文摘
之前的研究表明,微卫星DNA (MS)不稳定(MSI)检测在痰液细胞在慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘。本研究的目的是调查是否哮喘和慢性阻塞性肺病女士可以在DNA水平。
DNA提取痰细胞和白细胞从63名慢性阻塞性肺病患者60 non-COPD吸烟者,36个哮喘患者和30名健康非吸烟者。十个标记位于染色体2 p女士5 q, 6 p, q十问,13,14和17 q进行了分析。
没有检测到MSI non-COPD吸烟者或不吸烟者健康。的比例明显高于慢性阻塞性肺病患者表现出MSI(49.2%)相比,哮喘患者(22.2%)。MSI检测甚至在慢性阻塞性肺病的轻微的阶段(33.3%)和哮喘(22.2%)。没有发现MSI和慢性阻塞性肺病严重程度之间的关系。最常受影响的标志是D14S588哮喘在慢性阻塞性肺病(17.5%,2.7%)。标记D6S344, G29802 D13S71只改变出现在慢性阻塞性肺病,G29802与显著降低一秒钟用力呼气量FEV1预测(%),而在D6S344 MSI FEV显著升高1(% pred)。
微卫星不稳定性较高的频率比哮喘,慢性阻塞性肺病和微卫星不稳定性在三个工人显示慢性阻塞性肺疾病特异性。然而,还需要进一步的研究来证实慢性阻塞性肺疾病和哮喘之间的差异在微卫星的水平。
哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)被认为是常见的呼吸道疾病遗传易感性和环境因素的相互作用所致1。慢性阻塞性肺病是一种可预防和可治疗的疾病状态的特点是不完全可逆的气流限制,主要是由吸烟引起的2。然而,一些吸烟者发展临床相关的慢性阻塞性肺病,这表明基因的易感性。严重的α1抗胰蛋白酶缺乏症是唯一证明慢性阻塞性肺病的遗传风险因素;但是,它存在于只有1 - 2%的慢性阻塞性肺病患者3,4。最近,连杆和候选基因在慢性阻塞性肺病的研究表明许多候选基因参与了COPD发病机理4- - - - - -6。
此外,哮喘是一种气道的慢性炎性疾病,伴有气道高反应性、复发性症状和可逆的气流限制。宿主和环境因素可能影响哮喘的发展7。最近的研究表明,有许多基因影响中度哮喘的发病机制,而不是几个主要的。染色体区域可能港口哮喘易感性基因已经被鉴定8- - - - - -10。
微卫星DNA (MSs)是一个最丰富的类的分散在真核基因组和基因间重复序列的最小重复单元组成(通常)包含一个到五个碱基对。这些序列在人类高度多态和作为人类的识别标记或血统分析11。许多研究表明,MSs基因组稳定很重要,可以影响酶控制细胞周期,可能会明显改变转录活动,或此种能力,最后,可以影响基因的翻译12- - - - - -14。其丰度和各种功能和效果与突变速率很高,而在编码基因点突变位点的利率。女士不稳定性(MSI)主要是表现为重复单位的数量的变化,而且,因其相关性高突变率,报道之前,已经成为一个有用的遗传工具识别地区潜在的基因改变。此外,MSI的体细胞强烈建议缺陷蜂窝系统保持遗传信息15。
之前的研究表明,基因改变在女士标记,包括MSI,曾被观察到在几个人类恶性条件16- - - - - -18和良性的疾病,如光化性角化病、翼状胬肉,糖尿病性视网膜病变,动脉粥样硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病、结节病、特发性肺纤维化和风湿性关节炎19- - - - - -22。
最近的研究表明,体细胞基因改变,如MSI,痰液细胞中检测到的现象在慢性阻塞性肺病23,24和哮喘病人25。建议MSI可能被认为是一个有用的遗传易感性的标志,表明基因组的不稳定的在不同的位点23- - - - - -25。
本研究的目的是调查是否有任何特异标记女士会允许区分哮喘和慢性阻塞性肺病,,其次,MSI是否可以作为遗传筛查工具进一步识别染色体区域窝藏易感基因。这项研究的结果支持假设。
方法
主题
共有166名受试者进行了研究;63名慢性阻塞性肺病患者(平均±sd年龄68±10年),60 non-COPD吸烟者(年龄59±15岁),36岁哮喘患者(50岁±12岁)和30名正常受试者(年龄56±17岁)被纳入研究。COPD组,吸烟史透露17当前和46人。哮喘患者和正常受试者不吸烟者。
美国胸科学会/欧洲呼吸学会共识声明188bet官网地址2用于慢性阻塞性肺病的诊断和严重程度的评估,和全球倡议哮喘指南吗7哮喘患者。任何上呼吸道感染患者在前6周的研究,以及那些历史的肺(或其他)癌症,被排除在本研究之外。non-COPD吸烟者显示正常体检和胸部x线摄影的结果,和他们的肺量测定的值在正常范围内。正常受试者nonasthmatic, nonatopic不接收任何药物(如表1⇓)。
肺量测定法
肺量测定法,包括bronchodilation测试,执行在所有受试者使用一个计算机化的系统(MasterLab 2.12;Jaeger,德国维尔茨堡)根据标准化指南26。
痰诱导
痰是诱导通过高渗盐水雾化吸入,由超声波nebuliser (Ultraneb 2000;美国DeVilbiss,萨默塞特郡PA),根据标准方法27- - - - - -30.。详细,三个呼气演习进行15分钟后吸入200μg舒喘灵和最高的价值是作为基线FEV1。主题然后吸入三个时期的食盐水气溶胶7分钟。每次吸入后流进行演习。然后鼓励咳嗽和咳出痰痰到无菌塑料容器,这是保存在冰。过程终止后7分钟的三个时期,如果足够优质的痰样本,FEV在下降1从基线≥20%或如果麻烦的症状发生。的半流体的部分吐唾液样本分开的痰如前所述31日。
DNA提取
MSI的存在在痰液细胞相比,DNA来自外周白细胞从同一个人了。
DNA提取是根据标准协议(QIAmp DNA血液马克西和迷你包;美国试剂盒,Inc .,瓦伦西亚,CA)。DNA样本存储在-20°C。
微卫星标记和微卫星不稳定性分析
十多态标记被用来评估女士MSI (G29802、RH70958 D17S250, D5S207, D13S71, D14S588, D14S292, D6S2223, D6S263和D6S344)。所有标记之前被证明是靠近基因参与哮喘或慢性阻塞性肺病23,32- - - - - -39。女士的序列标记提供了通过使用国家生物技术信息中心数据库40。PCR技术是用来放大DNA序列。在决赛50-μL进行PCR扩增反应混合物体积在ptc - 100热循环(M.J.研究,Inc .,水城,妈,美国),使用试剂盒TaqPCR核心设备(试剂盒,Inc .)。正向引物被贴上LI-COR IR800荧光染料(美国东北LI-COR,林肯)。下面的热循环协议应用:3分钟在94°C,紧随其后的是30周期在94°C 30年代,55°C 30年代,72°C 30年代和72°C 5分钟,在4°C和终止。
PCR电泳分析和视觉效果的产品8%长Ranger聚丙烯酰胺(BMA,大我,美国)/ 7 M尿素测序凝胶LI-COR 4200 DNA定序器,大小和等位基因是使用GeneProfiler 3.54版本软件(位于马里兰州Rockville Scanalytics、BS生物科学,美国)。MSI电泳模式被确定通过比较痰对外周血DNA标记女士的示威转变的一个或两个等位基因,从而确定新的等位基因,显示的添加或删除一个或多个重复单元。两位科学家不知道受试者的临床特点进行独立阅读。所有MSI-positive使用新鲜的DNA样本测试两次,并显示100%的再现性。
统计分析
的正常使用Kolmogorov-Smirnov测试数值参数进行了测试。通常一个未配对t检验和Mann-Whitney测试为非正态分布的数据被用来估计两组之间的显著差异。方差分析对正常和克鲁斯卡尔-沃利斯检验为非正态分布的变量被用来比较不同组(慢性阻塞性肺病吸烟者,non-COPD吸烟者,哮喘病患者和正常人)。卡方测试被用于比较的百分比(耶茨的测试)。皮尔逊相关系数的一般和枪兵的ρ为非正态分布的变量被用来分配重要关系。多变量分析来检查相关协变量的影响,如吸烟严重程度,与MSI和调整的重要关联。的假定值< 0.05被认为是显著的。
道德
本研究通过大学总医院医学研究伦理委员会(于西元、希腊)和患者把他们的知情同意。
结果
表1⇑显示了人体测量特征和COPD患者的肺量测定的数据non-COPD吸烟者,哮喘病患者和正常人。慢性阻塞性肺病患者介绍组根据疾病的严重程度2。图1⇓显示女士的代表性样本DNA稳定性(MSS),以及MSI D6S344标记。样本取自non-COPD吸烟者和正常人没有MSI的10 MS标记测试。女士标记、染色体位置和结果在COPD患者中,哮喘,non-COPD吸烟者和正常的对象如表2所示⇓。的比例明显高于慢性阻塞性肺病患者痰液细胞MSI展出与血液样本与哮喘患者相比(31 (49.2%)与8(22.2%)哮喘患者(p = 0.01;卡方测试)。多个标记的MSI检测同一个人在31 COPD患者(50 MSI)。详细,23名慢性阻塞性肺病患者表现出MSI在一个标志,四个在两个标记和四个病人超过三个标记。除了一个哮喘,在两个标记显示不稳定,所有的其他患者(7)显示不稳定在一个标记。
积极的测试是最频繁的标记D14S588在哮喘(慢性阻塞性肺病的17.5%和2.7% (p = 0.06;Yates-corrected卡方测试)。D6S344, G29802 D13S71显示,频繁的积极性,但是只有在慢性阻塞性肺病,然而D6S2223积极在只有一个患者COPD和哮喘。没有标记显示特异性哮喘(表2⇑)。图2⇓显示了四个COPD MSI-positive病例的比例严重程度分类根据全球倡议对慢性阻塞性肺疾病的指导方针2和哮喘。MSI是一个频繁观察甚至轻微的慢性阻塞性肺病组(33.3%;图2⇓)。慢性阻塞性肺病的严重程度不相关的MSI的频率,因为没有显著不同百分比的MSI被发现在各种慢性阻塞性肺病患者严重程度组(卡方测试;图2⇓)。此外,没有明显的关系被发现在一秒用力呼气量(FEV1;%的预测价值)在慢性阻塞性肺病总人口和MSI频率(p = 0.5, r2= 0.006;斯皮尔曼的ρ)。
图3⇓显示了FEV的差异1(% pred)之间的慢性阻塞性肺病的患者表现出在标记G29802 MSI, D6S344 D13S71和那些没有。FEV显著下降1(% pred)观察慢性阻塞性肺病患者之间的MSI标记G29802 (Mann-Whitney测试)。使用多变量分析吸烟的影响研究,以作为因变量的MSI和独立变量,FEV1(% pred)和吸烟的严重性。吸烟的严重性和FEV1(% pred)与MSI在G29802显著相关。吸烟严重程度比FEV更紧密地与MSI呈正相关1(% pred) G29802 (p = 0.04)。使用相同的多变量模型调整后吸烟的严重性,MSI G29802依然重要的存在与FEV下降1(% pred;p = 0.02)。相比之下,MSI D6S344测试FEV显著升高1(% pred;p = 0.01)。FEV无显著差异1(% pred)被发现在患者和没有D13S71 MSI (p = 0.5;Mann-Whitney测试;图3⇓)。
讨论
众所周知,哮喘与慢性阻塞性肺病共享常见的临床和实验室特点,在某些情况下做出鉴别诊断非常困难。在痰液细胞,这两种疾病的遗传背景调查在DNA水平上,女士为了找出慢性阻塞性肺病是否可以区别于哮喘。
本研究的一个限制是识别特定的痰液细胞亚群展览MSI (s)。目前的研究进展表明,没有找到MSI的细胞造血的起源、上皮细胞作为最有可能的候选人41。这可能是在协议与上皮细胞的潜在的重要作用在COPD的发病机制33,42。本研究的另一个限制是女士的少量(10)标记测试。然而,这是第一个研究比较哮喘和慢性阻塞性肺病女士在DNA水平,因此调查开始,只有数量有限的特定标记。
目前的结果显示,49.2%的慢性阻塞性肺病患者和只有22.2%的哮喘患者表现出MSI (p = 0.01)。这些结果说明不同的两种疾病的MSI文件。
这种差异的一个可能的解释是氧化应激的负担,破坏DNA并促进MSI是不同的两种疾病。几项研究已经报道,氧化应激在慢性阻塞性肺病的大小大于,在哮喘43- - - - - -49。类似的研究结果报道在类风湿性关节炎患者中,氧化应激与MSI在滑膜组织的是谁32。作者认为氧化应激不仅创造了DNA加合物的潜在诱变还放松限制DNA损伤的机制,通过抑制DNA错配修复系统的关键基因50。因此不同的DNA修复的效率可能被视为疾病易感性的一个潜在的决定因素。目前的结果与假设一致获得体细胞突变引起的烟是慢性阻塞性肺病的分子发病机制的根本因素33。
三个标记,即D6S344 G29802,和D13S71经常改变在慢性阻塞性肺病而不是在哮喘(表2⇑)。这表明,这些显然COPD-specific标记可以区分COPD和哮喘。此外,慢性阻塞性肺病患者表现出MSI D6S344显示更高意味着FEV1(% pred)比显示海量存储系统(MSS)中。这可能表明一个保护作用的MSI D6S344 COPD恶化或严重性。标记D6S344位于染色体区域6 p25、蛋白酶抑制剂(PI) 6和9也51。这些成员serpin总科已经被清除泄漏显示,防止细胞损伤溶酶体蛋白酶52。高FEV1在慢性阻塞性肺病与D6S344 MSI可能表明,观察到的MSI可能导致upregulation PI-9基因。类似的建议已经提出在自身免疫性疾病,移植排斥和贪污与宿主疾病53。
MSI与G29802标记与综合了更严重的COPD患者肺功能下降(图2所示⇑)。此外,积极在G29802标记吸烟强度有关。因此,这可能表明由于吸烟获得体细胞突变32。这个标志是位于染色体位置10的时候,穿孔素编码。穿孔素被认为是细胞毒性的主要中介membranolytic行动CD8 +淋巴细胞和凋亡有牵连和破坏性的过程导致慢性阻塞性肺病的发展29日。因此,考虑到低FEV1慢性阻塞性肺病的患者显示G29802 MSI,它可能提出穿孔素表达可能会增加在这些患者。
MSI即使在检测到轻微的慢性阻塞性肺病,FEV1≥80%。因此,MSI似乎是一个非常早期的DNA的改变。MSI的患病率在四组之间没有显著性差异的COPD患者,以及FEV之间没有关系1(% pred)和慢性阻塞性肺病MSI频率。这表明,MSI是一个质的改变。这与先前的报道是一致的Siafakas和同事23,30.和Paraskakiset al。24。此外,它将调查感兴趣的MSI在中度和重度哮喘,因为之前的研究表明,更高频率的基因改变(三个以上)相关意味着免疫球蛋白E和血液嗜酸性粒细胞水平较高的哮喘病人24。
总之,目前的结果表明,有COPD-specific标记在染色体区域6 p25女士10的时候,13问。MSI的存在并不是与慢性阻塞性肺病严重程度有关。然而,一个协会之间发现了两种不同的标记和FEV女士1。D6S344标记似乎揭示轨迹COPD发病机制有效的保护作用,而G29802相反。然而,从目前的结果,我们无法推断女士DNA本身起着保护或促进剂在COPD的发病机制中的作用。然而,先前的研究表明,基因组中海量存储系统(MSs)中发挥功能作用,影响基因表达作为监管序列可以被转录因子15。目前的结果是符合这一假说,这给女士的DNA功能作用。目前作者推测,海量存储系统(MSs)中充当盾牌,保护DNA免受环境危害。检测基因改变在女士DNA水平可能是一个有用的技术在识别潜在改变基因的位点可能在疾病发病机理中发挥关键作用。因此,MSI可能是一个有用的遗传筛查工具在分子流行病学,确定吸烟者容易慢性阻塞性肺病或特应性个体容易患哮喘。
由于小数量的标记检查,目前的结果需要在进一步的研究证实不同种族人群不仅(希腊人),需要多中心协作。最后,目前的发现强调研究疾病有关的基因标记的重要性。
- 收到了2005年11月1日。
- 接受2006年4月21日。
- ©人期刊有限公司