摘要
白介素(IL)-13通过与IL-13受体结合在哮喘发病机制中发挥核心作用,IL-13受体是由IL-13受体α1亚基(IL- 13r α1)和IL- 4r α组成的异源二聚体。IL-13Rα1基因的遗传多样性(IL13RA1对Xq24染色体上的基因座进行了鉴定,并对已鉴定的多态性与哮喘和特异反应表型的关系进行了检测。
的启动子和编码区IL13RA1在341个患有哮喘的白人家庭(每个家庭至少有两个患有哮喘的兄弟姐妹)和182个非哮喘对照组的大队列中,对发现的多态性进行了基因分型。通过病例对照和传播不平衡试验分析确定遗传关联。
鉴定出两种常见的多态性,一种是新发现的胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变的核苷酸-281 (-281T>G)单核苷酸多态性IL13RA1启动子和前面所述的1365A>G变体IL13RA1近端3 '未平移区。没有发现-281T>G或1365A>G与哮喘或特异反应表型的风险有显著相关性,除了在-281T>G和1365A>G之间有提示性关联IL13RA1-281T/1365A单倍型可提高成年女性哮喘患者血清总免疫球蛋白E水平。
这些发现表明,白介素13受体α1亚基基因-281T>G和1365A>G多态性与哮喘易感或严重程度无关,尽管白介素13受体α1亚基基因位点可能参与控制免疫球蛋白E的产生。
2型t辅助细胞因子白细胞介素(IL)-13和IL-4通过多种机制在哮喘中发挥核心作用,包括诱导b细胞合成免疫球蛋白(Ig)E1,2,气道嗜酸性粒细胞增多3.杯状细胞化生和粘液分泌亢进4,5以及气道重塑6.IL-13引发其生物学效应通过一种由IL-13受体α1亚基(IL-13Rα1)和IL-4Rα组成的异二聚体蛋白复合物7.IL-13Rα1/IL-4Rα复合物也被IL-4用作替代受体,特别是在不表达共同γ链(IL-2Rγ)的非造血细胞中。8.根据Entrez基因数据库的数据9, IL-13Rα1基因(IL13RA1)映射到染色体Xq24。5 '的侧翼区域IL13RA1被发现同时缺乏TATA和CCAAT盒子,其预测的转录起始位点相对于起始密码子的-123个碱基对10.IL-13Rα1在造血细胞和非造血细胞上均有表达,包括嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、b细胞、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和气道上皮细胞11.IL-4和IL-13通过IL-4Rα/IL-13Rα1复合物的信号传导被认为是通过IL-4Rα发生的12,导致多个信号分子的激活,包括信号换能器和转录激活因子6以及胰岛素受体底物1和2,它们可以转运到细胞核,并与响应基因启动子区域的特定基序结合(如。主要组织相容性复合体II类,CD23, IgE种系转录本和IL-4Rα)13.
一些研究表明,遗传变异使用IL13,IL4而且IL4RA赋予过敏性反应和哮喘的易感性14.相比之下,只有两项关于基因多态性的关联研究IL13RA1患有哮喘和特异反应的基因15,16.艾哈迈德et al。15筛选的编码区域IL13RA1在日本人群中发现了一个罕见的胞嘧啶(C)到胸苷(T)的非氨基酸改变多态性(取代),位于相对于翻译起始密码子ATG的1050 (1050C>T)位置。由同一组调查人员进行的一项低权力关联研究发现,两者之间没有联系IL13RA11050C>T多态性与特应性哮喘。Heinzmannet al。16筛选了IL13RA1在英国和日本人群中发现了该基因,并确定了相对于翻译起始密码子ATG的1365位的腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的替换,位于该基因的近端3 '非翻译区(UTR),被目前的作者称为1398A>G。在同一项研究中,IL13RA1在英国人群中,1365A>G多态性与男性受试者血清总IgE水平升高有关。
基于IL-13/IL-4通路在特异反应和哮喘中的核心作用,假设遗传变异可能与哮喘发病有关IL13RA1可能倾向于发展和/或预测哮喘和特异反应的严重程度。为了验证这一假设,研究了基因的启动子、编码区和近端3 ' UTRIL13RA1对常见的遗传变异进行筛选。随后,通过病例对照分析、表型-基因型和表型-单倍型关联研究以及传递不平衡试验(TDT)等三种方法,对341个哮喘家庭和182个非哮喘对照组的大队列中鉴定的变异进行评估,以寻找与哮喘和特异反应表型相关的证据。这是一种新的等位变异IL13RA1的启动子和两个先前描述的单核苷酸多态性(SNPs)IL13RA1,以及两种常见变体的关联IL13RA1据报道,-281T>G和1365A>G具有哮喘和特异反应表型。
材料与方法
受试者及临床评估
从英国南安普顿地区招募了至少有两个亲生兄弟姐妹(5-21岁)的白人家庭(n = 341),目前医生诊断为哮喘,并定期服用哮喘药物(表1)⇓).临床表型基于病例报告表格和每个家庭成员在研究日访问时完成的健康调查问卷。该表格包括纳入和排除标准、人口统计学、病史、皮肤刺破数据、呼吸量数据、支气管挑战的挑战剂量水平、实验室样本的记录和过去12个月内所服用药物的信息。
成人哮喘被定义为对以下三个问题有积极反应:1)“你曾经患过哮喘吗?”;2)“医生确认了吗?”3)“在过去12个月内,您是否曾使用过治疗哮喘或任何呼吸问题的药物?”基线用力呼气量在一秒钟(FEV1)为肺功能测定所得。三个FEV1误差在5%以内,记录最高值。气道反应性定义为降低FEV所需的吸入乙酰胆碱浓度120% (PC20.),并根据美国胸科学会指南进行手术17,使用DeVilbiss 646喷雾器(Sunrise Medical, Inc, Carlbad, CA, USA)与计算机化系统(KoKo Digidoser;法拉利呼吸系统,路易斯维尔,CO,美国)。对以下六种常见的空气过敏原进行了皮肤点刺测试:混合草、混合树、猫、狗、Dermatophagoides pteronyssinus,和Alternaria(拜耳公司,Spokane, WA, USA),阴性(生理盐水)和阳性(组胺)对照。特异反应被定义为皮肤点刺试验结果阳性(伤口直径比对照组增加>3 mm)或特异性IgE升高(>0.35 kUA·L)−1)对一种或多种常见过敏原的反应。IBT实验室(Kansas, MO, USA)使用ImmunoCAP系统(Phadia, Uppsala,瑞典)进行了总IgE和特异性IgE测量。针对相同的过敏原测量特定的IgE水平,以进行皮肤点刺试验。总IgE按年龄进行调整sd远离每个年龄组的中位数。如前所述,生成过敏性反应和哮喘的严重程度评分18.此外,通过献血诊所从同一南安普顿地区招募了182名无个人或家族哮喘史的非哮喘成年人对照。南安普顿和西南汉普郡联合研究伦理委员会(Southampton, UK)批准了这项工作的伦理批准。
基因突变筛查
利用20名男性受试者(8名诊断为哮喘患者)和18名女性受试者(4名诊断为哮喘患者)的基因组DNA,提取了一段2.2 kb的DNA片段IL13RA1通过PCR生成启动子(对应于相对于翻译起始密码子ATG的核苷酸-1584-610)。由于该区域GC含量较高,组合为0.1 U·μL−1Taq (Sigma-Aldrich, Poole, UK)和0.0033 U·μL−1使用Pwo DNA聚合酶(Roche Applied Science, Lewes, UK)在Pwo缓冲液、5%二甲基亚砜(DMSO)、1.5 mM MgCl的存在下扩增基因组PCR模板(100 ng)2,每个引物0.2 μM(表2 .⇓)和0.2 mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs),含有脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)与7- deza -dGTP的3:1比例,以及荧光(R110)脱氧胞苷三磷酸(dCTP;应用生物系统公司(Applied Biosystems, Warrington, UK)与未标记的dCTP的比例为1:100,最终反应体积为50 μL。热循环包括在95°C下浸泡3分钟,然后在95°C下变性30秒,在63°C下退火30秒,在72°C下延伸2.5分钟,最后在PTC-225 DNA Engine Tetrad (MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA)上浸泡10分钟。的编码区突变筛选IL13RA1,长度约1.5 kb,根据制造商的说明,使用RNeasy血液试剂盒(Qiagen, Crawley, UK)从22名男性受试者(11名诊断为哮喘)和25名女性受试者(13名诊断为哮喘)的全血中提取总RNA。互补DNA (cDNA)使用Omniscript反向转录试剂盒(Qiagen)生成,按照制造商的指导使用2 μg RNA模板。为了提高PCR的产量,对编码区进行了优化IL13RA1被分为三个部分。第一段涵盖相对于翻译起始位点的核苷酸38-301,第二段238-1347和第三段889-1443。PCR涉及2 μL cDNA模板(来源于20 μL cDNA反应),Jumpstart Taq (0.025 U·μL−1;Sigma-Aldrich),标准PCR缓冲液MgCl2(表2⇓),每个引物0.2 μM(表2 .⇓)和0.2 mM dNTPs(包括固相化学裂解筛选段的荧光(R110) dCTP,与未标记的dCTP以1:100的比例),最终反应体积为20 μL。热循环包括在95°C下一次浸泡5分钟,然后在94°C下35次浸泡30秒,在表2所示的温度下退火30秒⇓扩展为60 s·kb−1最后,在72°C浸泡10分钟。段I体积小,采用变性高效液相色谱法(DHPLC;Transgenomic, Crewe, UK),而II和III片段是使用固相化学裂解筛选的,基本上与前面描述的一样19,20..阳性样品采用双脱氧染料终止剂循环测序(BigDye terminator Version 3.0;应用生物系统公司)的ABI PRISM 377 DNA测序仪(应用生物系统公司)。
基因分型
的IL13RA1-281T>G和1365A>G多态性采用四引物扩增难解突变系统PCR法进行基因分型(图1⇓)21.每次PCR反应总体积为15 μL,含模板DNA 25 ng, dNTP 0.2 mM, MgCl 2 mM2, 5% DMSO, Jumpstart Taq (0.05 U·μL−1)、底漆(每个内底漆涂15 μM,每个外底漆涂3 μM;表3⇓)和标准PCR缓冲液。两种多态性的PCR循环条件分别为95℃下5 min, 94℃下30 s, 73-n℃下30 s, 72℃下30 s,然后94℃下30 s, 63℃下30 s, 72℃下30 s,最后72℃下10 min。PCR产物采用微板阵列对角凝胶电泳进行解析22,用Vistra Green染色(Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK),并使用荧光成像仪595 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA)进行可视化。使用Phoretix 1D凝胶分析软件(非线性动力学,纽卡斯尔泰恩,英国)对基因型进行评分。具有代表性的基因分型结果通过ABI PRISM 377 DNA测序仪上的双脱氧染料终止物周期测序得到证实。
统计方法
病例对照分析
进行病例对照研究以评价两种疾病的相关性IL13RA1-281T>G和1365A>G与哮喘的多态性。所有的比较都是在同性组之间进行的,因为男性受试者是半合子的IL13RA1因为它位于X染色体上。病例组为:哮喘母亲(n = 100);哮喘父亲(n = 89);首先是患病的女性兄弟姐妹(n = 235);首先患病的是男性兄弟姐妹(n = 271)。对照人群为同一居住地区的健康白种人:女性(n = 98)和男性(n = 86;表1⇑).将每组病例的基因型频率与对照人群进行比较,并使用卡方检验进行分析。Hardy-Weinberg平衡是用一个自由度的卡方检验确定的。
表型-基因型和表型-单倍型关联研究
数据在四个哮喘队列中进行分析,包括第一个患有哮喘的女性兄弟姐妹,第一个患有哮喘的男性兄弟姐妹,诊断为哮喘的女性父母和诊断为哮喘的男性父母。对男性研究组使用非配对t检验,对女性研究组使用卡方检验,在将连续表型转化为类别表型后,对以下表型标记使用适当的分界点进行统计分析:1)总血清IgE(年龄校正和对数(以10为基数)转化以提高正常性);2) FEV1(预测值的百分比);3) FEV斜率1对乙酰胆碱的响应(转化为1/(最小二乘斜率+30)×1,000以改善正态性并避免负值);4)特异反应严重程度评分;5)哮喘严重程度评分。p值≤0.05被认为是显著的。
传动不平衡试验分析
协会IL13RA1采用TDT分析评估哮喘和哮喘中间表型的-281T>G和1365A>G多态性。任何p值<0.05被认为是显著的的测试。TDT法分析的二分式变量为:1)哮喘阳性问卷(即。正面回答上述三个问题);2)哮喘伴特异反应性(由特异性IgE水平升高和/或皮肤点刺试验阳性结果定义);3)血清总IgE水平升高的哮喘(年龄校正);4)哮喘和PC20.< 4 mg·毫升−1(严重的哮喘病患者);5)哮喘和PC20.≤16 mg·毫升−1.数据分析是基于第一个受感染的兄弟姐妹,因为传染给同一家庭中的其他兄弟姐妹并不是独立的。考虑到TDT使用的数据来自杂合子父母,只分析了母体传播,因为男性是半合子IL13RA1.还进行了单倍型构建和频率分布。
功率计算
TDT研究检测重要差异的能力是使用假设重组分数为0且不存在连锁不平衡的公式计算的23.事实上,唯一有信息的传播来自母亲,由于X染色体定位IL13RA1,是通过计算中给出的家庭数量翻倍来考虑的。病例-对照研究检测显著性差异的能力是使用考虑了alpha水平(0.05)、样本量、优势比(OR)和对照中多态性频率的程序计算的。
结果
多态识别
2.2 kb的突变扫描IL13RA1启动子在核苷酸位置-281(相对于ATG起始点-281T>G)发现了一个新的T - G替换(图2)⇓).编码区和近端3 ' UTR的筛选IL13RA1(约1.5 kb)揭示了先前描述的沉默变体在编码区1050位置的存在IL13RA1,涉及到C到T的替换15, 1050C>T,以及先前报道的位于近端3 ' UTR的1365位点的SNPIL13RA1,涉及到A到G的替换15, 1365A>G,原文描述为1398A>G(图2⇓)16.-281T>G的-281G等位基因在当前人群中相对丰富(患病女性同胞姐妹q = 0.37,患病男性同胞q = 0.34)。1365A>G的1365G等位基因在本队列中表现出较低的频率(男女患病兄弟姐妹q = 0.17)。的IL13RA11050C>T变异罕见,在本队列中等位基因频率为0.040。当使用卡方分析评估时,每组中等位基因的分布没有偏离Hardy-Weinberg平衡(数据未显示)。
连锁不平衡与单倍型结构
两者的单倍型频率IL13RA1在多个队列和成年女性哮喘患者中检测到多态性,发现-281T/1365A为0.67,-281T/1365G为0.17,-281G/1365A为0.16,而成年男性哮喘患者的多态性为-281T/1365A为0.67,-281T/1365G为0.165,-281G/1365A为0.165。在该群体中未发现-281G/1365G单倍型个体。连杆不平衡IL13RA1-281T>G和1365A>G通过测定r测定224.计算结果为0.406,这意味着其中一个snp的~ 40%的信息可以从另一个snp中获得,这表明核苷酸-281和1365上的snp之间存在中等程度的连锁不平衡。
遗传关联研究
病例对照分析
遗传关联IL13RA1多态性与哮喘在以下研究组中进行了评估:哮喘父亲(n = 89);首先患病的男性兄弟姐妹(n = 271);哮喘母亲(n = 100);首先患病的是女性兄弟姐妹(n = 235)与同性正常对照(n = 184)采用卡方分析。基因型和单倍型的分布IL13RA1-281T>G和1365A>G在哮喘受试者和正常对照组之间没有显著差异(数据未显示)。
表型-单倍型关联分析
在哮喘组,潜在的联系IL13RA1双等位基因单倍型和各种哮喘中间表型,包括血清总IgE水平,FEV1(% pred), FEV斜率1评估了哮喘父母和首次患病的兄弟姐妹对乙酰胆碱的反应、症状评分和特异反应严重程度评分。没有显著的相关性IL13RA1除了使用卡方检验(TA)在哮喘母亲中-281T/1365A单倍型和升高的血清总IgE水平之间存在临界相关性外,在任何研究组中都发现了哮喘的双等位基因单倍型和中间表型与TG单倍型:OR 2.81(95%可信区间(CI) 1.20-6.59);助教与GA单倍型:OR 1.07 (95% CI 0.50-2.28);p = 0.049;表4⇓).
表型-基因型关联分析
潜在的联系IL13RA1在患有哮喘的父母和首次发病的兄弟姐妹中,研究了-281T>G和1365A>G在哮喘中间表型中的多态性。在任何队列中,研究的不同基因型和表型之间没有观察到显著的关联(数据未显示)。
功率计算
该假说认为缺乏联想性IL13RA1-281T>G和1365A>G多态性单独与哮喘和哮喘的中间表型可能是由于本研究不足以检测真正的相关性。为IL13RA1-281T>G多态性,TDT幂次计算表明,在显著性水平为0.05和基因型风险比为2时,获得80%幂次所需的家系数为106,而在基因型风险比为1.5时,需要316个家系。对于1365A>G多态性,如果基因型风险比为2,获得80%功率所需的家族数为152,而如果基因型风险比为1.5,则需要474个家族。
病例对照研究的威力在第一个患病的女性兄弟姐妹组中进行了计算,就分析的等位基因数量而言,这是最丰富的研究组,而在哮喘父亲组中,这是最不丰富的研究组。在第一个受影响的女性兄弟姐妹(n = 470个等位基因)与女性对照进行比较,以确定-281T>G SNP与哮喘的相关性,该样本在检测OR为2时具有80%的幂次,在检测OR为1.5时具有35%的幂次。对于1365A>G多态性与首次发病的女性兄弟姐妹哮喘的相关性,OR为2时为65%,OR为1.5时为24%。比较哮喘父亲和对照组哮喘父亲中-281T>G变异的相关性(n = 89个等位基因),该样本检测OR为2的倍数为60%,检测OR为1.5的倍数为25%。对于哮喘父亲中1365A>G变异与哮喘的相关性,样本中OR为2的乘方为46%,OR为1.5的乘方为18%。
讨论
在本研究中,启动子,编码区和近端3 ' UTRIL13RA1对常见的遗传变异进行筛选。的新发现的多态性IL13RA1启动子-281T>G,以及之前描述的两个变体1050C>T15和1365 > G16进行了研究。通过病例对照研究和表型-基因型和表型-单倍型关联分析,以及基于家庭的方法,两种常见的IL13RA1研究了-281T>G和1365A>G与哮喘和特异反应表型相关的证据。没有证据支持这些变异与哮喘或其他特异反应表型的显著关联,除了在哮喘和哮喘之间存在边缘性关联IL13RA1-281T/1365A单倍型可提高成年女性哮喘患者血清总IgE水平。
的5 '侧翼区域SNP的发现IL13RA1,筛选了56条染色体,而在编码区IL13RA1,检查了47条X染色体。筛选的染色体数量为检测两个区域中等位频率为>0.05的常见snp提供了足够的能力。基因突变筛选IL13RA1是在健康和哮喘患者的队列中进行的,使用固相化学裂解和DHPLC,两者都被证明是非常敏感的突变检测方法19,20..
两种常见的IL13RA1发现-281T>G和1365A>G位点存在中度连锁不平衡(r2= 0.406)24.1365G等位基因的频率为0.17,与之前在英国人群中发现的频率相当16,但低于同一研究中在日本人群中发现的(~ 0.40)。在本队列中,罕见的1050C>T变异的等位基因频率为0.04,与之前在日本人群中发现的频率相当15.
两者都没有关联IL13RA1TDT或病例对照分析均发现-281T>G或1365A>G伴哮喘。1365A>G多态性与哮喘无相关性与Heinzmann的研究一致et al。16.此外,两等位基因单倍型均未与任何哮喘或特异反应表型相关IL13RA1-281T/1365A单倍型可提高成年女性哮喘患者血清总IgE水平。在本队列的其他研究组中,这种单倍型与血清总IgE水平缺乏相关性,可能是由于性别和年龄对过敏表现和血清总IgE水平有明显影响。研究发现,在6 -≥75岁的整个年龄范围内,男性血清总IgE的几何平均水平高于女性25.此外,血清总IgE水平在10-15岁时达到最大值,然后随着年龄的增长而显著下降,这可能是由于抑制t细胞活性的逐渐增加和胸腺的进行性萎缩25.尽管这些与性别和年龄有关的血清IgE总水平的影响可能解释了这一事实IL13RA1-281T/1365A单倍型和IgE水平升高仅在成年女性哮喘患者中观察到,应强调的是,这种关联是微小的,可能是偶然发生的。同样重要的是要注意,由于目前队列中的家庭是在哮喘的基础上招募的,因此没有哮喘的特应性个体太少,无法研究哮喘的影响IL13RA1单就特异反应而言的多态性。
在海因茨曼的研究中et al。16在英国男性中,1365A>G多态性(称为1398A>G)与血清总IgE水平升高有关,但与女性受试者无关16.他们的研究与本研究之间的差异可能是由于两个队列间特异反应严重程度和/或研究设计的差异。另外,Heinzmann的研究中没有评价-281T>G多态性et al。16.
功率计算表明,目前的TDT研究能够很好地检测ORs≥1.5的效应。病例对照研究对-281T>G的or≥2的检测能力足够(60-80%),对1365A>G的检测能力中等(46-56%),而该研究对两种多态性的效应量均<2的检测能力不足。检测重要关联的能力取决于关联的大小和感兴趣的等位基因的频率。在最近的一项对301项遗传关联研究的荟萃分析中,随访研究中大多数估计or在1.1-2.0之间26.在复杂疾病中,大多数真正的遗传关联可能表现出适度的影响,ORs为1.1-1.527.虽然这只能解释人群中1-8%的相对风险,但几种变异的加性效应可以构成可归因于遗传因素的总疾病风险的20-70%27.这凸显了招募更大的参与者群体以检测出略高的or的挑战。在本研究中,ORs <1.5的小影响可能被遗漏了。
的IL13RA11050C>T多态性位于密码子350的第3个核苷酸上,没有氨基酸改变,之前已经描述过15.在本研究中,由于本队列中小等位基因的频率非常低(~ 0.04),因此没有评估该多态性的相关性。-281T>G多态性IL13RA1启动子之前没有描述过。这种多态性可能在影响转录激活和基因产生方面具有功能性作用。进一步在体外这种多态性是否直接影响转录因子结合和转录率还需要进一步研究。
综上所述,我们对白介素-13受体α1亚基基因的5’侧区、编码区和近端3’非翻译区进行了突变筛选。鉴定出三个多态位点,包括启动子区域的一个新位点。白介素-13受体α1亚基基因的两种常见变体在一个大队列中进行了评估,除了-281胸腺嘧啶/1365腺嘌呤单倍型与成年女性哮喘患者血清免疫球蛋白E水平升高之间的临界相关性外,没有发现证据支持这些多态性与哮喘或其他特异反应表型的显著相关性。白介素-13受体α1亚基基因的变异是否在决定哮喘和特异反应的易感性或调节严重程度方面发挥作用,还需要在其他队列中进行进一步研究。
致谢
作者要感谢参与本研究的患者和家属。作者还感谢I. Day(英国南安普顿大学医学院人类遗传学学部)对该项目的支持。
- 收到了二六年二月十九日。
- 接受2007年3月14日。
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