抽象的
淋巴细胞在免疫防御中是至关重要的结核分枝杆菌(MTB)感染。本研究的目的是确定mtb特异性淋巴细胞是否在最小活动性肺结核(PTB)患者的肺中被选择性地划分。
患有涂抹阴性MTB-培养的PTB的患者进行了前瞻性招募。差异细胞计数,用单克隆抗体的免疫蛋白型指导针对细胞表面标记CD4,CD8,CD4CD45RA,CD4CD45R0,CD38,人白细胞抗原DR,CD19,CD3,CD57和CD16和MTB特异性酶联的外周血单核细胞分析测定进行带有6-KDA早期分泌抗原靶和培养滤液蛋白10的支气管肺泡灌洗(BAL)单核细胞。
在12名培养型涂抹阴性PTB中,在外周血或BALF(BALF)中的CD4或CD8 T细胞的分布中没有发现差异。在BALF的细胞中膨胀活化的人白细胞抗原-DR阳性细胞,以及记忆CD4CD45R0阳性T细胞。与替代肺病理学的一组对照患者相比,淋巴细胞群没有显着差异。然而,6-KDA早期分泌物抗原靶 - 和培养滤液蛋白10特异性淋巴细胞更浓缩,中值BALF:PTB患者分别在患者中,中位血液比例为9.9和8.9。
结核分枝杆菌- 特异性T细胞在活性肺结核的感染部位是高度选择性的舱室化的。
T淋巴细胞在适应性免疫防御中发挥着重要作用结核分枝杆菌(MTB)通过与肺泡巨噬细胞的直接相互作用1那2.
在健康的成年人中,T淋巴细胞的总数估计为3.0×10113..大约2%的t淋巴细胞存在于外周血中,而近10%存在于肺部3..在活动性结核病(TB)中,记忆t细胞在遇到抗原时克隆扩张,并被招募到感染部位4.-10.这些MTB特异性记忆T细胞产生干扰素(IFN)-γ11和1型T-辅助细胞型免疫应答的其他细胞因子12.特异性抗原提呈后IFN-γ的迅速产生主要由效应t细胞群体提供11这些细胞通常具有cd4cd45r0阳性、cd27阴性和CC趋化因子受体7阴性的表型,并具有快速、抗原特异性细胞毒免疫应答的端分化11那13.
自20世纪90年代末以来,随着t细胞IFN-γ释放试验的发展,MTB感染的免疫诊断取得了重大进展。枚举6-kDa早期分泌抗原目标(计)6和文化滤液蛋白质(CFP) 10-specific从外周血淋巴细胞酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(化验或ELISA酶标法已被证明是更敏感的免疫诊断和特定的活跃和潜伏性结核感染(LTBI)比结核菌素皮肤试验(TST)14-18.然而,由于效应器T细胞仅在外周血中以低频发生,因此当已经进行了T细胞IFN-γ释放测定时,无效Tb,LTBI和先前处理的Tb之间的清晰区别并不令人惊讶于单独来自外周血的细胞19那20..相反,从感染部位计数抗原特异性细胞已被证明是与LTBI区分有效TB感染的有希望的方法21-24.
为了更好地了解活动性肺结核(PTB)期间从血液中招募淋巴细胞到人肺的数量,对前瞻性招募的疑似诊断为PTB和痰中抗酸杆菌阴性的患者进行免疫表型和mtb特异性t淋巴细胞数量分析。
方法
主题
三例抗酸杆菌涂片阴性、胸部x线片或胸部计算机断层扫描肺浸润及疑似PTB的患者入选。采用静脉血法采集外周血单个核细胞(PBMCs)。支气管镜下取支气管肺泡灌洗单核细胞(BALMCs)25.仅将培养型涂抹阴性活性PTB的患者分配给TB组;所有推定但涂片和培养阴性结核病的所有患者都被排除在研究之外。将负MTB培养物和替代诊断的患者分配给非TB组。研究不包括健康对照。该研究得到了吕贝克医学院大学(德国Lübeck)的伦理委员会的批准,所有患者均提供书面知情同意。
Immunophenotyping
使用针对CD4,CD8,幼稚CD4CD45RA,记忆CD4CD45R0,CD38,人白细胞抗原DR,CD19,CD3,CD57和CD16(Dakocytomation,Hamburg,CD3,CD57和CD16(Dakocytomation,Hamburg,CD3,CD57和CD16)中从新鲜的血液和平牙抗体的PBMC中列出了淋巴细胞亚群德国)通过双色流式细胞术(FacScalibur; Becton-Dickinson,Heidelberg,德国)。
细胞制剂和ELISPOT测定
如前所述进行人IFN-γ的ELISPOT测定的细胞制剂22.通过血液和BALMCS(BALF)差异细胞计数,从PBMC和BALMCS之间的SFC净数计算每百万百万淋巴细胞的百万淋巴细胞的数量。
统计分析
对探索性分析采用非参数检验进行统计检验,对多重检验不作调整,名义显著性定义为p值<0.05。为避免因除零而产生的数学误差,在计算pbmc和balmc淋巴细胞中ESAT-6-和cfp -10特异性细胞的比值时,将0赋值为0.1。
结果
患者特征
40名疑似肺结核患者被前瞻性纳入研究。12例经痰液或BALF中结核分枝杆菌培养阳性确诊为结核分枝杆菌(其中8例在以前的报告中包括22)。一组25名负面MTB培养结果的患者被诊断出患有PTB以外的疾病;其中九个在其BALF中具有<1%的淋巴细胞,或者没有足够的BALF可用于荧光激活的细胞分选过分析,因此也必须从研究中排除。来自非TB对照组的剩余16名患者的诊断是结石病变(n = 4),肺炎(n = 4),前一种分枝杆菌感染没有重新激活(n = 4),密码发生组织肺炎(n = 2),支气管生成癌(n = 1)和类风湿性关节炎(n = 1)。七个非TB患者用外周血给出阳性ELISPOT结果,并诊断出LTBI。患有PTB的患者年轻(31.1相对50.7年;P <0.018),男性(10 / 12)多于其他疾病(10 / 16;p < 0.021)。
ELISPOT试验结果
PTB患者中ESAT-6-和cfp -10特异性淋巴细胞的中位数分别为64(四分位范围(IQR) 35-167)和149(85-259)/百万淋巴细胞,BALF中分别为598(244 - 2593)和1653(549 - 4511)/百万淋巴细胞。非结核组患者中ESAT-6-和cfp -10特异性淋巴细胞的中位数分别为3(0 - 33)和6(0 - 32)/百万淋巴细胞,BALF中分别为0(0 - 150)和0(0 - 73)/百万淋巴细胞(图1)⇓)。
PTB患者肺部肺部ESAT-6-和CFP-10特异性淋巴细胞的分区
患者PTB,中值(IQR)BALF:每ESAT-6和外周血比CFP-10特异性的SFC百万淋巴细胞分别为9.9(3-37)和8.9(6-32)。相比之下,中位数BALF:对照患者中百万淋巴细胞的ESAT-6和CFP-10特异性SFC的外周血比分别为0(0-13)和0(0-7)(图2⇓)。
讨论
自20世纪90年代末以来,mtb特异性ELISA (QuantiFERON-TB-Gold In-Tube;celestis, Carnegie, Australia)和ELISPOT (T-Spot。结核病;牛津免疫技术公司(Oxford Immunotec, Abingdon, UK)已经被开发用于结核病的诊断26-28.但是,讨论令人惊讶地讨论了这些测定真正衡量的问题。尽管ELISA在全血中的MTB特异性抗原接触后量化IFN-γ产生,但是可以使用ELISPOT测定来枚举单个MTB特异性细胞。由于抗原呈递单核细胞和树突状细胞不是IFN-γ产生的来源,因此与ELISPOT测定中的淋巴细胞一起测定,ELISPOT测定结果应标准化为淋巴细胞数,以实现更准确的结果。在外周血中发现人体中少数淋巴细胞29,即使在活性TB中,MTB特异性T细胞在外周血中发生的频率也非常低(相对于ESAT-6-和CFP-10特异性T细胞)非常低(〜0.002-0.4%)21那22.因此,在常规临床实践中不可能使用这些检测方法来区分活动性结核和LTBI也就不足为奇了27.
在抗原遭遇之后,Naïve细胞毒性T淋巴细胞前体是灌注并获得效应功能。他们经历扩张并前往感染部位,在那里他们通过杀死感染的细胞和分泌效应细胞因子来介导病原体清除。随后,大多数效应子细胞毒性T淋巴细胞死亡30..它可能,因此,有可能使用免疫诊断从LTBI区分活性的TB,使用Mtb特异性ELISPOT分析从感染和外周血的部位比较抗原特异性细胞的频率21那22.先前已经描述了活性TB期间感染部位的抗致细菌免疫应答的分隔率8.那12那21那31-38.在健康的家庭接触结核病患者33在活动性PTB患者中,抗原特异性淋巴细胞集中在肺部,并在受到攻击时产生1型辅助t细胞因子宿主反应34.然而,到目前为止,PTB中抗原特异性淋巴细胞浓度的大小尚未被量化。
在本研究中,发现MTB特异性T淋巴细胞被浓缩,浓缩,与来自外周血的患者的患者的淋巴细胞,淋巴细胞中的淋巴细胞中的左右1次浓缩。与外周血的淋巴细胞中的这种MTB特异性T细胞的浓度与胸腔积液中淋巴细胞中MTB特异性T细胞的浓度相同的数量级,与TB Pleurisy的外周血相比21.值得注意的是,与以前的研究结果一致6.,在本研究中未发现活动性PTB患者和对照组的PBMCs和BALMCs在免疫表型上的其他差异。
当比较PBMC和BABMCS的免疫蛋白酶型时,CD4CD45R0内存T细胞和人白细胞抗原DR阳性活化T细胞的频率较高,CD4CD45ra-Naive T细胞的较低频率,CD19 B细胞和CD16BALMC之间的自然杀伤细胞比PBMC在PBMC中,与早期的报告一致6.那39那40.但是,这些差异不限于PTB的患者;在其他肺病理学患者中也观察到PBMC和BALMCS之间的差异。在活性PTB中,抗原特异性T细胞在肺中的其他淋巴细胞中膨胀,并且在PTB的感染部位存在的大多数发现的淋巴细胞确实不是MTB特异性。需要解决本研究的局限性。不能排除年龄或性别对MTB特异性免疫反应的影响。仅在本研究中包含有限涂抹阴性Tb的患者。如果患有更晚期疾病或免疫抑制的患者,有关免疫蛋白型的发现可能是不同的。它还不清楚感染部位的MTB特异性T细胞的浓度是否是由于活跃募集循环细胞或局部增殖和少数特异性前体或两者组合的膨胀32.
综上所述,活动性结核中抗原特异性t淋巴细胞特异性富集于感染部位,利用ELISPOT方法比较外周血和BALF淋巴细胞中抗原特异性t淋巴细胞的频率,可对活动性结核和LTBI进行鉴别。由于高数量的抗原提呈细胞可能存在于来自血外室的单个核细胞中,mtb特异性ELISPOT检测结果应与检测中的淋巴细胞数量进行归一化。
未来的研究应评估酶联免疫表特测定的结核病局部免疫功能是否适用于结核病的外肺表现,例如脑膜炎,腹膜炎或心包炎。
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2007年7月30日。
- 公认2007年10月17日。
- ©ers Journals Ltd