易变17.在目前的研究中,该资源被用于评估EPHX1变异与COPD的发生和严重程度之间的关系。谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)遗传变异的相关性研究也被称为γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶),并评估了发展为慢性阻塞性肺病的风险。这是谷胱甘肽合成的限速酶,谷胱甘肽是肺抗氧化防御系统的主要贡献者。最近,基因催化亚基的变异已被证明与囊性纤维化的肺疾病严重程度有关18.迄今为止,该基因的遗传变异仅在一项小型COPD研究中被报道过,且未发现相关性19.
材料和方法
主题
在六个欧洲中心招募COPD病例和对照组。从每个中心招募的受试者人数如下。巴塞罗那(西班牙):70例对照和138例;布里斯托尔(英国):152例对照和129例;都柏林(爱尔兰):195例对照者和196例病例;爱丁堡(英国):81例对照和168例;莱顿(荷兰):216例对照和188例;和比萨(意大利):198例对照和198例病例。每个征聘中心的有关委员会都批准了这项研究。获得所有受试者的知情同意。 Criteria for patient recruitment were: a firm clinical diagnosis of stable COPD; airflow limitation as indicated by forced expiratory volume in one second (FEV1)≤70%的正常预测值;FEV1/用力肺活量(FVC)<70%pred;支气管扩张无明显可逆性;还有吸烟史≥20 pack-yrs。如果患者已确诊患有哮喘、肺癌、过敏史、已知α,则将其排除在研究之外1-AT缺乏或血清α1-在水平<1.0时 克·升-1. 如果受试者在4个月内出现急性加重,也被排除在外 研究评估前几周。
在每个中心招募对照受试者,以匹配COPD患者的种族、年龄、性别和吸烟史。排除标准如病例所述,还包括COPD家族史。仅限无气流阻塞(FEV)迹象的个人1和FVC≥80%和钒铁1/FVC>70%纳入对照组。病例组和对照组仅招募白人受试者。病例和对照组之间未实现完全匹配,但在分析过程中考虑了这一点。
SNP定位和单倍型
DNA测序鉴定SNPs是使用前面描述的方法进行的16.设计引物进行PCR,筛选基因的外显子和侧翼区域。这些SNPs随后使用Taqman分析(应用生物系统公司,Foster City, CA, USA)对291个来自之前COPD研究的白人受试者的独立样本进行基因分型,以获得更多关于SNPs频率的可靠数据。所有受试者均给予知情同意,并经各招募中心伦理委员会批准。当测序样本中SNP处于完全连锁不平衡状态时,选择一个具有代表性的SNP进行基因分型。如果SNP的小等位基因频率低于5%,则从进一步的分析中删除。
研究样本的基因分型
在genesservices Ltd (Cambridge, UK)使用Taqman分析方法对研究人群进行了EPHX1基因中的6个SNPs和GCL基因中的8个SNPs(5个在GCL催化(GCLC)和3个在GCL修饰(GCLM)亚基)的基因分型。引物和探针序列可根据要求提供。作为一项质量控制措施,纳入44份测序中已知基因型的样本。这些基因型是Geneservices有限公司所不知道的,但被用作内部质量控制措施。如果发现有差异,则重复分析;这导致了100%的一致性,所有的分析。
统计分析
群体遗传变异分析
对3个基因中的每一个snp进行HW平衡分析。为了检验连锁不平衡,我们计算了病例和对照中每个基因SNP对之间的相关系数。由于在招募时没有完全匹配,因此使用logistic回归对任何由于年龄、性别、吸烟和中心造成的残留混淆进行了等位基因和基因型频率调整。这也增加了匹配设计的功率。如前所述,年龄、性别、吸烟与中心的交互作用也包括在内16. 由于研究规模的原因,有可能发现病例和对照组之间的微小差异。例如,在所研究的SNP中,对照组的(罕见型)等位基因频率从低7.4%到高26.6%(两个SNP均位于GCL基因中;桌子 1.⇓和2⇓). 以这些极端值为例,采用1%的双侧显著性水平,该研究检测等位基因频率的能力为95%≥与对照组的7.4%相比,病例组为11.4%,发生率为≥32.8%与26.6%相比。与对照组相比,病例中较低频率的相应检测百分比分别为4.2%和20.8%。
结果
研究人群的特征
表1总结了参与本研究的对照组和COPD组的特征 3.⇓.针对对照组的招募产生了年龄和性别特征相似的组,尽管没有实现对照组和COPD组的完全匹配,因为年龄> - 65岁的吸烟者中有很高比例的肺功能阻塞的证据,因此被排除在招募的对照组之外。在数据分析中对这种不完全匹配进行了调整。在COPD组中,招募的患者几乎平均分布在全球中度、重度和非常重度阻塞性肺疾病严重程度类别中(见在线补充数据表1S)。
SNP映射
EPHX1
通过测序,总共在EPHX1基因中鉴定出25个SNP(见表1) 在线补充数据的2倍)。其中两个SNP(RS4561640和rs45505095)的次要等位基因频率<5%,因此排除在进一步分析之外。另外两个SNP(rs45467394和rs4149227)不适合Taqman分析设计。在5′侧翼区域-699/-613/-362和-290/-200位点的SNPs之间观察到完全连锁不平衡,留下19个连锁不平衡的SNPs,发生频率>5%。由于筛选19个SNPs会导致大量单倍型以<1%的频率出现,从而降低研究的效率,因此根据先前的关联或潜在的功能变异选择了6个SNPs。所选择的SNP包括三个完全覆盖启动子区域变异的SNP(rs2854450、rs2854451和rs3753658)、慢功能和快功能SNP(分别为rs1051740和rs2234922),它们已被证明影响EPHX1的活性,以及来自基因3′未翻译端的一个SNP(rs4653695)。
GCL
在GCLC亚基和GCLM亚基分别鉴定出6个和6个snp。这些SNPs的位置和核苷酸替换在补充数据中显示(表3S)。在GCLC亚基中,有两个snp (rs2100375和rs1901773)处于完全连锁不平衡状态,因此在进一步分析中只评估了rs2100375。在291个独立的样本中,发现剩下的5个SNPs促成了9个单倍型,频率为>1%,占到基因中观察到的变异的99%,因此,提供了几乎完全的基因覆盖。这5个snp在研究人群中进行了基因分型。在GCLM亚基中,有3个snp (rs41303970、rs743119和rs2273406)处于完全连锁不平衡状态,因此在后续分析中选择rs41303970来推断所有3个位点的信息。SNP rs35267053的小等位基因频率<5%,未纳入进一步研究。在291个样本中,发现剩下的3个SNPs促成了4个单倍型,频率为>1%,占观察到的变异的99%。在最终的样本资源中,所有三个snp都进行了基因分型。
慢性阻塞性肺疾病和正常对照人群中EPHX1和GCL基因变异分析
在整个研究人群中筛选的六个EPHX1 SNP的等位基因和基因型频率如表所示 4.⇓-⇓6.⇓. 为了便于呈现,筛选出的SNP按1到6的顺序编号,并注明每个SNP的基因位置相对于转录起始位点、碱基替换和国家生物技术信息中心SNP数据库(dbSNP)参考号。所有SNPs均在HW平衡的公认标准范围内,且所有六个招募中心的人群中的SNPs频率相似。
在患者组和对照组之间未观察到任何单个EPHX1 SNP的等位基因频率差异,患者组和对照组之间的SNP基因型频率也没有任何差异(在接受显著性的1%水平上)(表1) 4.⇑-⇑6.⇑). 类似地,如Smith和Harrison所述,当根据慢基因座和快基因座的基因型划分为功能表型时3.,对照组与慢阻肺患者无明显差异。没有发现功能表型与病例的疾病严重程度相关(见表4S在线补充数据)。我们也评估了与慢、快功能变异相关的常见六种SNP单倍型(频率为>1%),但在对照组和COPD组中未发现单倍型差异(表7)⇓).
如同EPHX1基因,六个SNP的频率在GCLC筛选和GCLM基因在来自所有六个招募中心的群体相似,并与SNP1米(C-590T GLCM亚基)之外,所有都是内所接受的标准HW平衡。用于SNP 1M,次要等位基因纯合子的频率为略高于预期(4.3与2.5%)。(p = 0.002)。这不太可能是由于基因分型错误,因为本试验的盲法对照是准确分配的。小等位基因的频率小于5%,观测数量的微小偏差可能会导致HW平衡的显著偏差。虽然在real-time PCR的初步实验中没有发现这方面的证据(数据未显示),但仍不能完全排除拷贝数变异的可能性,拷贝数变异往往会导致HW平衡偏离。
在GCLC或GCLM基因的任何单个SNP中,病例组和对照组之间未观察到等位基因频率的差异,也未观察到SNP基因型频率的差异(表1) 1.⇑和2⇑).
连锁不平衡分析(见表 在线补充数据中的5S和6S)表明,病例组和对照组中GCLC亚单位中的SNPs 2c和5c(rs2100375和rs524553)之间以及GCLM亚单位中的所有三个SNPs之间存在强连锁。在病例组或对照组中,在EPHX1基因中评估的SNP之间未观察到强连锁。
对三个基因中每个基因的单核苷酸多态性组合进行的单倍型分析没有发现任何与COPD相关的组合。类似地,当根据COPD组内的疾病严重程度进行评估时,对于评估的三个基因中的任何一个,均未观察到单倍型与疾病严重程度之间的关联。
讨论
The EPHX1 gene has been a significant focus for studies on genetic susceptibility in COPD in the past 10 yrs. It is a promising candidate gene as it is strongly expressed in the bronchial epithelium and its biological role in detoxifying epoxides is extremely relevant in protecting the lung against smoke-induced damage. In addition, there is significant individual variation in enzymatic activity, and genetic polymorphisms that modify enzymatic activity have been identified21.
大多数关于COPD中EPHX1遗传变异的研究都评估了与慢酶(Tyr113His)和快酶(His139Arg)活性相关的基因编码区多态性,结果相互矛盾。许多此类研究在权力方面存在局限性(病例和对照组的受试者数量在60-200之间);种族、年龄、性别和吸烟史的匹配也存在很大差异。此外,利用RFLP技术分析多态性变异的研究可能高估了慢(113His)纯合子的比例10.
本研究中通过在病例组和对照组具有足够功率评估EPHX1多态性容易地复制先前报道协会克服了许多这些限制。所有受试者都是白人和人口分层的任何潜在影响,是由来自同一种群招募病例和对照最小化。此外,控制定向招生促进了控制招生具有类似轮廓COPD患者相对于性别,年龄和吸烟。
EPHX1多态性分析表明,COPD易感性与Tyr113His或His139Arg基因座变异之间没有关系。鉴于本研究中的有效性和病例对照匹配水平显著提高,因此不太可能忽略先前有效性较低的研究中观察到的效应。在对照人群中,所有评估的EPHX1 SNP均处于HW平衡。这一点,加上在基因分型分析中纳入了先前测序的样本作为质量控制,表明当前分析不受基因分型错误的影响。
此外,对快速(His139Arg)和慢速(Tyr113His)变异对应的单倍型进行详细分析,未能识别与疾病相关的单倍型。作者还分析了EPHX1基因的5 '启动子区域的变异,该基因已被证明可以调节高达30%的酶表达21,但与疾病易感性没有关联被发现。
目前的结果与最近的两项充分有力的研究不一致,这两项研究报告了His139Arg的保护作用12试着让他11尽管两项研究都没有复制对方的结果。在一项对304名肺气肿患者和441名对照组的研究中,赫什et al。12report a protective effect (odds ratio 0.73, p = 0.03) with the fast variant of codon 139, while no association was observed with variation in the 113 codon. By contrast, Broggeret al。11在492名白人吸烟者和戒烟者(244名COPD患者和248名对照)中评估了相同的多态性,并报告了他/他的纯合性在113个位点的保护作用,而在139个位点的变异没有影响。目前的研究没有重复这些观察结果,在大多数较小的研究中也没有发现3.-10.
EPHX1基因的测序显示该基因的变异很高,已鉴定出25种多态性。这可能解释了慢变异体和快变异体研究中报告的一些相互矛盾的结果,因为这些多态性可能在其他特定SNP变异体或单倍型的背景下导致疾病易感性。然而,这似乎不太可能,因为目前的作者已经捕获了与快速和慢速变体相对应的最重要的单倍型。可能是其他基因的变异也起了作用,因为对慢速和快速EPHX1基因变异的影响的研究表明,它们可能只对体内活性水平和转录后修饰可能是重要的21-23.因此,这似乎不太可能,这些特定变体有助于COPD的易感性,虽然罕见的变异发挥作用的可能性不能排除,并且需要显著更大规模的研究,以可靠地进行测试。
谷胱甘肽合成限速酶GCL也是COPD易感性的潜在候选基因。在GCLM基因敲除小鼠的肺中观察到谷胱甘肽水平显著降低24健康吸烟者肺泡巨噬细胞中该亚单位的信息表达降低25.另外,GCL蛋白在支气管气道中存在出现在吸烟者和COPD患者中减少与不吸烟的对照相比26那27. 这种酶的两个亚基都进行了基因分型,并研究了遗传变异作为疾病潜在危险因素的作用。与EPHX1一样,在编码GCL酶任一亚基的基因中,未发现与疾病和SNP相关。这证实了关于慢性阻塞性肺病GCL遗传变异的唯一其他报道研究,该研究调查了GCLC基因中的单个SNP(rs17883901;SNP1c)在322名汉族受试者中检测,未能找到与COPD相关的证据19.目前的研究扩展了之前的发现,包括更多的GCLC基因的SNPs,并考虑了GCLM亚基的基因变异。
总之,没有发现任何证据为环氧化物水解酶或谷氨酸,半胱氨酸连接酶基因多态性与易感性白色人口显著关联,慢性阻塞性肺疾病。
支持声明
目前的工作得到了欧盟第五框架计划合同QLG1-CT-2001-01012(COPD基因扫描项目)的支持,并作为知识产权受到保护。唐纳利是由爱尔兰科学基金(爱尔兰都柏林)资助的。JLotya得到了健康研究委员会(都柏林)的资助。
兴趣表
没有宣布。
致谢
作者想感谢以下几点。协助招聘:A. Hann(布里斯托大学,布里斯托,英国);B. Callaghan和G. Hogan(都柏林大学学院,都柏林,爱尔兰);J. Barr(爱丁堡大学,爱丁堡,英国);和C. Kolster-Bijdevaate(荷兰莱顿大学医学院)。临床和技术援助:G. Catapano, E. Fornai和C. Carli(比萨大学,比萨,意大利)。数据分析方面的协助:E. Daly(都柏林大学学院)。关于数据分析的评论:B. Veldhuisen和J.J. Houwing(莱顿大学医学院)。
隶属关系如下。s查佩尔,K。摩根,T。盖塔·巴兰斯和N。Kalsheker:诺丁汉大学诺丁汉医院医学院遗传学研究所临床化学、分子医学科学分院,英国;L戴利和J。Lotya:爱尔兰都柏林大学公共卫生与人口科学学院;J罗卡和R。拉比诺维奇:肺服务,巴塞罗那省医院诊所,西班牙巴塞罗那医院诊所;A.B. Millar:布里斯托尔北方布里斯托大学临床科学系,布里斯托尔南部医院,英国,肺研究小组;S.C.Donnelly和C.M.O'Connor:爱尔兰都柏林大学学院康威研究所医学和医学院;v基廷:莱特肯尼综合医院,莱特肯尼,多内加尔县,爱尔兰;WMacNee:Edinburgh Lung and the Environment Group Initiative Colt Laboratories,英国爱丁堡女王医学研究所医学研究委员会炎症研究中心;JStolk和P.S.Hiemstra:荷兰莱顿莱顿大学医学中心肺内科(C3-P);M米尼亚蒂和S。蒙蒂:意大利国家研究委员会,意大利比萨临床生理学研究所。C.M.奥康纳和N。Kalsheker作为主要作者也做出了同样的贡献。
脚注
这份手稿具有访问补充数据www.ers.ersjournals.com
- 收到了2008年4月29日。
- 公认2008年6月19日。
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