文摘
粘膜胰蛋白酶,protease-activated受体兴奋剂(PAR),可能有一种内源性bronchoprotective气管平滑肌的作用。测试腔内胰蛋白酶这种可能性的影响在段猪支气管的气道的语气进行了测试。
支气管部分从猪被安装在一个器官室包含克雷布斯的解决方案。乙酰胆碱引起的宫缩评估等容腔压力(ACh)或碳酰胆碱添加到动脉外膜。
胰蛋白酶,添加到气道腔(300µg·毫升−1),没有立即对平滑肌张力的影响但抑制ACh-induced收缩后60分钟,至少3 h。合成激活肽(美联社)为标准1,票面2或票面价值3没有效果,但是相提并论呢4美联社引起快速、弱抑制收缩。腔内凝血酶没有效果,并没有阻止胰蛋白酶的影响。胰蛋白酶是减少的影响Nω硝基-l精氨酸甲酯但不是吲哚美辛。胰蛋白酶、凝血酶和标准4美联社释放前列腺素E2。外膜、胰蛋白酶、凝血酶和标准4美联社(但不是标准2美联社)< 3分钟后放松carbachol-toned航空公司。
本研究的结果表明,胰蛋白酶通过气道细胞相互作用而导致延迟和持久bronchoprotection从腔访问。信号机制可能涉及一氧化氮合酶但不是前列腺素类或protease-activated受体。
内源性蛋白酶,如凝血酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶,现在认为调节各种生理和病理生理活动。例如,内源性蛋白酶调节呼吸系统和心血管组织包括平滑肌、上皮和内皮细胞,参与疾病1- - - - - -3。许多监管内源性蛋白酶的影响,特别是胰蛋白酶和凝血酶,是由相互作用的家庭G protein-coupled受体称为protease-activated受体(PARs)4。目前四个部分(PAR1,票面2,票面3和标准4)克隆解理特征和被激活的细胞外n端,揭示出受配体然后self-activates受体域。
在呼吸系统,保护作用的胰蛋白酶气道腔提出了1,2,5,6。功能,胰蛋白酶能产生迅速而短暂的放松的气管平滑肌(ASM)带准备,虽然从不同物种和/或研究结果并不统一5,7- - - - - -10;例如,在人类的ASM,胰蛋白酶可能导致励磁而不是放松11。胰蛋白酶激活不相上下2和标准41,2,4由于合成肽(PAR-activating肽,PAR美联社)这些受体也放松ASM准备,胰蛋白酶的松弛剂效应已被归因于PAR-associated信号通路的激活。几项研究使用ASM条状或细胞培养表明,胰蛋白酶能行为间接产生松弛,可能通过释放前列腺素类前列腺素E2(铂族元素2)7- - - - - -10,12或一氧化氮(NO)10上皮细胞。的上皮细胞富含paracrine-type介质包括二十烷类,没有和其他物质,与bronchoprotective或对ASM(审查在收缩的影响13,14)。
这两个标准2和标准4气道上皮细胞表达的吗12胰蛋白酶,或其前体胰蛋白酶原,与帕尔斯co-localises上皮细胞提供一个结构框架所需的生理作用在该站点的胰蛋白酶5。腔内胰蛋白酶的作用的证据在活的有机体内然而,研究还不清楚。胰蛋白酶的气管滴注法生产因为豚鼠支气管收缩和气溶胶2美联社产生很少或根本没有影响10。这些结果背道而驰bronchoprotection来源于数据生成的一些概念在体外研究。静脉注射同等2(支气管狭窄或bronchoprotection)催化剂提供对比发现,可能是因为肺神经通路的不同贡献10,15。
上面的一些研究表明胰蛋白酶ASM的监管机构通过与粘膜细胞的交互5,7- - - - - -10,12。这是合理的,如果胰蛋白酶具有生理作用在粘膜显示这可能是通过研究其完整的气道粘膜表面的影响。一个孤立的支气管准备使用代理可以选择性地添加到腔因为正常的气道三维结构被保留。胰蛋白酶或其他代理也可以添加到气道的外膜的表面,他们会直接作用在ASM。胰蛋白酶的实验显示一些意想不到的动作传递给气道腔,胰蛋白酶的行为也与一些合成PAR美联社评估的贡献PARs trypsin-mediated反应观察。
方法
猪(25 - 30公斤)被实施安乐死与pentabarbital钠(注射。)。一杆左右肺支气管是解剖,实质是通过温和的解剖和侧分支结扎16。气管段约25毫米长,2 - 3毫米内直径是移除。段被归类为小型或中型基于他们的直径,位置(跨代9-14)和软骨的存在17。每一部分是空心,水平安装在一个器官含克雷布斯的解决方案(5.4 121 mM:氯化钠,氯化钾,MgSO41.2,NaHCO325日,NaMOPS (morpholinopropane磺酸钠,pH值7.3)5.0,11.5葡萄糖,CaCl22.5,加油啊,为95%2和5%的公司2和加热到37°C)。段动脉外膜是沐浴在克雷布斯的解决方案和部分腔充满了克雷布斯的解决方案从一个单独的水库。解决方案在腔的体积是0.15∼毫升浴体积是30毫升。龙头的两端部分允许气道腔密封,经管压力使用校准压力传感器可以监测。
30分钟后平衡时期,被电领域刺激支气管(EFS 60 V 20赫兹和3毫秒的脉冲)使用铂环电极和草S44刺激器(美国马草工具)。EFS-induced反应随后被用来评估与收缩spasmogens复苏治疗后的组织。轻快当一个可重复的EFS反应得到,高频的乙酰胆碱浓度(ACh) 10−4米,然后添加到浴历史提供一个稳定的收缩。最优(5而言不啻被动透壁的压力2O)建立了通过调节水库的高度用于灌注段腔和记录对EFS的反应。
前列腺素E2化验
克雷布斯的解决办法是退出了气道腔和铂族元素的化验2使用竞争酶免疫分析法(开曼化学,安阿伯市,美国制造商的指示。
失活的胰蛋白酶
胰蛋白酶是溶解在磷酸盐和孵化的克分子数相等的浓度Pefabloc (Boehringer-Mannheim,曼海姆,德国)对3 h在37°C。上面的解决方案是凝胶过滤PD 10列(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)去除游离Pefabloc。洗提液是冷冻乾和胰蛋白酶活性决定使用N苯甲酰-戴斯。莱纳姆:精氨酸p-nitroanilide作为底物18。
协议和数据
两个协议被用来检查腔内胰蛋白酶的影响和其他PAR美联社气道收缩反应。一、腔内胰蛋白酶的影响和PAR美联社测定乙酰胆碱量效曲线(10−7-10年−2米)在空调采暖洗浴气道外膜表面添加到解决方案。三个量效曲线记录。第一个是一个控制;第二次是开始后15分钟介绍胰蛋白酶或票面美联社腔;第三个记录∼60分钟后冲洗腔的代理。胰蛋白酶或票面美联社的影响开发的最大压力应对ACh (E马克斯)和乙酰胆碱浓度产生最大压力(EC的一半50)测定。进一步探索可能的胰蛋白酶的作用机制,及其时间进程,使用第二个协议重复挑战EC50集中采暖(3×10−5米)。乙酰胆碱添加外膜腔25-min间隔接触之前和之后的胰蛋白酶。胰蛋白酶时用它添加到45分钟的流明解决方案,这是一段时间,胰蛋白酶存在于上述第一议定书腔完整的量效曲线ACh记录。作为ACh收缩记录25-min时间周期内腔流体必须删除当浴清洗解决方案。胰蛋白酶等后腔冲洗时间取代。控制实验运行结果(见部分)显示收缩反应没有胰蛋白酶是一致的在研究期间。在一些实验中,克雷布斯的解决方案中包含的气道腔被撤回测定铂族元素2。
在另一组实验中,外膜胰蛋白酶的影响,凝血酶和PAR美联社测试与碳酰胆碱pre-toned(10的航空公司−6米)。控制运行与卡巴可单独进行了每段支气管,确保气道压力完全持续记录期间(图1所示⇓)。在控制和胰蛋白酶、凝血酶或票面AP-treated航空公司相比在下半场。
意味着成对比较方差分析和t检验或未配对的数据。数据显示在图2⇓卡方检验分析的趋势(见结果)。数据提出了均值±SEM, n =数量的气道段。
药物和材料
猪胰胰蛋白酶(IX-S类型,13000 - 20000 BAEE U·毫克−1吲哚美辛和蛋白质)l- name (Nω硝基-l精氨酸甲酯)从西格玛化工有限公司(美国圣路易斯,MS)。人类凝血酶获得CSL (Parkville、澳大利亚)。下面的PAR美联社所合成蛋白质组学国际(澳大利亚珀斯);票面价值1(SFLLRN-NH2),票面2(SLIGKV-NH2),票面3(TFRGAP-NH2)和标准4(GYPGQV-NH2)。消极的控制标准4是GYPGVQ-NH2。
结果
腔内胰蛋白酶、凝血酶和美联社不相上下
胰蛋白酶(300−µg·毫升−1气道)没有直接影响即。收缩或放松)时添加到气道腔。然而,腔内胰蛋白酶修改收缩反应ACh添加到外膜(图3所示⇓)。按照协议部分,量效曲线ACh被重复:1)之前添加胰蛋白酶;2)在腔内胰蛋白酶;和3)胰蛋白酶的冲刷。量效曲线ACh记录在300µg·毫升的存在−1胰蛋白酶(即。曲线由▪)表示,没有什么区别的控制曲线(即。曲线由○)表示。然而,第三量效曲线(即。曲线由▴表示),记录一些冲刷后60分钟胰蛋白酶,抑制减少39.3±9.6%E马克斯与对照组(p < 0.001, n = 4),尽管欧盟50空调采暖是不变的价值。吲哚美辛并没有改变胰蛋白酶预处理的抑制效应(E马克斯第三课时量效曲线的抑制39.1±13.1%,n = 4, p < 0.05,图3⇓)。
的时间进程trypsin-mediated效果如图4所示⇓。胰蛋白酶抑制反应变得明显∼1 h胰蛋白酶最初引入腔后45分钟(即。15分钟后冲洗)。胰蛋白酶的影响是持久的,剩余的至少3 h从最初引入胰蛋白酶。灭活胰蛋白酶没有造成长期抑制ACh-induced收缩(图4所示⇓),尽管小瞬态抑制还是出席85分钟。
抑制作用通常与胰蛋白酶几乎被看到l- name,除了在第85分钟时,有一个小但显著减少收缩(图4所示⇑)。凝血酶治疗(10 U·毫升−1)60分钟没有影响ACh-induced收缩(图5所示⇓)。胰蛋白酶后仍然存在的影响组织已经暴露于凝血酶(图5所示⇓),表明组织没有脱敏胰蛋白酶。
腔内PAR美联社
票面价值1,票面2,票面3和标准4美联社(4×10−4米)没有影响休息的语气航空公司当放置在腔(n = 3 - 6)。腔内不相上下1,票面2和标准3美联社(4×10−4米)对课时量效曲线也没有影响。相比之下,票面4美联社(4×10−4米)迅速镇压ACh量效曲线,减少E马克斯13.1±3.0% (p < 0.05, n = 6),但不改变电子商务50。冲刷后的票面价值4美联社,ACh反应仍然抑制(p < 0.001)。消极的控制肽标准4美联社没有影响ACh量效曲线(n = 4)。吲哚美辛(10−5米)废除了相当的影响4美联社在课时量效曲线(n = 7)。票面价值的影响4美联社,吲哚美辛,如图7所示⇓。
外膜的胰蛋白酶、凝血酶和美联社不相上下
胰蛋白酶(1 - 300µg·毫升−1)添加到动脉外膜侧没有影响气道压力。然而,在pre-toned航空(10−6氯化氨甲酰胆碱对动脉外膜),胰蛋白酶(300µg·毫升−1)产生一个短暂的延迟(< 3分钟)放松,超过15分钟,相当于19.3±3.6%减少语气(p < 0.05, n = 9,图1⇑)。低浓度的胰蛋白酶(1 - 100µg·毫升−1对语调)有很少或没有影响。胰蛋白酶−诱导放松并不影响吲哚美辛(18.6±2.7%降低音调,n = 9, p > 0.05与胰蛋白酶)。
评估是否松弛气道动脉外膜的接触产生的胰蛋白酶是可逆的,寻找可能的非特异性变化通过胰蛋白酶ASM收缩,碳酰胆碱−诱导前诱发宫缩添加胰蛋白酶(控制)和收缩∼冲刷后60分钟胰蛋白酶进行了研究。收缩反应碳酰胆碱后被完全恢复冲刷的胰蛋白酶,没有证据表明任何长−ASM的持久变化的功能。大小的第二个碳酰胆碱−诱导收缩冲刷后胰蛋白酶(48.4±5.6而言不啻没有明显不同2从控制(49.7±4.7而言不啻O)2O, n = 5)。
票面价值2美联社(10−4米)没有影响carbachol-toned航空公司(n = 4)但不相上下4美联社(10−4米)产生放松(12.0±3.4%减少,p < 0.05, n = 4,图1⇑)。凝血酶(10 U·毫升−1减少)也放松航空(37.0±6.5%的语气,n = 4)。
胰蛋白酶、凝血酶和PAR美联社在前列腺素E2积累
铂族元素2之前积累的气道腔被记录和腔内胰蛋白酶,45分钟后管理,凝血酶和PAR AP治疗(图2所示⇑)。铂族元素2浓度在控制样本或测试代理变量的存在。然而,趋势分析表明胰蛋白酶,标准4据美联社和thrombin-increased铂族元素2积累在气道(卡方检验)。腔内不相上下2据美联社对铂族元素没有影响2积累和吲哚美辛废除trypsin-induced铂族元素2积累(n = 4)。消极的控制标准4美联社(n = 3)没有对铂族元素的影响2积累。
讨论
这项研究的结果提供了明确的证据表明,胰蛋白酶与气道细胞可以从腔体,减少支气管收缩。前发现胰蛋白酶产生直接松弛劲ASM5,7- - - - - -10也证实了;这是通过添加显示胰蛋白酶的动脉外膜呼吸道准备,ASM直接激活。因此,胰蛋白酶产生双重影响,减少收缩时添加食管腔,导致松弛时添加外膜。
胰蛋白酶的机制涉及两个影响是不同的,然而,根据广泛不同的动力学响应。腔内,胰蛋白酶产生了延迟反应,可检测∼60分钟后,首先介绍了然后删除,与短延迟相比,可逆的放松,外膜胰蛋白酶对胰蛋白酶的快速反应的特点和PAR受体激动剂在ASM地带的研究报道5,7- - - - - -10。ACh-induced收缩的抑制腔内加入胰蛋白酶持续至少3 h,这是超过2 h后胰蛋白酶是洗的澡。如下面所讨论的,胰蛋白酶的持久影响独立的标准,似乎涉及旁分泌机制,可能涉及到没有。胰蛋白酶也已被证明能够引起延迟的诱导表达形式的环氧合酶(cox - 2)在人类培养ASM,几小时,而不是几分钟,这也似乎是独立的标准22。这些发现表明更持续的监管气道基调,胰蛋白酶,有别于快速、短暂的效应通常与这种酶有关5,7- - - - - -11。胰蛋白酶是正常的气道上皮细胞表达的5和高水平的胰蛋白酶和/或类胰蛋白酶存在于航空公司出现哮喘和慢性炎性疾病23- - - - - -25。如果腔内胰蛋白酶施加类似的持久bronchoprotective效应在人类通过旁分泌机制,建议在动物模型,然后气道胰蛋白酶之间的相互关系,一个或多个介质的释放,包括不,和ASM可能代表一个重要的长期控制机制参与气道狭窄在健康和肺部疾病。
不同的协议被用来表明胰蛋白酶减少最大收缩规模以应对ACh不改变组织的敏感性,和胰蛋白酶的延迟和持久的影响。前协议,涉及记录胰蛋白酶对完整的量效曲线ACh的影响(图3所示⇑),有抑制最大收缩比后者协议,这记录了胰蛋白酶对轻快反复高频的收缩反应的影响采暖(图4所示⇑)。不同程度的抑制的原因不成立,但可能与胰蛋白酶的持续存在,并可能在测量介质释放到气道腔的课时量效曲线。
本研究胰蛋白酶的含量高于报道在其他气道地带或细胞的研究中,可能由于航空公司的内生antiproteases的表达6。然而,胰蛋白酶的浓度没有造成非特异性损害或损失ASM的功能,或改变在ASM毒蕈碱的受体的影响,长期以来没有改变气道收缩反应后碳酰胆碱接触胰蛋白酶的时候添加到动脉外膜。此外,长期抑制胰蛋白酶的收缩主要是废除了在存在没有药理拦截器(l- name),这将不会发生如果ASM或其受体受损。最后,胰蛋白酶的腔内应用腔内反应并没有改变K+消除的解决方案,这表明上皮的结构属性(如。紧密连接)没有被暴露在蛋白酶,如下面所讨论的。
腔内胰蛋白酶的反应似乎源于与气道粘膜的交互,而不是从ASM的直接抑制作用,而对外膜胰蛋白酶可能源于ASM的直接放松。延迟的观察腔内胰蛋白酶抑制胰蛋白酶后只看到效果,而不是外膜胰蛋白酶后,支持一个腔内胰蛋白酶的间接影响。腔内胰蛋白酶的延迟效应可能是由于缓慢的通过胰蛋白酶在epithelial-intercellular连接到达底层ASM被认为是。然而,上皮高度impermeant离子和小分子19,20.这将防止这种酶的扩散。发生扩散的、失去上皮细胞紧密连接蛋白胰蛋白酶可能达到ASM之前需要。为了测试这种可能性,反应腔内K+消除胰蛋白酶后解决方案管理和进一步2 h后冲刷被监控。任何时候有任何收缩反应K+,这表明上皮保留了impermeant财产。这个研究和其他显示,而ASM合同高K+消除解决方案外膜,K+没有效果时放置腔的完整的航空公司,除非上皮首次突破了在这个研究和其他地方吗19- - - - - -21。进一步证明,胰蛋白酶在很大程度上局限于气道腔内表面的是:1)胰蛋白酶后产生了持久的影响,从浴缸洗;2)观察腔内应用程序的另一个酶,凝血酶,虽然强烈放松ASM,没有产生影响腔内;和3)低浓度胰蛋白酶将实现在ASM的水平;即使没有扩散管和外膜解决方案之间的障碍的平衡浓度胰蛋白酶溶液中沐浴动脉外膜将低于约200倍浓度添加到气道腔,因为浴成交量∼200倍大于腔体积。
腔内胰蛋白酶的影响没有模仿合成催化剂的标准1,票面2,票面3,或凝血酶,当腔内没有影响。相比之下,腔内标准4美联社做生产少量的抑制ACh-induced收缩,提高腔内胰蛋白酶的可能性,一些影响可能是由于激活的标准4。然而,目前的研究结果表明,腔内胰蛋白酶的作用并不是由于标准4因为票面价值4美联社响应被消炎痛而胰蛋白酶的响应并不是表明这两个分子通过不同的机制。此外,凝血酶没有阻止胰蛋白酶的作用,与其他PAR-mediated看到效果5,12。最后,放松效应引起的标准4更迅速比胰蛋白酶,符合不同的行动模式。虽然不是模仿合成配体部分,反应在猪胰蛋白酶航空所需的酶催化地活跃,自灭活产生很少或没有胰蛋白酶抑制气道收缩。虽然不排除在外,不太可能无法检测PAR-mediated效应(除了标准4)气道收缩是由于缺乏合成受体激动剂或胰蛋白酶帕尔斯的有效性。所示的激活肽被大量研究,包括目前的研究中,帕尔斯的有效活化剂5,8- - - - - -12。票面使用美联社的浓度高于其他呼吸道带研究中报道的,但使用的相同我们获得铂族元素2和细胞因子释放通过票面价值1,票面2和标准4在培养的上皮细胞激活12。铂族元素2累积测量标志的PAR激活12,建议胰蛋白酶、凝血酶和标准4美联社激活一个或多个部分的呼吸道准备,因为他们造成了铂族元素2释放。当前研究的结果,标准4美联社与凝血酶减少语气完好无损时气道外膜,也符合激活的标准4在这个系统。猪血管组织其他的研究也表明,部分表示在这个物种和PAR美联社产生功能响应26,27。消极的控制标准4美联社(QYPGVQ-NH2在铂族元素)没有影响2释放或课时量效曲线表明反应标准4美联社是特定的受体。
当前研究的结果支持范式中粘膜胰蛋白酶产生持久的ASM PAR-independent基调的监管机制。这项研究的结果进一步表明,该信号通路不涉及考克斯,正如前面所示的其他研究气道7- - - - - -10,12,而是表明一氧化氮合酶(NOS)的主要要求。考克斯的贡献在内腔胰蛋白酶的影响在本研究是调查使用吲哚美辛和铂族元素的测量2考克斯活动的标志。胰蛋白酶产生显著的铂族元素2同意对其他物种的研究积累7,12。尽管展示了铂族元素的释放2考克斯在猪支气管,trypsin-induced bronchoprotection出现独立的代谢物,自后废除铂族元素2吲哚美辛,胰蛋白酶仍然产生抑制性反应特征。NOS在气道腔内胰蛋白酶反应了,因为有证据表明其在航空公司参与PAR-mediated反应10和血管27- - - - - -29日。在支气管部分,胰蛋白酶的影响在很大程度上被l- name,表明持久抑制气道收缩是由没有。有一个小胰蛋白酶的剩余效应存在l- name,大约85分钟后胰蛋白酶第一次补充说,这可能是不完全的封锁NOS的结果l- name,或者可以代表一些额外的非特异性抑制胰蛋白酶的作用在ASM。NOS的来源不成立,但气道上皮细胞表达本构和诱导亚型NOS和是一个已知的来源13,30.,31日。许多内源性介质激活号亚型,包括细胞因子、凝血酶和其他生物活性物质13在延迟可能充当了中介,非特异性的影响胰蛋白酶(即。PAR-independent)通过没有释放。此外,号激活导致的生产年代-nitrosothiols本身对ASM产生生物活性,但与更长的时间比没有课程13。进一步的研究来阐明NOS在胰蛋白酶的行为报道这是需要调查这些可能性。
总之,研究结果报道在这里为延迟提供证据和持久bronchoprotective粘膜胰蛋白酶的作用,在生理条件下可能涉及信号通过一氧化氮合酶,与之前描述胰蛋白酶的行动,是独立于古典protease-activated受体。胰蛋白酶的bronchoprotective效果持续的时间(∼3 h),或长于研究期间,这表明它有能力提供长期的监管在哪里有慢性气流限制条件。
确认
作者感谢r .局域网和p . McFawn至关重要的讨论。
- 收到了2005年4月8日。
- 接受2005年9月7日。
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