摘要gydF4y2Ba
人们普遍认为中性粒细胞是慢性阻塞性肺病(COPD)的发病机制的核心。增强这种细胞的内皮相互作用可能有助于发展疾病的吸烟者的易感性;然而,先前没有在COPD中研究这些相互作用。目前研究的目的是判断来自吸烟者的中性粒细胞的内皮细胞的增强内皮相互作用是开发COPD的概述因素。gydF4y2Ba
比较了7例不吸烟者(NS)、7例健康吸烟者(HS)和11例重度α型COPD患者在流动条件下内皮细胞的相互作用和外周血中性粒细胞粘附分子的表达gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 钛素缺乏(Piz)和中性粒细胞,来自11名COPD患者,没有缺陷(PIM)。gydF4y2Ba
总粘合剂和迁移反应(每毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba每10个内皮gydF4y2Ba6gydF4y2Ba中性粒细胞在PIM组中显着更大(平均值±gydF4y2BaSE.gydF4y2Ba704.2±57.9gydF4y2Ba相对gydF4y2BaPiZ组为509.3±48.8,HS组为499.3±40.1,NS组为491.2±33.7)。与PiZ组相比,PiM组刺激中性粒细胞上巨噬细胞抗原-1 (CD11b)表达增加(平均值±)gydF4y2BaSE.gydF4y2Ba相对荧光强度1.4±0.1gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba1.1±0.1)。gydF4y2Ba
总之,在正常水平的α存在下产生慢性阻塞性肺病的吸烟者的中性粒细胞的内皮细胞的增强内皮相互作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 钛合金缺乏,但不在那些严重α的人gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 钛素缺乏,表明这是疾病发展的诱因,并且巨噬细胞抗原-1的上调可能是责任。gydF4y2Ba
- αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba- antiTrypsin.gydF4y2Ba
- 酶分子gydF4y2Ba
- 慢性阻塞性肺疾病gydF4y2Ba
- 内皮gydF4y2Ba
- 中性粒细胞gydF4y2Ba
一般认为,中性粒细胞在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制中起核心作用。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.增强这种细胞的内皮相互作用可能有助于发展疾病的吸烟者的易感性,gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba将血液中的招募增加进入肺部。发生中性粒细胞迁移到支气管粘膜下发生gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba支气管循环,并且假设遵循选择蛋白介导的细胞轧制和捕获的多步骤过程,然后是βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba- integrin(CD18) - 介导的粘附,然后迁移gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.现在有证据表明,激活的中性粒细胞的招募可以涉及其他新的分子途径。例如,在急性脓毒症中,已证明中性粒细胞使用αgydF4y2Ba4gydF4y2Ba- integrins(CD49D),以及βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-整合素与内皮细胞相互作用gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而其他工人在中性粒细胞机车和迁移反应中含有含有的白血病(CD43)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.然而,这些粘附分子以前没有在慢性炎症(如慢性阻塞性肺病)中进行评估。gydF4y2Ba
与具有正常肺功能的吸烟者相比,对COPD中常规中性粒细胞粘附分子的先前研究表现出巨噬细胞抗原(MAC)-1(CD11b)的表达,其吸烟者与具有正常肺功能的吸烟者相比gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.此外,先前使用膜过滤方法与慢性支气管炎患者从慢性支气管炎和肺气肿的患者中嗜中性粒细胞的增强趋化响应,用细菌肽甲基丙基 - 甲硫基 - 苯基丙氨酸(FMLP)为趋化物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba.然而,尚不清楚在惰性膜上的MAC-1的这种上调和增强的趋化反应转化为已开发COPD的吸烟者中的中性粒细胞 - 内皮互动。此外,目前尚不清楚描述的迄今描述的中性粒细胞引发是COPD或疾病后果的概述因素。gydF4y2Ba
因此,目前研究的目的是测试从COPD患者血液中纯化的中性粒细胞患者正常水平α的假设gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-抗胰蛋白酶(AT)显示:1)在流动条件下内皮相互作用增强,2)与从不吸烟者(NS)、健康吸烟者(HS)和被确认有疾病遗传易感的COPD患者相比,粘附分子上调(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba严重α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏)。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
研究人口gydF4y2Ba
我们一次性采集了7名NS、7名HS和11名α正常的COPD患者的血液样本gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT(PIM)和11名COPD患者αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏症(PiZ),至少在任何急性发作后2个月。COPD被定义为一秒内的用力呼气量(FEV)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)/强迫肺活量(FVC)比率<70%gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
内皮细胞分离和培养gydF4y2Ba
使用先前描述的技术从脐带收获人的脐静脉内皮细胞(HUVEC)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.Huvec在辅以10%(v / v)热灭活的人血群Ab血清(HD耗材,Buckinghamshire,英国),10 ng·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba表皮生长因子(PEPROTECH EC LTD,伦敦,英国),10μg·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba氢化可源,0.06mg·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba青霉素,0.1 mg·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba链霉素(所有医院药房制剂)和10μg·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba谷氨酰胺(Sigma Chemicals Ltd,UK),37°C含有5%CO的潮湿气氛。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.将细胞转移到汇合中,并且根据需要重复生长循环。细胞不在第六段之外使用。由于玻璃微玻璃内的融合易于培养,以及在吸烟者的支气管循环中的毛细血管静脉曲后观察到的白细胞介素(IL)-1β刺激后的粘附分子表达类似的胶粘剂表达相似曲线的相似性gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
血液中性粒细胞的分离gydF4y2Ba
通过静脉血管进入含有EDTA抗凝血剂的管中收集全血,并使用在500×上的组织Caque®1019和1077(Sigma Chemicals Ltd)上的不连续密度梯度离心分离中性粒细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba25分钟。所有阶段在室温下进行。通过氯化铵裂解缓冲液除去污染的红细胞(1.66g NHgydF4y2Ba4gydF4y2Ba氯,200毫克KHCOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在200ml蒸馏水中加入7.4 mg EDTA二钠(BDH,普尔,英国),调整pH 7.2)。使用前用含0.1%牛血清白蛋白的PBS清洗细胞(Sigma Chemicals Ltd)。这种方法产生的中性粒细胞纯度为98%,活菌率为97%(台盼蓝排除法测定)。gydF4y2Ba
基于流动的粘附和迁移分析gydF4y2Ba
如前所述,采用了基于流动的分析方法gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.具有矩形横截面和良好的光学品质(Camlab Ltd,UK),涂有3-氨基丙基三乙氧基 - 硅烷(Sigma Chemicals Ltd)和明胶溶液的玻璃纤维玻璃纤维化玻璃纤维化晶醇均以1.5×10的浓度接种HuvecgydF4y2Ba6gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba使传播和汇合。IL-1β (10 ng·mL)刺激HUVECgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)在每个测定之前4小时。然后将内皮大化的纤维化硅酸钠安装在相位对比光视频显微镜(在37°C的加热透明丙烯酸腔室中封闭)并连接到哈佛书注射器泵(哈佛装置,霍雷斯顿,MA,USA)以允许缓冲器或者通过电子切换阀(Lee Products Ltd,Buckinghamshire,UK)通过Huvec单层绘制细胞悬浮液。gydF4y2Ba
密集的密度分级中性粒细胞(1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在含0.1%牛血清白蛋白的内皮基础生长培养基中)灌注微玻片4分钟,然后用无细胞内皮基础生长培养基冲洗90 s。流速为0.182 mL·mingydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,产生0.05 Pa的壁切应力。这是在范围的低端,通常见于毛细血管后小静脉gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.在接下来的60秒内录制了视频,覆盖了微载玻片的至少10个领域。这些记录随后通过计数每个野的粘附白细胞(亮相)和转移白细胞(暗相)的数量进行分析。粘附和迁移的中性粒细胞数量·mmgydF4y2Ba−2gydF4y2Ba·10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba然后可以确定注入。对于粘附中性粒细胞的粘附中性粒细胞的测定内变异系数(n = 6)为3.1%,迁移中性粒细胞的10.1%,总相互作用的中性粒细胞3.5%。内皮粘附和迁移实验一式三份进行,得到平均值并作为每个研究对象的结果进行。gydF4y2Ba
中性粒细胞表面粘附分子表达gydF4y2Ba
荧光素异硫氰酸异构体缀合的单克隆抗体,用于针对CD11a,CD18(Dako,IELY,UK),CD11b,CD43,CD49d,CD621,免疫球蛋白(Ig)G1和IgG2b(Serotec,牛津,英国)用于标记表面粘附分子如前所述,从每个研究主题的全血纯化的休息和刺激的中性粒细胞gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba.简而言之,将50μl中性粒细胞悬浮液加入50μLPBS或50μl1-μmFMLP中,并在室温下孵育15分钟。在室温下与适当的单克隆抗体孵育30分钟后,用光保护,用1.5ml洗涤缓冲液洗涤细胞两次(500ml PBS,0.1g叠氮化钠(Sigma Chemicals Ltd)和2%v / v胎牛血清)。在第二次洗涤之后,将电池沉淀重悬于500μl1%(w / v)多聚甲醛(Sigma Chemicals Ltd)中,然后将样品储存在4℃,从光中保护直至分析。使用Coulter Epics XL机(Coulter Corp.,Miami,FL,USA)评估细胞表面荧光。相对于用非特异性抗体标记的细胞的荧光强度测定具有特异性抗体的未刺激性中性粒细胞的荧光强度。相对于用相同抗体标记的未刺激的中性粒细胞表达FMLP处理细胞的荧光强度。该方法的测定内变异系数(n = 4)为9.3%。gydF4y2Ba
血液学的测量gydF4y2Ba
在英国女王伊丽莎白医院的血液学部门,在每种研究科目上对每个研究主体进行自动全血计数。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
使用Kruskal-Wallis测试最初比较四组的连续数据,然后是Mann-Whitney U-Test,以识别成对的组之间的显着差异。使用CHI方向测试进行比较分类数据。Spearman的等级相关测试用于检查变量之间的关系。P值<0.05被认为是统计学意义的。本研究经南伯明翰卫生管理局伦理委员会,伯明翰,英国的批准以及所有主题提供了知情的同意。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
研究科目gydF4y2Ba
NS、HS、PiM和PiZ组的人口统计学和肺活量数据如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.PiZ组年龄明显低于其他三组(p<0.01),但组间性别差异无统计学意义(p = 0.317)。HS、PiM和PiZ组有相似的包年吸烟史,当前吸烟者和已戒烟者之间没有差异(p = 0.353)。PiM和PiZ组的平均气流阻塞程度相似,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba中度到重度。gydF4y2Ba
血液学参数gydF4y2Ba
全自动全血细胞计数检测结果见表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.HS、PiM和PiZ组的平均白细胞和中性粒细胞计数相似,但NS组显著降低(p<0.01)。PiM和PiZ组的平均血红蛋白浓度和红细胞压积显著高于NS和HS组(p<0.05)。gydF4y2Ba
中性粒细胞黏附和流动下的迁移行为gydF4y2Ba
图1总结了从NS, HS, PiM和PiZ组纯化的中性粒细胞的粘附和迁移反应gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.四组(Kruskal-Wallis P = 0.114)之间的粘附中性粒细胞的平均数量没有显着差异。然而,四组(Kruskall-Wallis P <0.01和P <0.05)之间迁移和总相互作用中性粒细胞的平均数量存在显着差异。gydF4y2Ba
配对分析显示,与其他三组相比,PiM组中性粒细胞的总内皮相互作用水平显著升高(平均值±)gydF4y2BaSE.gydF4y2Ba704.2±57.9gydF4y2Ba相对gydF4y2BaPiZ组为509.3±48.8,p = 0.01;HS组为499.3±40.1,p<0.05;和491.2±33.7,p<0.01, NS),跨内皮迁移显著增加(327.8±36.5)gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba86.8±24.0,P <0.001,在PIZ组;204.0±37.1,P <0.05,在HS;和204.7±38.5,p <0.05,在ns中)。此外,PIZ组的常旧中迁移显着低于其他三组(P <0.05)。gydF4y2Ba
在PiM组中,中性粒细胞与内皮细胞的相互作用与FEV之间存在中度强负相关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba/ fvc(r = -0.716; p = 0.012;图。2AgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),但不是fevgydF4y2Ba1gydF4y2Ba表示为%pred(r = -0.273; p = 0.416;图2bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。中性粒细胞 - 内皮相互作用和FEV之间的相关系数gydF4y2Ba1gydF4y2Ba/FVC仍然具有统计学意义,即使数据来自FEV最低的患者gydF4y2Ba1gydF4y2Ba/ FVC被排除在分析之外(r = -0.654; p = 0.04)。在其他三组的肺功能和中性粒细胞内皮相互作用之间没有看到显着的相关性。gydF4y2Ba
中性粒细胞表面粘附分子表达gydF4y2Ba
从NS、HS、PiM和PiZ组全血中纯化的静息和fmlp刺激的中性粒细胞粘附分子CD11a、CD11b、CD18、CD43、CD49d和CD62l的表达如图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.Kruskal-Wallis分析显示,在四组之间的CD11a的静止表达显着(p <0.01),并且配对分析证实这是由于PIZ组的显着低表达(P <0.01)。此外,四组之间CD62L的表达明显不同(P <0.05),并配对测试显示,PIM和PIZ组之间的显着差异(平均值±gydF4y2BaSE.gydF4y2Ba2.0±0.5gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba1.0±0.2,P <0.05)。gydF4y2Ba
在fmlp刺激的中性粒细胞上,相对于未刺激的中性粒细胞,四组间CD11b和CD18的荧光强度有显著差异(Kruskal-Wallis p<0.05)。配对分析显示,这是由于PiM组中这两种粘附分子明显高于PiZ组(平均值±)gydF4y2BaSE.gydF4y2BaCD11b相对荧光强度1.4±0.1gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba1.1±0.1,P <0.05,在PIZ组中;CD18相对荧光强度1.4±0.1gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba1.1±0.0,P <0.05,在PIZ组中)。在中性粒细胞刺激后,任何其他粘合分子中的任何其他粘合分子之间没有差异。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
中性粒细胞从血流募集到气道是一个复杂的过程,涉及许多不同的黏附分子和炎症介质,这很难通过简单的趋化试验(如Boyden室)来解释。此外,通过血管的血流使内皮细胞受到剪切应力,剪切应力可引起内皮细胞的细胞骨架重塑和自然信号级联的激活,包括核因子-κB的激活和细胞内粘附分子(ICAM)-1的上调gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba.当前研究中使用的基于流动的测定掺入了这些方面,并且当与Huvec结合使用时,其具有与在支气管后腔内的支气管内腔内相似的粘合分子曲线(之后)gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba,提供COPD患者气道中的中性粒细胞 - 内皮细胞相互作用的适当模型。gydF4y2Ba
使用该模型,目前的作者已经证明了内皮细胞相互作用的第一次,特别是从PIM吸烟者纯化的中性粒细胞的颅胸迁移的第一次相比,与NS,HS和PIZ患者相比显着增加。PIZ集团更年轻,但否则该群体匹配得很好;特别是,HS和COPD患者有类似的吸烟历史。此外,尽管对PIM和PIZ组的显着更高的外周血中性粒细胞计数进行了证明,但与NS相比,校正了目前研究中的中性学粒细胞内皮相互作用,校正了注入中性粒细胞的数量,这表明在中性粒细胞中看到的差异 -内皮细胞相互作用与这些因素无关。gydF4y2Ba
中性粒细胞与内皮细胞相互作用增加的一个潜在机制是中性粒细胞粘附分子的上调。Mac-1 (CD11b/CD18)被认为是促进中性粒细胞粘附的关键gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba其内皮反应器受体ICAM-1gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.在暴露于IL-8等刺激后,Mac-1迅速移动到中性粒细胞表面gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba,这是在细胞因子刺激后的内皮表面上呈现gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba.在目前的研究中,CD62L的表达略有增加(gydF4y2BalgydF4y2Ba- 在从PIM患者的全血纯化的FMLP刺激的中性粒细胞上静止中性粒细胞和CD11B和CD18(MAC-1)上的CD11B和CD18(MAC-1);然而,与PIZ患者相比,差异仅达到统计学意义。鉴于中性粒粒粒子净化过程导致中性粒细胞激活程度,MAC-1上调的这种差异的差异是低于真实差异的差异,因此,如前所述gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba.鉴于慢性阻塞性肺疾病是一种经过多年发展的缓慢进展的疾病,即使中性粒细胞-内皮相互作用的微小增加也可能在此期间导致吸烟者肺部中性粒细胞负担的临床显著增加。gydF4y2Ba
COPD的研究经常患有未招募适当的对照组。虽然年龄匹配的HS通常包含在这些研究中,但解释结果可能无法分离原因和效果。因此,目前研究的一个优势是将匹配组的患者纳入鉴定的危险因素,即αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏。由于蛋白酶(例如中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶抑制剂)之间的不平衡,认为COPD是发展的(主要是αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT),可因中性粒细胞负荷过高或相关抑制剂缺乏而发生。这一总体机制与观察到的严重α所致慢性阻塞性肺病患者的中性粒细胞一致gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在目前的研究中,-AT缺乏没有显示内皮相互作用增加。事实上,尽管在PiZ、NS和HS组中中性粒细胞与内皮细胞的总相互作用相似,但与其他三组相比,PiZ组的中性粒细胞跨内皮迁移显著降低。这是一个意外的发现,但可能与PiZ患者静息中性粒细胞CD11a和fmlp刺激中性粒细胞CD11b和CD18 (Mac-1)的低表达有关,尽管这需要进一步研究。gydF4y2Ba
严重α患者的气道炎症,结缔组织损伤和气流阻塞的发展gydF4y2Ba1gydF4y2Ba尽管中性粒细胞-内皮相互作用正常或减少,但由于弹性酶-α, -AT缺乏仍可能发生gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT失衡主要与抑制剂缺乏有关。相反,中性粒细胞与内皮细胞的相互作用增强可能有助于α正常吸烟者COPD的发展gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT水平通过增加中性粒细胞聚集到肺,导致更大的弹性酶负担和侧枝肺损伤,即使存在正常的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——。进一步支持这一假设的证据是中性粒细胞-内皮细胞相互作用和FEV之间的负相关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba/ FVC比率在PIM患者中,但不是那些αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏,表明PIM受试者的增强中性粒细胞 - 内皮相互作用与COPD的存在之间的关联。gydF4y2Ba
综上所述,数据显示吸烟者外周血中性粒细胞α水平正常gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 与尚未开发疾病的吸烟者相比,已经开发出慢性阻塞性肺病的抗性患有慢性阻塞性肺病的增强内皮互动。此外,慢性阻塞性肺病患者α的患者中嗜中性粒细胞 - 内皮相互作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 钛合金缺乏,这表明这不仅仅是疾病本身的影响,而且可能是没有缺陷的吸烟者的概述因素。需要进一步的工作来澄清机制,但粘附分子巨噬细胞抗原-1的上调可能是负责任的。目前研究中显示的中性粒细胞引发可以为慢性阻塞性肺病和正常水平的α提供新的治疗目标gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶。gydF4y2Ba
- 已收到gydF4y2Ba2004年7月22日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2004年12月7日。gydF4y2Ba
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