摘要
本研究旨在通过监测呼出过氧化氢H的水平来评估化疗期间差异白细胞耗竭的影响2O2而一氧化氮(F伊诺)礼物。
在39例肺癌患者(慢性阻塞性肺疾病至II期,一秒钟中位用力呼气量78%预测)中,在一个治疗周期(第1天)前进行测量,在该周期中至少测量一次(第8天:n = 34;第15天:n = 19),之后(第21-29天)。
H水平有显著变化2O2,F伊诺以及外周血细胞的差异。H的水平2O2仅在第15天下降,中位数(上下四分位数之间的差异)下降31(57)%,而F伊诺仅在第8天降低22(40)%。中性粒细胞数量在第8天保持不变,在第15天减少了59(48)%,而单核细胞数量在第8天减少了87(39)%。在第21-29天,数值恢复到基线。
结合先前的发现,呼出的过氧化氢水平和中性粒细胞计数的平行过程表明,呼出的过氧化氢的主要部分是中性粒细胞通过传导气道。相反,呼出的一氧化氮的产生似乎主要与单核细胞有关。
过氧化氢(H2O2在过去的15年里,呼气凝结物(EBC)中被用作气道炎症的标志1。H水平升高2O2在慢性阻塞性肺病(COPD)中发现2- - - - - -4,支气管扩张5、哮喘6- - - - - -9、肺炎10囊性纤维化11这些水平对抗炎有反应12- - - - - -14,抗生素11或者抗氧化干预15,16。H的流量依赖性2O2水平表明,传导气道是产生呼出H的主要部位2O217。此外,还有一种观点认为,呼出的H的重要细胞来源2O2可能是中性粒细胞,这与COPD的疾病严重程度相关2或者支气管扩张的结果5。然而,已知炎症性气道疾病与各种细胞类型的激活有关。这给呼出的H的归属带来了一些困难2O2通过在不同严重程度的疾病中基线值的相关性来确定特定的细胞类型。同样,抗氧化或抗炎干预措施可能发挥相当广泛的作用。在健康受试者中,有关H .的细胞来源的更具体证据2O2是由H2O2以及嗜中性粒细胞的能力18或吞噬细胞19激活:被激活
在此基础上,研究人员探索了以更有选择性或差异的方式对各种细胞类型产生影响的方法。此外,轻度至中度炎症性气道疾病患者可能比严重疾病患者表现出更稳定的细胞活动模式,并且使用干预和纵向分析的试验将使患者的特征在测量之间保持可比性。众所周知,对白细胞数量的主要影响是由化疗引起的,如用于肺癌的治疗。不同类型的细胞受到不同的影响,但对中性粒细胞的影响是最主要的,甚至可以达到临床上显著的中性粒细胞减少状态。
因此,本文作者测量了呼出H2O2在接受肺癌化疗的患者中评估其水平是否会与外周血中性粒细胞数量平行变化。在化疗前、化疗期间和化疗后至少进行一次测量。作为比较,部分呼出一氧化氮(F伊诺)亦已确定。
研究对象与方法
病人
39名参与者没有哮喘,COPD最多为II期20.从连续接受肺癌化疗的患者中招募(表1⇓)。10例患者为全球慢性阻塞性肺疾病倡议(GOLD) 0期,8例患者为I期,21例患者为II期(中位数(四分位数范围)),1秒用力呼气量(FEV)1): 72.3(5.3)%预测(% pred);最低值59% pred)。3例患者为特应性,但无相关过敏原暴露。5例为小细胞肺癌,33例为非小细胞肺癌,1例为间皮瘤。肿瘤阶段是Ia (n = 2), Ib (n = 1), iii a (n = 2),希望(n = 11),四(n = 21)和其他(n = 2)。该研究得到了当地伦理委员会的批准,患者提供了书面知情同意书。
研究设计
基线数据在一个化疗周期(第1天)前2小时内获得。其中16例为第一个周期,6例为第二个周期,17例为后一个周期。根据患者个人的时间安排,患者在第8天和/或第15天再次访问实验室。为了检查值是否已恢复到基线,患者还在化疗后第21天至29天(中位数为25天)访问实验室。所有测量都在早上进行,时间间隔为2小时,以避免昼夜节律的变化。
分别有24例、12例和3例患者采用卡铂、顺铂或其他药物进行化疗,均独立于本研究。给予地塞米松止吐药(12 mg·d)−11例,2例,12例,分别超过1、3、5天。6例患者接受lenograstim(糖基化粒细胞集落刺激因子,Granocyte®;Chugai Pharma Europe Ltd,伦敦,英国;剂量33.6 IU),以抵消白细胞数量的下降。
方法
潮汐呼吸10min时采集EBC (ECoScreen;Viasys, Höchberg,德国),而患者戴着鼻夹。为了避免唾液在口腔内堆积,研究人员要求受试者经常取下口腔口并吞咽。采集后,EBC迅速解冻。p-羟基苯乙酸(PHPA)和过氧化物酶立即加入到300 μ L的EBC中17,混合后储存在- 20°C。H之间的反应2O2PHPA形成稳定的荧光产物,可储存至少1年。已知H的标准溶液2O2浓度以同样的方式处理,并用于检查荧光测量结果。检出限为0.03µM。血液细胞计数(SF-3000;Sysmex,汉堡,德国)和FEV121采用标准方法进行评估。F伊诺在流速为50 mL·s−122使用化学发光分析仪(NIOX;Aerocrine,索尔纳,瑞典)。环境NO浓度从未超过10 ppb。
数据分析
数据以中值(四分位范围)表示。就诊比较采用Friedmans非参数方差分析,两两比较采用Wilcoxon符号秩检验,组间比较采用Mann-Whitney u检验。
所有患者(n = 39)均在化疗开始前(第1天)及化疗结束后(21-29天)进行了测量。由于只有14名患者在第8天和第15天都参加了就诊,因此进行了两项单独的分析,将第8天与第1天和第21-29天进行比较(n = 34),或将第15天与第1天和第21-29天进行比较(n = 19),以保持统计能力的损失较小。作为第8天参加实验室的小组与第15天比较(表2⇓),并且在参加过所有就诊的患者中也发现了类似的变化,因此为了说明起见,将所有数据集中在一起被认为是合理的(图1⇓)。
变异性通过类内相关系数进行量化通过方差分析。为了便于与治疗引起的变化进行比较,它还被表示为第1天和第21-29天观察到的值相对于这些值的平均值的绝对差值。采用Spearman秩相关法进行相关分析。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
血液参数的变化
比较第1天、第8天和第21-29天,白细胞总数和中性粒细胞数无明显变化。相比之下,单核细胞数量存在差异(ANOVA, p<0.0001),在第8天降低(表2)⇑)。第8天,单核细胞百分比降低,而中性粒细胞百分比升高(p<0.001)。
在第1天、第15天和第21-29天进行比较时,第15天白细胞、中性粒细胞和单核细胞数量下降(ANOVA, p<0.05;表2⇑)。单核细胞和中性粒细胞的百分比在这三次访问之间没有显著差异。与单核细胞相似,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量在第8天和第15天都发生了变化(方差分析,p<0.05);嗜酸性粒细胞的百分比也降低了。
与第1天相比,第15天白细胞数量下降的中位数(四分位范围)为2.38 (3.04)×1,000·µL−1或41(30)%。中性粒细胞数量减少1.78 (2.72)×1,000·µL−1或59(48)%。单核细胞数量减少0.42 (0.31)×1,000·µL−1或78 (39)%,0.13 (0.45)×1,000·µL−1或26(51)%在第15天,其中变化在天之间不同(p<0.02)。嗜酸性粒细胞数量下降0.04 (0.09)×1,000·µL−1或35 (50)%,0.07 (0.23)×1,000·µL−1或50(65)%在第15天。相应的淋巴细胞数量减少为0.28 (0.42)×1,000·µL−1或21(27)%和0.31 (0.64)×1,000·µL−1或19(40)%。
比较第1天和21-29天,只有嗜酸性粒细胞的绝对数量(Wilcoxon, p<0.0001)和单核细胞百分比(p = 0.015)有显著差异。与第1天相比,嗜酸性粒细胞数量下降0.05 (14)×1,000·µL−1或50(67)%。
在接受或未接受地塞米松治疗的患者亚组中,也观察到白细胞和中性粒细胞数量在第15天的下降。在未使用地塞米松的患者中,差异有统计学意义(n = 13;p < 0.001);只有6名接受地塞米松治疗的患者能够在第15天访问实验室。在无地塞米松组中,四次就诊中单核细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量的变化也有统计学意义(p<0.05)。
呼出H2O2
第1天、第8天和第21 ~ 29天H水平无显著变化2O2。相比之下,第1天、第15天和第21-29天之间存在差异(p = 0.040;方差分析;表2⇑)。第15天的中位数(四分位范围)下降为0.18(0.39)µM或31.0(56.9)%。II期COPD患者(n = 9)在第1天、第15天和第21-29天与其他患者组(p = 0.05)也有显著差异。两组基线H无显著差异2O2第1天水平(0.46 (0.24))与0.70(0.59)µm)。
的变化F伊诺
有显著差异F伊诺在比较第1、8天和21-29天时(p = 0.003),而在比较第1、15天和21-29天时(表2⇑)。与第1天相比,F伊诺第8天降低3.8 (10.8)PPB或22.3(40.2)%。在接受地塞米松治疗(n = 20, p = 0.015)或未接受地塞米松治疗(n = 14, p = 0.037)的两个亚组以及II期COPD亚组(n = 17, p = 0.0014)中也观察到这种下降,但在其他患者中没有。
可变性和相关性
在第1天和21-29天之间没有显示出统计学上显著差异的变量被用于获得研究期间变异性的上限估计值。白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞计数变异性的中位数(四分位范围)值Fe,不and exhale呼气2O2分别为25(29)%、31(30)%、29(38)%、12(20)%、24(39)%和53(86)%。类内相关系数分别为0.81、0.75、0.68、0.77、0.60和0.12。
中性粒细胞数量的个体变化与H无统计学意义2O2水平,或单核细胞数量和F伊诺的水平。白细胞、嗜酸性粒细胞或淋巴细胞数量以及基线FEV也是如此1。
讨论
目前的数据表明,在肺癌化疗期间,H2O2EBC与外周血中性粒细胞数量呈平行下降趋势。也有下降F伊诺。这种下降发生在中性粒细胞数量和H2O2而此时外周血中的单核细胞数量显著减少。
中性粒细胞数与H2O2浓度,以及单核细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量的不一致过程(图1)⇑)倾向于中性粒细胞是呼出H2O2,或者至少与它的产生密切相关。相反,同时下降F伊诺水平和单核细胞数量表明单核细胞(或巨噬细胞)基本上参与了呼出NO的产生。甚至可能是恢复F伊诺在第15天,单核细胞数量仍然较低,与H2O2在这个时间点的水平。
事实上,通过抑制黄嘌呤氧化酶来减少超氧化物的产生,被发现与黄嘌呤氧化酶水平的上升有关F伊诺23。活性氧(ROS)和NO之间的相互作用进一步由呼出的H水平之间的反比关系2O2大气吸入NO24。因此,NO的产生可能在第15天和第8天都减少了,但减少的ROS产生允许更多的NO逃避到气道腔内。事实是F伊诺变化在第15天最大,似乎也支持这一解释。这些影响是短暂的,如F伊诺和H2O2在第21-29天,数值恢复到基线。秋天F伊诺也不能用地塞米松来解释,一些患者在输注后使用了地塞米松。
在当前研究的背景下,F伊诺主要被认为是从气道粘膜转移到腔内的清除或潜在改变的指标。这种改变可能会影响呼出H的水平2O2在生产没有变化的情况下。当H2O2第15天水平下降,无变化F伊诺至少在平均水平上。如果这是ROS清除较少NO的结果,问题来了F伊诺作为未改变转移的指标,该论点仍然需要减少ROS的产生,与H2O2的水平。结合先前的证据,H2O2主要起源于呼吸道17,即。呼出的NO也来源于此,因此,目前的数据表明H2O2第15天的水平确实代表了H的下降2O2生产。
利用大规模的干预,如化疗,来研究对不同细胞类型的不同影响,使其更容易归因于呼出的H2O2要比比较有明显气道疾病的病人更有效当lenograstim在第15天之后使用时,它不影响第8天和第15天观察到的效果。对细胞分化时间进程的分析证实,化疗对中性粒细胞的影响最大。单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数也在第8天和第15天出现减少,嗜酸性粒细胞数量一直保持在低水平,直到第21-29天。这些模式与H2O2(图1⇑),而F伊诺水平与单核细胞最接近。
众所周知,从肿瘤部位提取的支气管肺泡灌洗液中含有大量的中性粒细胞25,肿瘤的存在可能影响了H2O2的水平。然而,基线H2O2患者水平(表1⇑)与研究期间测量的健康对照受试者的结果无显著差异(数据未显示)。肿瘤分期或类型与H也无相关性2O2的水平。因此,可能被认为对化疗特别敏感的局部效应不太可能影响本研究的结果。
在健康受试者中获得的数据已证明H2O2血液吞噬细胞或中性粒细胞被激活的水平18,19,从而表明血液参数的适宜性。这些研究没有包括F伊诺测量,他们也没有使用干预来引起细胞数量的变化。中性粒细胞在传导气道中是丰富的,鉴于它们的寿命很短,外周血和气道中类似的变化可能是预期的。然而,在之前的一项研究中,化疗后21天痰中性粒细胞计数没有明显下降,尽管血液中性粒细胞有所下降26。由于患者治疗计划的限制,本研究不可能包括痰诱导。这种差异可能是由于痰细胞计数的可变性,以及难以从痰细胞密度得出气道细胞数量的结论,以及测量的时间。在本研究中,测量时间较早,接近预期的细胞计数最小值,患者的气道疾病不太严重,因此降低了稳定的疾病相关气道中性粒细胞增多的可能性。此外,化疗可能影响了细胞数量和激活,以及血液吞噬细胞的数据18,19说明激活可以对呼出H起作用2O2。
事实上,使用超氧化物产生作为指标,中性粒细胞产生ROS能力的降低已被证明适用于广泛的化疗药物27。此外,在化疗中使用的铂化合物可能降低了超氧化物歧化酶的活性,如在耳蜗或肾细胞中所示28,导致H降低2O2生产。相反,同时降低过氧化氢酶活性会降低H2O2去除。与中性粒细胞相反,铂化合物可增强巨噬细胞的ROS释放29。因此,化疗可能影响呼出H2O2通过吞噬细胞的ROS产生和抗氧化酶活性,但这些因素在目前作者所使用的环境中的总体影响难以估计。最重要的是,与延迟的H2O2本研究中观察到的反应。
NO似乎在致癌和肿瘤生长中起作用通过活性氮和ROS之间的相互作用,化疗药物发挥多种作用,如增加诱导NO的产生30.与NO-mediated细胞凋亡31在巨噬细胞。与20 (35)ppb的阈值相比,39例患者中24(7)例患者的ppb水平升高F伊诺尽管哮喘患者被排除在外。两者之间没有关系F伊诺6名患者感染,尽管是最高的F伊诺在一个感染病人身上发现了价值。此外,血液中嗜酸性粒细胞和F伊诺彼此之间并不相关。
大多数患者都是前吸烟者,在治疗前几周停止吸烟。众所周知,吸烟会导致衰老F伊诺水平,可能是由于活性氧清除。戒烟后,F伊诺水平会在1-4周内上升32。学习的时间开始了,也开始了F伊诺第8天的水平,不赞成戒烟有偏见的假设F伊诺测量。类似的推理也适用于H2O2。没有重大气道疾病的吸烟者在支气管肺泡灌洗液中抗氧化剂和抗氧化酶活性水平升高33,但没有关于戒烟的数据。从理论上讲,抗氧化剂水平的下降应该会导致H的增加2O2水平,而不是观察到的下降。直接测量呼出H2O2也没有证据表明吸烟对H2O2轻度COPD患者3.。因此,戒烟很可能对目前的研究结果没有影响。
中性粒细胞数量的个体变化与H2O2水平可能是由于H2O2测量,这是从以前的研究中知道的17,34,35。由于干预可能增加了可变性,通过比较第1天和21-29天得出的变异系数必须被视为上限。H的变异性2O2大于其他变量,其中值为>50%,几乎是第15天观察到的下降幅度的两倍。
总之,目前的数据表明,化疗期间呼出过氧化氢水平和血液中性粒细胞计数之间存在平行过程。呼出一氧化氮的变化过程不同,与单核细胞数量变化过程最为相似。在先前数据表明呼出的过氧化氢主要来源于支气管的基础上,本研究结果提示呼出冷凝液中的过氧化氢主要是中性粒细胞数量和/或激活的标志,这是可检测的通过可能位于传导气道中。
致谢
作者在此感谢所有患者的合作。他们还感谢K. Paasch和I. Schwertfeger的技术支持,以及德国慕尼黑大学的A. Bergner的宝贵意见。
- 收到了2005年9月1日
- 接受二五年十二月二十三日。
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