文摘gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化和脱乙酰作用促进和抑制基因转录。招聘组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDAC)网站的炎症基因的转录提出了解释类固醇的抗炎活动的一部分。检查是否这个概念延伸到其他炎症性疾病,目前的作者调查的角色组蛋白乙酰化和类固醇的影响ventilation-induced诱导炎性基因。gydF4y2Ba
包括鼠标肺通风与低吸气压力峰值的180分钟10而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2Ba22.5而言不啻O或高峰吸气压力gydF4y2Ba2gydF4y2BaO(换气过度),对待HDAC抑制剂trichostatin (TSA),类固醇地塞米松或两者兼而有之。gydF4y2Ba
在H4K12换气过度增加组蛋白乙酰化作用,以及基因和蛋白质表达的肿瘤坏死因子(TNF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2α和白介素6 (IL);这些影响被地塞米松逆转。地塞米松的存在与否,TSA增强overventilation-induced TNF诱导和MIP-2α,但降低il - 6,表明HDAC是基因依赖的影响。gydF4y2Ba
因此,H4K12乙酰化作用及其调节类固醇可能与炎症相关基因转录在换气过度。组蛋白去乙酰酶抑制剂似乎发挥重要gene-dependent监管的角色在这个过程中,组蛋白的警告并不是唯一的组蛋白脱乙酰酶同功酶的底物。gydF4y2Ba
蛋白质乙酰化在基因转录的调控中起着举足轻重的作用。这是第一次证明之前,成为在特定赖氨酸残基乙酰化组蛋白基因转录gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。组蛋白乙酰化作用破坏高阶染色质结构和促进转录因子之间的相互作用与DNA转录机械。组蛋白乙酰化作用是由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDAC)逆转,打开和关闭基因转录。最近,组蛋白乙酰化和脱乙酰作用已经被提议作为重要的肺部炎症基因转录监管机构,在条件如哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。特别是,它提出了失活的HDAC活性氧(存在于香烟烟雾)会抑制一个主要的抗炎机制类固醇法案,从而解释了类固醇的抗慢性阻塞性肺病患者。Ventilator-induced肺损伤是另一个临床相关的肺部炎症反应和氧自由基产生gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。通过类比慢性阻塞性肺病,似乎可能修改组蛋白乙酰化调节类固醇的影响在ventilator-induced肺损伤的设置。gydF4y2Ba
调节组蛋白乙酰化提供了一个新颖的解释糖皮质激素(GC)的抗炎作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。进入细胞后,GCs绑定到胞液糖皮质激素受体(GR)和诱导的易位核作为一个二聚体或作为一个单体。二聚的GC / GR所谓复杂的DNA结合GC响应元素,要么作为一个积极的(trans-activation,gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba分泌白细胞肽酶抑制剂(SLPI)或核转录因子(NF) -κB抑制剂(IκB) -α)或负转录因子(cis-repression)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。除了这些机制,提出类固醇抑制基因转录的招聘HDAC同功酶,尤其是HDAC2gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,激活转录复杂删除关键乙酰半个,GR等gydF4y2Ba6gydF4y2Ba因此结束转录(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。这种机制似乎NF-κB-dependent特别相关的基因和激素浓度较低gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。激素依赖性激活的HDAC成为哮喘和慢性阻塞性肺病的缺陷并可能因此解释类固醇响应能力的损失在这些条件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
然而,组蛋白的转录机器并不是唯一的因素受到乙酰化和HDAC基质。例如,规定由乙酰化GR已经证明gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和转录因子NF-κBgydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和FOX3PgydF4y2Ba14gydF4y2Ba。此外,与前面所讨论的假设相反,结果表明,HDAC抑制剂如trichostatin (TSA)在哮喘模型都是有益的gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和类风湿性关节炎gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,这表明TSA类固醇可能工作在一个添加剂而不是对抗的方式。gydF4y2Ba
因此,根据模型和可能的时间进程,蛋白质乙酰化作用可能赞成或抗炎。最近发现刺激炎性基因诱导通气压力,这种现象被认为是重要的与机械通气相关肺损伤的相关性gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。能获得更多的洞察ventilator-induced基因转录的调控及其修改的类固醇,当前作者检查了组蛋白乙酰化作用,诱导NF-κB-dependent基因和类固醇的影响条件下的肺。这项研究是在老鼠模型包括肺,进行完善的模型调查stretch-induced基因的激活gydF4y2Ba18gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。在这个模型的优点是保留与完全控制呼吸器官解剖变量和缺乏肺外的细胞,使解释结果gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
糖皮质激素作用的假设gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba组蛋白脱乙酰作用导致的预测:1)通风与大型潮汐卷(gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba;换气过度(OV))提高组蛋白乙酰化作用;2)HDAC抑制增加组蛋白乙酰化作用和炎症基因转录后刺激机汇;和3)类固醇地塞米松(DEX)抑制炎症基因转录和表达依赖HDAC活性。目前的研究表明,第一个预言是真的。第二个预言是对肿瘤坏死因子(TNF)和巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 2α,但不是白介素(IL) 6。预测三个只能部分得到证实。因此,调节基因转录的蛋白质乙酰化在肺似乎是特定基因的刺激和问题。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
女性BalbC老鼠(20 - 25克)获得从傅柏林(德国柏林)和安置在标准条件下。所有的实验都得到地方当局的批准。gydF4y2Ba
模型包括老鼠肺部准备gydF4y2Ba
准备和灌注(1毫升·分钟gydF4y2Ba−1gydF4y2Banon-recirculating RPMI 1640中补充与羟乙基淀粉)的小鼠肺部通过肺动脉如前所述gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。简而言之,犀牛动物被定位在一个开放的,温暖(37°C)室,气管插管,与正压通风。腹部和胸部被打开暴露心脏和肺。左心房和肺动脉插管灌注就开始了。美国商会关闭密封和通风负压切换,以保证生理透壁的压力gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。肺灌注和基线条件下通风60分钟-10而言不啻end-inspiratory压力gydF4y2Ba2gydF4y2BaO和3而言不啻的呼气压力gydF4y2Ba2gydF4y2BaO,导致gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba∼200µL。gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba测量数值积分的气流速度。随后,肺部被随机分配给一个下面的六组:1)低吸气压力-10而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO(控制(C): n = 3);2)高22.5而言不啻吸气压力gydF4y2Ba2gydF4y2BaO (OV: n = 3);3)高吸气压力与10组2 +连续灌注gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba敏捷(OV / DEX10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM: n = 3);4)在组1 +连续灌注100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaTSA (C / TSA: n = 3);5)在2组+ TSA (OV / TSA: n = 3);和6)组3 + TSA (OV / DEX10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米/ TSA: n = 3)。实验进行了随机后180分钟。在第二组实验中,肺灌注上面完全一样,但随机分配到四组之一:1)C (n = 6);2)机汇(n = 5);3)OV + 10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba敏捷(OV / DEX10gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM: n = 7);和4)OV + 10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba敏捷+ 100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaTSA (OV / DEX10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba米/ TSA: n = 7)。这两组实验数据结合ELISA和相对量化(RQ) pcr。gydF4y2Ba
通过肺后,灌注液取样每30分钟,立即在液态氮冷冻。在实验的最后,肺是断开连接,切除的尸体,在液态氮冷冻。所有样品都保持在-80°C。gydF4y2Ba
肺被碾碎在液态氮用杵和臼。组蛋白提取物的制备和核提取物、肺粉解冻,洗冷PBS。gydF4y2Ba
细胞凋亡检测gydF4y2Ba
检测caspase-8活动是细胞凋亡的早期标志,一套是购自BD生物科学(美国帕洛阿尔托,CA)和执行分析根据制造商的指示。简而言之,肺粉在PBS洗,细胞溶解和离心机。蛋白质含量是决定从一个整除的上层清液,另一个整除孵化反应缓冲和caspase-8衬底3 h在37°C。的吸光度测定蛋白质含量在405 nm和正常化。作为一个积极的控制,人类微血管内皮细胞(HMVEC)细胞受到γ辐照(100 Gy),随后在37°C孵化4 h来增强信号。gydF4y2Ba
准备和核提取物的免疫印迹gydF4y2Ba
根据Dignam的方法提取细胞核gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。简而言之,肺粉末溶解在细胞裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.9,1毫米EGTA, 10毫米氯化钾;完成迷你(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国),0.6% NP-40)。原子核与核提取缓冲冰颗粒状和孵化(20毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.9,1毫米EGTA, 420毫米氯化钠,25%甘油;完成迷你)。离心后,上清液含有核蛋白质被收集并存储在-80°C。gydF4y2Ba
等量的蛋白质是由钠十二烷基硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到硝基。膜与抗体孵化HDAC1-3(北部,邓迪,英国和圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国),随后用荧光标记二次抗体(卡尔斯鲁厄,英杰公司GmbH德国和罗克兰免疫化学,Gilbertsville, PA,美国)。hdac在LI-COR漫游发现了成像系统(LI-COR生物科学,糟糕的小礼帽,德国)。gydF4y2Ba
组蛋白提取物的制备gydF4y2Ba
从肺组织蛋白提取粉如前所述gydF4y2Ba23gydF4y2Ba用细微的修改。简而言之,肺粉洗在PBS和离心机。颗粒悬浮在裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值6.5,50 mM亚硫酸氢钠,MgCl 10毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba、8.6%蔗糖、0.5% NP-40 10毫米Na-butyrate;完成迷你)和孵化10分钟在冰上。离心后(13500×gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C),颗粒和裂解缓冲洗了三次,一次与10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.4,13毫米EDTA。颗粒悬浮在0.2 HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在冰上和孵化1 h和偶尔的混合。组蛋白被离心分离溶解(13500×gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C)和丙酮沉淀一夜之间在-20°C。沉淀是离心机和冰冷的丙酮洗。剩下的颗粒被风干冰和溶解在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.9,10毫米氯化钠,0.25毫米EDTA, 10毫米2-mercaptoethanol、10%甘油。蛋白质浓度测定和组蛋白溶液保持在-80°C。gydF4y2Ba
组蛋白的免疫印迹gydF4y2Ba
组蛋白分离根据其大小、电荷和疏水性AUT凝胶12%。简而言之,组蛋白提取与同样体积的混合样品缓冲(8 M尿素、0.7毫米2-mercaptoethanol 20%甘油、6%(体积/体积)醋酸,pyronin Y)和孵化50°C 5分钟。卷相当于10 - 20µg蛋白质被加载到凝胶和分离的运行缓冲(100毫米甘氨酸,0.6%乙酸)一夜之间反向电流。凝胶产物然后在传输缓冲区(25毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.3,192毫米甘氨酸,0.1% SDS)和转移到硝基。检查传输与朱红色染料。的膜被RotiBlock(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)和孵化与抗体不同乙酰化组蛋白H3(圣克鲁斯生物技术)和H4 (Upstate-Millipore Billerica,妈,美国)。用荧光标记的第二抗体(表达载体GmbH,罗克兰)和乙酰化组蛋白发现LI-COR奥德赛成像系统(LI-COR生物科学)。在H4,所有乐队的信号加起来总H4荧光。H3,乐队代表monoacetylated蛋白质被忽视当添加荧光,因为它是最大的乐队和变化相当小。gydF4y2Ba
灌流液中细胞因子的浓度gydF4y2Ba
检测TNF-α,il - 6和MIP-2α灌流液样本,(OptEIA商用测试gydF4y2BaTMgydF4y2Ba设置鼠标TNF-α(mono /聚)和OptEIAgydF4y2BaTMgydF4y2Ba小鼠il - 6组;BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国、和Quantikine鼠标MIP-2免疫测定;研发系统GmbH德国威斯巴登)购买和执行完全根据制造商的指示。gydF4y2Ba
实时RQ-PCRgydF4y2Ba
隔离的信使rna, RNA-isolation装备购买从罗氏(德国曼海姆)。肺粉是悬浮在GUTC缓冲区(4 M硫氰酸胍盐,N-lauroylsarcosine 0.5%, 25毫米Na-citrate 2-mercaptoethanol 1%)。400年,µL裂解缓冲添加和DNA剪通过溶解产物通过20量度针。离心后,上清液混合着200µL乙醇和应用于列。列DNAse处理,删除所有坚持基因组DNA,然后清洗。RNA被筛选了,接受逆转录。gydF4y2Ba
为实时RQ-PCR,特定的引物选择从文学和底漆性能测试使用Omiga 2.0软件(英国牛津牛津分子)。引物序列如下。TNF-α:感觉5′-TCT-CAT-CAG-TTC-TAT-GGC-CC-3′, 5′反义-GGG-ATG-AGA-CAA-GGT-ACA-AC-3′;il - 6:感觉5′-CCA-GAG-ATA-CAA-AGA-AAT-GAT-GG-3′, 5′反义ACT-CCA-GAA-GAC-AGG-AAA-T-3′;MIP-2α:感觉5′-AGT-GAA-CTG-TGT-CAA-TGC-3′, 5′反义-AGG-CAA-ACT-TTT-TGA-CCG-CC-3′;HDAC1:感觉5′-AAT-TCC-TGC-GTT-CTA-TTC-G-3′, 5′反义-CAA-ACA-AGC-CAT-CAA-ATA-CC-3′;HDAC2:感觉5′-GTT-CAA-ATG-CAA-GCT-ATT-CC-3′, 5′反义-ACC-TCC-TTC-ACC-TTC-ATC-C-3′;和βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba微球蛋白:感觉5′-TGA-CCG-GCT-TGT-ATG-CTA-TC-3′, 5′反义-CAG-TGT-GAG-CCA-GGA-TAT-AG-3′。PCR扩增进行了一式三份。基因表达是正常一个内生参考基因,鼠标βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba微球蛋白。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
数据意味着±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba。进行了统计比较与JMP 5.0.1 Windows 2.0和RgydF4y2Ba24gydF4y2Ba。图2数据gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba被Box-Cox转换和转换进行单变量方差分析。的比较gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba当前作者曲线,利用曲线下的面积从60 - 240分钟(Prism 4.03;GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国CA)。在图7gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba每个控制代表100%(每凝胶总是只有一个控制);方差分析是不适用非参数Mann-Whitney等级测试执行。7比较了:CgydF4y2Ba与gydF4y2BaC / TSA;CgydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇;机汇gydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇/ TSA;机汇gydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇/ DEX10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM;机汇gydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇/ DEX10gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM;机汇/ DEX10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米gydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇/ DEX10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米/ TSA;和OV / DEX10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba米gydF4y2Ba与gydF4y2Ba机汇/ DEX10gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM / TSA。多个比较占了所有数据的错误发现率。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
VgydF4y2BaTgydF4y2Ba
控制肺部通风而言不啻-3/-10gydF4y2Ba2gydF4y2BaO end-inspiratory /呼气压力了gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba0.28±0.01毫升,0.25±0.01毫升60和240分钟后,分别。的gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba肺通气的不啻-3/-22.5gydF4y2Ba2gydF4y2BaO升至0.68±0.02毫升OV应用程序后,之后慢慢下降(图2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。TSA和敏捷都显著影响gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba在这个模型中(图2 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
半胱天冬酶的活动gydF4y2Ba
TSA诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在癌细胞系gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,caspase-8活动被确定为最早的事件在细胞凋亡级联,以排除任何不利影响的HDAC抑制剂包括老鼠肺部。作为一个积极的控制,目前的作者使用HMVEC受到γ辐照。HMVECs,但没有一个实验小组,上面显示caspase-8活动背景分析(图3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化作用gydF4y2Ba
当前作者检查了赖氨酸(K) 5,美丽,K12,组蛋白H4 K16, K9、K14, K18 K23和K27组蛋白H3。在组蛋白H4,五等距乐队对应mono - di - tri - tetra-acetylated组蛋白被发现,加上一个迄今为止未知的乐队可能造成另一个指控(磷酸)或charge-neutralising(乙酰)蛋白质改性。控制染色速率或K16乙酰化作用,大多数荧光检测到在一个乐队,其中大部分可能对应于monoacetylated组蛋白H4(图7gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和f)。一个小信号的频带归因于diacetylated组蛋白H4K5。OV没有增加K5的乙酰化水平或K16和TSA和敏捷。gydF4y2Ba
在控制染色乙酰化组蛋白H4K8(图7 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)或H4K12(图7 egydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),三个不同的乐队都清晰可见,最强的是中间的一个。TSA H4K8乙酰化作用的增加和H4K12所有实验条件下250至500%的控制。H4K8显示两个乐队其他三个以上,相应减少正电荷与赖氨酸乙酰化作用一致。这个网站是倾向较高的乙酰化在OV肺(p = 0.06)。乙酰化作用的K12因增加了OV(图7 ggydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),这是敏捷的逆转。gydF4y2Ba
在组蛋白H3,四等距乐队被检测(图4 a - cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,g和h),最低的是最强烈的,可能monoacetylated组蛋白H3组成。乙酰化作用由TSA少明显在组蛋白H4组蛋白H3比。能够检测这些微小差异,为量化乐队最低的是排除在外。乙酰化作用的K9、K23和K27没有回应TSA (p > 0.05;图4 dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Bai和j)。在K14和K18, di - 114%和tri-acetylated蛋白质被发现TSA,无论通风或敏捷管理模式(图4 egydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和f)。OV没有增加任何赖氨酸残基的乙酰化在H3。gydF4y2Ba
HDAC蛋白质表达和转录gydF4y2Ba
排除HDAC蛋白表达变化的可能性解释增加的组蛋白乙酰化作用,免疫印迹进行。当前作者没有发现重大差异的表达HDAC1, HDAC2或HDAC3蛋白在所有实验条件(图8 a - cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。TSA倾向于减少总HDAC所有实验条件下酶活性;但HDAC活动一致的测量十分困难,在整个肺提取(数据未显示)。gydF4y2Ba
RQ-PCR HDAC1和HDAC2孤立肺灌注后也表现(图5gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和b)。在这里,现在的作者发现更高层次的HDAC1和HDAC2 mRNA在所有团体TSA对待。值得注意的是,有一个HDAC2 mRNA水平减少50%,以应对OV(图5 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),这在很大程度上是通过敏捷的治疗。这些基因表达的改变并没有反映在蛋白质水平。gydF4y2Ba
基因表达和细胞因子的生产gydF4y2Ba
本研究的一个重要部分是检查的影响TSA MIP-2αOV-induced生产,TNF和il - 6;NF-κB-dependent基因成为overventilated鼠标激活肺gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。组蛋白乙酰化作用促进基因转录,这是假设,抑制由TSA hdac将增加炎症介质的表达。细胞因子生产经常受到转录后控制,两肺基因转录和肺细胞因子(灌流液水平)进行生产。此外,由于对HDAC类固醇的影响被认为是相对更明显类固醇浓度较低gydF4y2Ba5gydF4y2Ba低(10,敏捷是检查gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba和高(10米)gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米)的浓度。因为TSA根本不同MIP-2α和肿瘤坏死因子的影响一方面,和il - 6在另一方面,另行提出相应的数据。gydF4y2Ba
肿瘤坏死因子和MIP-2αgydF4y2Ba
控制肺、治疗TSA MIP-2α基因表达增加(图6 fgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),但没有影响MIP-2α生产(图6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)、肿瘤坏死因子基因表达(图6 dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)或TNF生产(图。6gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
正如所料,机汇增加MIP-2α和肿瘤坏死因子的基因表达和生产。MIP-2α而言,这种影响是强烈增加了TSA(图。6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和f);在肿瘤坏死因子的情况下,增加TSA诱导基因表达显著(图6 dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),但不是为细胞因子的生产(p = 0.09;图6gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
与之前的研究相一致gydF4y2Ba19gydF4y2BaMIP-2α生产缓解,但不能阻止敏捷(图6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba);MIP-2α基因表达本质上是不变的(图6 fgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。TSA治疗倾向于增加MIP-2α转录(图6 fgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)和OV MIP-2α生产/敏捷治疗肺(图。6 egydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba);这是重要基因表达的肺接受OV和10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba敏捷(图。6 fgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。OV-induced TNF基因转录降低了10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba敏捷(图。6 dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)和肿瘤坏死因子生产降低了敏捷(图6 a的浓度gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。TSA倾向于削弱DEX-mediated减少OV-induced TNF转录和生产,但是这种效应总是小和不明显(图。6gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
il - 6gydF4y2Ba
TSA治疗降低il - 6基因表达(图。6 egydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)和生产(图6 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)控制肺部。正如所料,机汇增加il - 6基因表达(图6 egydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)和il - 6生产(图6 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这种影响在很大程度上是被TSA治疗(图6 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和d)。敏捷避免OV-induced il - 6生产,影响进一步放大的TSA(图6 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和e)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化作用是基因调控的核心机制,它使DNA核心组织蛋白,从而使转录机器绑定和转录DNA。最近,在炎症基因转录组蛋白乙酰化的作用正受到越来越多的关注,这是由于激动人心的观念,改变在这个关键调控机制可能有助于解释类固醇阻力在难治性条件下,抗类固醇哮喘或慢性阻塞性肺病反应等。另一个炎症性疾病与氧化应激相关的类固醇是奇怪的是无效的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。因为在ARDS机械通气是强制性的,对结果有巨大的影响gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,相当大的兴趣了解机械通风影响组蛋白乙酰化和类固醇的抗炎的行为在多大程度上依赖于组蛋白脱乙酰作用在这些条件下。因此,当前作者研究了组蛋白乙酰化作用在完整的小鼠肺部受到高定压通气(OV)。目前的研究表明,OV激活组蛋白乙酰化作用。特别值得注意的是HDAC抑制活动的观察与TSA增加肿瘤坏死因子的转录和MIP-2α,但降低il - 6。关于敏捷的影响,减少OV-induced细胞因子表达,TSA部分扭转了其影响MIP-2α转录但进一步增强il - 6的减少。这些发现表明基因转录的调控hdac基因依赖和复杂。gydF4y2Ba
技术评论gydF4y2Ba
目前的实验研究包括小鼠肺、一个模型,允许ventilator-induced激活炎性基因的详细分析gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。然而,值得注意的是,这不是一个ventilator-induced肺损伤模型,在OV肺结构基本上仍完好无损gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。事实上,论点是,有一个完整的肺组织学是可敬的前提条件(patho)生理转导过程gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。然而,很明显,细胞因子ventilator-induced ventilator-induced肺损伤的生产是一个重要的决定因素gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
运输安全管理局已用作HDAC抑制剂的研究。最初在1976年描述为一种新的抗真菌抗生素gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,发现诱导分化gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba和细胞周期阻滞gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。1990年,吉田gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba建议TSA诱导组蛋白hyperacetylation hdac抑制的摩尔浓度。所有后续研究与组蛋白hyperacetylation TSA复制gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2BaHDAC抑制gydF4y2Ba37gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。观察TSA适合催化口袋的HDAC-like蛋白质一起保护HDAC活性部位和联系残留的家庭gydF4y2Ba40gydF4y2Ba最后建立了TSA HDAC抑制剂。gydF4y2Ba
因此,TSA似乎是一个相当具体的HDAC抑制剂。然而,由于HDAC同功酶底物非组蛋白,比如GRgydF4y2Ba6gydF4y2Ba,NF-κBgydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,具体gydF4y2Ba14gydF4y2Ba或microtubuligydF4y2Ba41gydF4y2Ba,与蛋白质磷酸酶gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,TSA的影响不能解释为改变组蛋白乙酰化作用。它还有待证明其他TSA已经描述的影响,如增加PI-3-kinase的活动gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba或表皮生长因子受体磷酸化gydF4y2Ba43gydF4y2Ba也由TSA的HDAC同功酶或非特定的副作用。因此,运输安全管理局是一个工具来探测HDAC活性但不能用于具体地址组蛋白乙酰化作用。gydF4y2Ba
TSA已经被证明在各种癌症细胞系诱导细胞凋亡,细胞凋亡是检查结束时实验。因为caspase-8活动在不被察觉的情况下(如最早的细胞凋亡的标志之一)无论实验组,得出TSA不诱导细胞凋亡在当前的模型。gydF4y2Ba
与TSA治疗后,目前的作者发现五个等距的乙酰化组蛋白H4,,最好的知识,并没有被观察到。AUT凝胶分离蛋白质不仅按大小也由疏水性,重要的是,通过电荷。这意味着至少五个不同的带电的存在,因此,修改后的组蛋白,所有携带至少一个乙酰基。尽管从理论上讲,H4可以在15乙酰化网站,只有四乙酰化网站(K8速率,K12和K16)到目前为止确定并详细研究gydF4y2Ba44gydF4y2Ba。除了一个迄今为止未知的乙酰化网站的存在,在H4丝氨酸磷酸化1被描述gydF4y2Ba45gydF4y2Ba和两个单位改变蛋白质的电荷,但一直与hypoacetylation H4的酵母gydF4y2Ba46gydF4y2Ba。其他修改,如甲基化,SUMOylation和泛素化,也会发生但不引入不同的电荷或改变组蛋白的大小显著,电泳迁移率预计将发生重大的变化。因此,乙酰化作用似乎是最有可能的修改在这些等距乐队。两个较低的带正电荷的外观与HDAC抑制剂治疗后TSA也指向乙酰化作用。然而,一个或两个带正电的乐队会在基底条件下磷酸化和乙酰化。gydF4y2Ba
假设1:通风与大gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba提高组蛋白乙酰化作用gydF4y2Ba
正如所料,在特定的赖氨酸残基发生乙酰化和脱乙酰作用即使在基线条件。肺灌注完整的鼠标的HDAC抑制剂TSA导致hyperacetylation H4K8 H4K12,而H4K5和H4K16仍不受影响。在组蛋白H3、小K14和K18乙酰化作用被发现后TSA治疗,而K9、K23和K27乙酰化作用仍在基底的水平。这些结果再一次表明组蛋白的特异性的修改和进一步证明的可能性分析组蛋白乙酰化作用在完整的器官。gydF4y2Ba
OV H4K12甚至H4K8导致乙酰化作用,逆转的两个实例与糖皮质激素治疗敏捷。大容量通风是一种炎性刺激促使细胞因子和趋化因子的分泌gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba激活NF-κBgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba和激活蛋白1gydF4y2Ba47gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba49gydF4y2Ba因此像其他炎症刺激,如肿瘤坏死因子、IL-1β,HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba或吸烟的行为gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba类似的途径。值得注意的是,在A549细胞这些刺激了组蛋白乙酰化作用模式gydF4y2Ba50gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba55gydF4y2Ba与机汇,扩展经典炎性刺激之间的相似之处和OV改变组蛋白乙酰化作用。也符合当前数据,H4K8 upregulation和H4K12乙酰化在A549细胞刺激后IL-1β被10治疗预防gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM敏捷gydF4y2Ba52gydF4y2Ba。总的来说,这些发现表明,H4K8和H4K12组蛋白乙酰化网站尤其与炎症相关基因转录。此外,乙酰化这些网站似乎是部分受类固醇,还在机汇的情况下。gydF4y2Ba
假设2:hdac抑制增加组蛋白乙酰化作用和炎症基因的转录gydF4y2Ba
根据这个模型由巴恩斯和同事gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,预计HDAC抑制促炎症基因表达增加。目前的研究表明,这是正确的对于一些但不是全部炎性基因,至少如果刺激机械拉伸。一方面,TSA增强MIP-2α和肿瘤坏死因子的转录和生产应对大量通风。另一方面,然而,il - 6转录和生产降低了TSA。后者观测符合TSA的影响il - 4, IL-5和免疫球蛋白E在小鼠哮喘模型gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。其他作者也报道,HDAC抑制剂可能减弱各种基因的表达gydF4y2Ba56gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba58gydF4y2Ba。更糟糕的是,TNF、il - 6和MIP-2α/引发发现增强了TSA在某些细胞类型而减少gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba60gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
对于这些现象的解释似乎成为可能。首先,古典的观点是,转录组蛋白脱乙酰作用的压制。符合这一点,HDAC抑制进一步激活pre-stimulated基因解释OV和TSA肿瘤坏死因子的协同效应和MIP-2α表达在当前的模型。然而,正如前面所讨论的那样,hdac也乙醯化一些non-histone蛋白质,从而控制自己的活动。如上所述,NF-κB, OV炎性转录因子激活gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,是受监管乙酰化作用。例如,乙酰化作用的Rel / NF-κB p65亚基(通过海关与边境保护局/ p300)增加其DNA结合亲和力,而由HDAC3脱乙酰作用促进绑定IκB-α和快速出口离原子核gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。像改变组蛋白乙酰化作用,这种机制可以解释肿瘤坏死因子表达的增加和MIP-2αTSA在目前的模型。gydF4y2Ba
相反,其他研究观察到抑制NF-κB核运输和p50 HDAC抑制剂丁酸二聚体活动gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba指向相反的方向,这将是一个可能解释这些发现il - 6。non-histone蛋白质的乙酰化作用也提出一个解释的镇压TSA鼠乳腺肿瘤病毒的存在和缺乏糖皮质激素gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba。此外,TSA诱导的基因表达的变化可能会改变随着时间的推移。在刺激N9小胶质细胞,TSA抑制il - 6分泌长达12 h,但增加在后来的时间点gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba。另一个选择是,hdac可能调节抗病诱导剂或细胞因子的转录抑制因子。gydF4y2Ba
对偶的细胞因子TSA的答案表明,基因被机汇是由不同的机制,这是符合先前的结论gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba。肿瘤坏死因子,增强了TSA控制肺部,可能与绝对必要的严格控制下转录因子绑定。MIP-2α转录由TSA增强,因此可能pre-stimulated在控制条件下,转录的优势只是阻碍hdac /帽子。il - 6很容易引起机汇,但与TNF和MIP-2αTSA的压抑。il - 6表达因此可能的控制下一个未知的抑制因子的转录是由改变帽子和HDAC之间的平衡。gydF4y2Ba
假设3:敏捷抑制炎症基因转录和表达依赖HDAC活性gydF4y2Ba
最近建议HDAC2-dependent GR的脱乙酰作用尤其相关解释NF-κB-dependent基因表达的衰减很低浓度的类固醇gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。TNF、il - 6和MIP-2αNF-κB-dependent基因,并通过这种途径在OV显然监管gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。然而,在目前的模型,TSA只倾向于反向类固醇减少MIP-2α和TNF生产(这只是统计上显著的转录MIP-2α在低浓度的类固醇)。这些发现支持,在整个器官水平,类固醇的抗炎作用的假设在一定程度上是由HDAC活性,至少对ventilation-induced TNF的表达和MIP-2α。然而,人们还清楚地发现,即使对这两种细胞因子,一个庞大而类固醇的抗炎作用的重要组成部分必须由HDAC-independent机制。除了前面讨论的机制,一个替代机制的类固醇可能下调炎性蛋白的表达的稳定他们的信使rna,作为cyclooxgenase-2显示gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba。这种机制是由一个adenine-uracil-rich元素的3′未翻译的基因区域gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba也出现在TNF和MIP-2α的信使rna。gydF4y2Ba
上面已经提到,类固醇的机制行动是最有可能的基因——cell-dependent。因此,事实上,大多数文章建立糖皮质激素之间的联系和hdac看着集落刺激因子和SLPI的表达gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba,不易引起OV(数据未显示),虽然当前作者检查了TNF, MIP-2α和il - 6可能占这些研究之间的一些差异,特别是降低il - 6表达和HDAC的规模小得多的角色在解释类固醇的抗炎作用。gydF4y2Ba
临床意义gydF4y2Ba
首先,对炎症性肺部疾病,恢复(茶碱)gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba和HDAC抑制被认为是可能的治疗方案gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。这种差异与本研究的一个结果是一致的:即,取决于基因,改变HDAC活性可能加剧(TNF, MIP-2α)或减少(il - 6)的炎症基因的表达。因此,炎症性疾病的治疗,目的是改变HDAC活性可能会产生复杂的结果,要谨慎对待。gydF4y2Ba
其次,减少HDAC2转录50% OV是造成潜在的临床意义。尽管在实验结束当前作者没有发现类似的反应HDAC蛋白表达,这可能是由于时间跨度孤立肺灌注。完整的如果肺HDAC蛋白质水平保持不变,并发基因表达和蛋白质降解。如果两个进程相对缓慢,降低蛋白质含量以响应基因表达下降可能不是可检测一段时间,因此超过孤立的器官的可行性。考虑到组蛋白脱乙酰作用在调节炎症反应的重要性,缺乏HDAC2可能改变炎症反应在机械通气后跨度为。然而,这需要进一步研究解决。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
总之,当前作者表明:1)研究组蛋白乙酰化和脱乙酰作用在完整的肺是可行的;2)大容量通风提高组蛋白乙酰化作用在特定的网站;3)抑制组蛋白去乙酰酶抑制剂增加组蛋白乙酰化作用,微分影响炎症基因的表达,增强一些(肿瘤坏死因子、巨噬细胞炎性protein-2)和减少他人(白细胞介素- 6);和4)类固醇可能修改overventilation-induced基因激活部分,但决不限于,招聘组蛋白脱乙酰酶的活动。因此,组蛋白去乙酰酶抑制剂似乎发挥重要gene-dependent监管ventilation-induced基因转录的调节作用,但需要说明的是,组蛋白并不是唯一的组蛋白脱乙酰酶同功酶的底物。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者欣然承认d·卡普的优秀的技术援助和k Viertmann(研究中心Borstel, Borstel,德国)。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2006年10月13日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2007年7月7日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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