文摘
删除(D) /插入(I)多态性基因内区16血管紧张素转换酶(ACE)基因的最大影响血清ACE水平白种人任何因素的发现。本研究的目的是建立新的王牌genotype-corrected正常范围血清ACE水平人口中欧起源。
体检后,159名健康白种人研究自愿献血。ACE基因型聚合酶链反应和血清ACE水平评估是决定使用两种不同的动力学测试。
分布的D /我ACE基因的多态性是依照哈迪温伯格平衡。血清ACE水平和ACE基因型显著相关,血清ACE水平最高的科目与ACE基因型D / D,与基因型和血清ACE水平最低的科目我/我(意味着±sd,试验1:D / D 59.3±15.1 U·L1D /我45.5±15.2 U·L1我/ 34.8±13.7 U·L1;实验2:D / D 43.7±14.1 U·L1D /我33.7±12.1 U·L1我/ 25.4±9.5 U·L1)。虽然他们给不同的血清ACE水平绝对值,两个测试的结果显著相关。
在结论中,作者建议使用新的,genotype-specific参考价值血清血管紧张素转换酶的水平,特别是提高检测的敏感性和特异性血管紧张素转换酶在结节病的后续。
血管紧张素转换酶(ACE);我dipeptidyl羧肽酶;酶委员会(EC) 3.4.15.1)是一种锌metalloproteases peptidyldipeptide水解酶属于类。它有一个重要的作用在血管活性的多肽的新陈代谢,将十肽血管紧张素I转换成主动八肽血管紧张素ⅱ,和血管舒张药肽血管舒缓激肽水解。ACE被发现在许多不同的细胞类型,包括神经细胞,肾近端小管细胞,内皮细胞和细胞monocyte-macrophage系统。它是附着在内皮表面膜锚定肽,可以发生裂解,导致其作为溶酶释放到血液循环1- - - - - -3。
血清ACE水平通常是未经治疗的患者中升高活跃的结节病4类固醇诱导性的,自发的或结节病可以通过降低血清ACE预示值5。因此,测量血清ACE在结节病的监测工具。然而,尽管血清ACE浓度测量时非常稳定反复在一个健康的人,有巨大的个人间的差异6。因此,广泛参考范围的血浆ACE水平阻碍了ACE值的解释在临床设置。Cambien等。7发现了类似的血清ACE浓度血缘家庭成员,这表明ACE水平受到遗传因素的影响。这是确认当删除(D) /插入(I) ACE基因的多态性8,后来定义精确的存在与否287 - bp ACE基因的DNA片段在基因内区16。据报道,这种多态性与≤28%的血清ACE水平的变化9,这取决于人口的种族背景检查。在一项研究中使用大型尼日利亚队列,考克斯et al。10报告说,33%的方差血清ACE水平取决于遗传变异,而19%用残余家族关系来解释10。然而,剩下的48%是依靠随机细化因素。
研究的D / ACE基因的多态性表明D等位基因与ACE活性增强有关,和较低的ACE I等位基因活动8,11。虽然利用D /我的想法多态提高血清ACE水平的临床价值并不新鲜,没有参考价值的定义已经指出,根据患者的ACE基因型8,12,13。
因此,本研究的目的是建立新的参考范围从德国健康受试者的血清ACE水平,依照他们的王牌D /我的基因型。
材料和方法
主题
在目前的研究中,159名健康成人从德国北部被白种人(53男:意味着±sd36.5±10.7岁,年龄18 - 61岁;106女:37.7±11.7岁,年龄19 - 64岁)。参与者被医院员工自愿献血后考试的职业医疗服务研究中心Borstel (Borstel,德国)。所有的受试者判断健康。他们没有服用任何药物。特别是,受试者被问及ACE抑制剂。所有的科目包括在这项研究否认等药物。从所有参与者获得知情同意。
DNA提取、PCR
DNA提取实际上静脉血液样本使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。我和D等位基因被确定相关的PCR扩增片段的基础上从16 ACE基因的基因内区,其次是大小通过凝胶电泳分离和可视化。
ACE基因的相关片段基因内区16 Rigat放大根据的方法et al。14如前所述,15。简单地说,DNA被放大在一个包含2.5毫米MgCl 25-µL混合物2,每个引物(5 pmol底漆1:TGG AGA GCC CCC ATC CTT TCT行动;引物2:广汽GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T;MWG-Biotech AG)、Ebersberg、德国),0.2毫米的脱氧核苷三磷酸(表达载体),0.5 U的Taq(表达载体)和2.5µL 10×PCR缓冲(表达载体)。PCR跑如下:5分钟在95°C初始变性;随后30周期30年代在94°C(变性),30年代在54°C(退火)和1分钟在72°C(扩展);紧随其后的是最后一个伸长的步骤在72°C 5分钟。D等位基因的存在导致了192个基点PCR产品,而我等位基因导致了479个基点PCR产品。由于优惠放大D等位基因的杂合的样品,所有样品发现D / D基因型包含在第二个insertion-specific PCR(底漆1:TGG广汽CAC AGC GCC公司治理文化CAC TAC;引物2:TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA;MWG-Biotech AG)。 The reaction buffer differed from the previous reaction in that it contained 5% DMSO (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) and 1.5 mM MgCl2。PCR条件如下:5分钟在95°C初始变性;其次是30周期30年代在94°C, 45在62°C和40年代在72°C;紧随其后的是最后一个伸长的步骤在72°C 5分钟。I等位基因的存在导致了335个基点PCR产品,而对于样品纯合子的D / D没有产品能被探测到16,17。
实时PCR进行20µL智商SYBR绿色Supermix(美国Bio-Rad大力神,CA)包含5 pmol每个引物,如上所述,和5 ng DNA。PCR是运行在一个三步协议在95°C, 57°C和72°C的智商实时检测系统(Bio-Rad)。45个周期后,融化曲线采用温度增加了0.2°C·10年代1就开始了。
血清ACE测量
血清ACE决心光度计的由两个不同的商用动力学测试,从Buhlmann实验室购买AG(瑞士Allschwil;分析1)和从三一生物技术(布雷,爱尔兰;试验2)。测试执行根据制造商的指示。ACE催化作用的hydrolysation合成物质N - [3 - (2-furyl)丙烯酰]-L-phenylalanylglycylglycine(实验1)4,18或hippuryl-L-histidyl-L-leucine(实验2)19。这种水解导致吸光度下降在340海里,这是测量在两个测试。
统计方法
数据意味着±sd。ACE基因型和血清ACE水平之间的相关性进行了分析使用方差分析测试。相关性估计使用关联矩阵和费舍尔的r - z事后测试和巴特利特球形的测试。两组比较,p值< 0.05被认为是具有统计学意义。为多个比较,假定值被纠正的组(0.5 / (n - 1))。不同基因型频率在当前研究小组和期望频率计算的哈代和温伯格定律估计使用卡方测试。
结果
ACE基因型的分布
在所有情况下,最初的PCR是成功的。由于长度的区别,我在D /等位基因带我的基因型是弱于D等位基因带(图1⇓)。因此,明显的D / D病例进一步研究采用insertion-specific底漆。该协议保证,在任何情况下正确的确定基因型。没有一个产品在这第二个PCR反应证实了D / D表型。常规PCR的结果符合结果的实时PCR(图1 b⇓)。
纯合基因型D / D出现在29.6%的受试者在目前的研究中,24.5%的人我/基因型纯合,和45.9%的受试者杂合的基因型D /我。基因型的分布是按照哈迪温伯格平衡(基因型频率0.30;0.46;0.24 D / D, D /我/我,分别)。
基因型频率之间没有明显差异在男性和女性之间。
血清ACE水平对ACE基因型
总体平均血清ACE水平检测化验2为34.6±13.8 U·L1(图2⇓)。基于这些结果,正常范围上限的血清ACE水平的62 U·L1计算了。这是完全由制造商提供的价值。总体平均血清ACE水平检测化验1为47.0±17.3 U·L1,导致一个正常范围值的上限81 U·L1,这是接近公司提供的值(79 U·L1)。这么高重现性的上限表明当前队列中选择适合的个人研究,因为他们像军团最初用于建立阈值。
使用试验2:在受试者平均血清ACE基因型D / D为43.7±14.1 U·L1;在这些基因型D /我,意思是血清ACE 33.7±12.1 U·L1;我/我在那些基因型,平均血清ACE为25.4±9.5 U·L1。使用试验1:在受试者平均血清ACE基因型D / D为59.3±15.1 U·L1;在这些基因型D /我,意思是血清ACE 45.5±15.2 U·L1;我/我在那些基因型,平均血清ACE为34.8±13.7 U·L1。不管使用测试工具,有一个非常重要的ACE基因型与血清水平之间的相关性,由方差分析(p < 0.0001)。ACE浓度的分布分析显示值的高斯分布这三个基因型。由于正态分布的ACE基因型的浓度和哈迪温伯格平衡,没有额外的统计分析,如申请基因型没有遵循哈迪温伯格平衡或其频率不是正态分布,进行。
表1⇓显示了置信区间(平均1.96±95%sd每个基因型)的血清ACE水平,提出新的临床参考区间血清ACE水平。当使用试验2,上层参考水平的71 U·L1建议为个人与基因型D / D, 57 U·L的上限1对于那些基因型D /我和上层44 U·L的参考价值1我/我对那些基因型。分析1,上参考水平的89 U·L175 U·L1和62 U·L1建议为个人与基因型D / D, D /我和我/。这些值差别很大从那些描述整个队列,不纠正基因型(试验1:79 U·L1;实验2:62 U·L1)。
年龄和性别对血清ACE水平
之间没有相关血清ACE水平和年龄在本研究群体中,不管测试工作。
有趣的是,实验1的结果表明,男性血清ACE水平要明显高于女性(51.4 U·L1与45 U·L1分别;p < 0.05)。这种差异是由试验未显示2 (36.6 U·L1与33.8 U·L1分别;不显著)。当结果被基因型分解,男女差异明显只有在个人与D /我的基因型。有趣的是,这种差异是由两个试验1所示(男:52.5 U·L1;女:41.6 U·L1;p < 0.005),试验2(男:38.6 U·L1;女:30.8 U·L1;p < 0.005)。
相关的血清ACE水平检测的两个包就业
血清ACE水平在159年样本测量使用ACE测试套件。血清ACE水平有显著相关性检测的两种方法(p < 0.0001, r = 0.8;图3⇓)。
临床意义
图4⇓显示的例子,每个基因型的血清ACE结节病的患者。大多数信息是病人(基因型我/我;图1一个⇑)。成功的治疗后,患者的ACE水平第一天是正常的。在129年的一天,然而,病人患有恶化需要皮质类固醇治疗。不过,仍然维持血清ACE的正常范围内。然而,使用修正后的范围我/我基因型透露病人的血清ACE水平实际上是高架在恶化。达到缓解后,正常价值再次被观察到。因此,肉芽肿改变负担没有透露其发病的相关性未调整的参考价值。
患者B(基因型D /我;图4 b⇑),genotype-corrected值是不相关的。在第280天,患者血清ACE活性增加,而所有其他天血清ACE水平在正常范围内,无论genotype-corrected值。然而,基因型修正导致较低的阈值,排除任何该导致更高的特异性和灵敏度的测试。未修正的价值观的基础上,患者C(基因型D / D;图4摄氏度⇑)似乎增加了血清ACE活性在每一个时间点,尽管在第一天缓解。基于genotype-corrected值、血清ACE在第一天是在正常范围内,而在另跨度为这个病人水平升高,这是按照疾病进展。6周后疾病复发是显而易见的。
讨论
在目前的研究中,一种密切的相关性D /我在ACE基因多态性与血清ACE水平在一个健康的白人人口来自德国,一直在人群前面描述的其他来源8,11。最高的血清ACE水平被发现对象的纯合基因型D / D,紧随其后的是那些杂合的基因型D /我。血清ACE水平最低的受试者中发现了我/我的纯合基因型。基于这些数据,新的参考区间血清ACE水平建议(表1⇑),在accound患者的基因型。
D /我多态性位于nontranscribed ACE基因(基因内区16)的一部分。在一项研究中使用有一大群人从尼日利亚,朱et al。20.证明,而不是D /我多态性本身,一个单核苷酸多态性(SNP)外显子17 (a / G)和一个额外的SNP在上游翻译区(5 ' utr;A / T)负责血清ACE活性的变化20.。在尼日利亚队列,考克斯et al。10建立了一组9个单由四个不同的单核苷酸多态性覆盖80%的观察队列。关于血清ACE水平,其中五个单透露一个很小的置信区间。因此,利用单的可能性,而不是D /我独自多态性,在文献中讨论。然而,白种人的情况完全不同。种群内的非洲起源,发现各种各样的多态性,血清ACE水平并不与D /我多态性21。然而,在白种人,有八个不同的单(严重),只有三个单覆盖90%的观察22。此外,这些单表现出强烈的连锁不平衡。因此,分析D /我多态性而不是多个SNP分析是一个简单和可靠的近似和被认为镜子功能17外显子的SNP。此外,简单的方法使其在日常工作使用。然而,新参考间隔建议在这个工作不能简单地适应其他非白种人群。
目前的数据表明,使用参考范围由制造商没有给出关于血清ACE水平的基因型可能会导致误解。正常血清ACE水平可能认为,错误地,高架在主题与ACE基因型D / D,而血清ACE水平升高患者的ACE基因I /我可能错误地解释为正常。制造商建议的目前工作上的正常限制似乎只适合主题的杂合的ACE基因型D /我(试验1:68 U·L1;实验2:52 U·L1)。此外,由于平均血清ACE水平在异构人口取决于三个基因型的频率在这个人口的参考价值应调整根据D /我基因型的频率分布。使用genotype-related参考水平,建议在当前的研究中,更准确的解释血清ACE水平将成为可能。此外,由于参考水平建立一个特殊的基因定义分组人口,人口作为一个整体的遗传组成并不影响参考价值,这可能因此白人血统的适用于所有人群。
尽管当前数据的统计分析表明,血清ACE水平也取决于性(至少使用分析1),这种差异并不明显D / D和I /我的基因型。在D /我群体中,男性和女性的区别是11 U·L1(试验1)或8 U·L1(实验2)。它是为男性和女性可能引用值,至少在D /我的基因型,可能是有帮助的。因为女性在本研究队列过多,偏向于较低的参考价值在D /我基因型不能排除。然而,纠正性别比例显示不同的引用值< 3 U·L1在临床常规,这可能是微不足道的。
临床证明的例子如图4所示⇑,最重要的变化将出现在纯合子基因型,因为纠正和未修正的上限之间的差异最大。在D /我的基因型,上层不大大不同。有趣的是,在病人(图。4⇑),genotype-corrected值表明ACE水平增加兼容这个病人的临床情况恶化,而并没有透露这门课的价值。从初步迹象,目前的作者相信genotype-corrected限制包含更多的信息。
ACE基因型之间的密切关系和血清ACE水平曾被描述8,12,23。由于使用不同的nonstandardised ACE检测方法,这些研究中描述的血清ACE水平不能与对方相比,和参考范围需要为每个人建立测试13。在当前的研究中,两个最常使用的实验室检测血清ACE水平。尽管之间的显著相关性被发现血清ACE水平测试,检测到的绝对的值不同。因此,ACE参考区间提出在当前的研究中只能申请其中一个化验检测,对个人的白人血统。实验室使用其他系统和化学反应需要建立自己的参考人口和genotype-corrected参考价值。
到目前为止,对血清血管紧张素转换酶水平在结节病病人的临床监测困难。与先前的报告显示海拔结节病血清血管紧张素转换酶的水平4,它早就知道患者积极和进步的结节病也可以有正常或略升高血清血管紧张素转换酶的水平24- - - - - -26。此外,肉质的患者血清血管紧张素转换酶的预后价值一直是有争议的。一些调查表明,在治疗血清血管紧张素转换酶水平降低,增加并行复发5,24,其他的找不到预后信息结节病的患者的血清血管紧张素转换酶的水平25- - - - - -29日。因此,一个人的解释方法血清血管紧张素转换酶水平已经建议,考虑到个别病人的血清血管紧张素转换酶水平的趋势,而不是它的绝对值24。使用genotype-corrected参考价值,介绍了在目前的研究中,将产生更高的敏感性和特异性血清血管紧张素转换酶的解释水平。当前示例说明,敏感性的增加使用genotype-corrected参考水平允许“增加”的分化和正常血清血管紧张素转换酶水平平行的病人的临床过程。然而,准确的获得在敏感性和特异性仍然需要成立于大结节病的患者的后续研究。基于当前数据,目前的作者建议使用新的genotype-specific参考价值血清血管紧张素转换酶的水平。白人血统的那些照顾患者的实验室和使用两个包中的一个测试可以使用这些genotype-corrected正常范围。
- 收到了2006年4月11日。
- 接受2006年10月2日。
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