文摘
香烟烟雾诱发肺的发展变化C57 Bl / 6 j和DBA / 2小鼠了。两株敏感温和氧化剂和C57Bl / 6 j小鼠缺乏血清alpha1-proteinase抑制剂。
慢性暴露于香烟烟雾中后,斑驳的两株小鼠肺气肿在场,但在DBA / 2小鼠发展更快。积极反应的小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶被隔两株。此外,DBA / 2小鼠开发出一种统一的实质扩张,之前是凋亡细胞的出现在血管内皮生长因子受体2的低信号。分散在整个实质纤维化区域,加上积极的免疫组织化学反应转变增长factor-β被认为只有在DBA / 2小鼠。
DBA / 2和C57Bl / 6 j菌株显示上皮细胞损伤和deciliation在航空领域。然而,杯状细胞化生的外观很常见在C57Bl / 6 j小鼠,但罕见的DBA / 2小鼠。积极的免疫组织化学反应对白介素(IL) 4, IL-13和MUC5AC被认为只有在C57Bl / 6 j小鼠的航空公司。
应变特征(alpha1-proteinase抑制剂水平,对氧化剂和本构的血管内皮生长因子受体2)和显性反应(细胞凋亡和细胞因子分布)可能条件实质和气道改变香烟。
发病率和死亡率慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个全球卫生问题的维度和香烟烟雾已被确认为最重要的发展的慢性阻塞性肺病的风险1,2。然而,它也认识到,在重度吸烟者人口只有15 - 20%的受试者发展慢性阻塞性肺病3。这样做的原因是未知的;然而,很可能个体遗传风险因子可能发挥重要作用4,5。
近交品系的小鼠基因完全相同,因此小鼠不同菌株的代表一个理想模型为研究发展中香烟烟雾诱发病变的敏感性不同的表型。
在先前的研究中,目前的作者调查急性和慢性暴露于香烟烟雾的影响在三个不同的近交品系的小鼠,即只有DBA / 2和C57Bl / 6 j。当敏锐地暴露于香烟烟雾,ICR应变显著增加小鼠抗氧化能力的支气管肺泡灌洗液(BALF)。相比之下,菌株DBA / 2小鼠和C57Bl / 6 j显示的BALF中抗氧化能力显著下降。同时,拥有和DBA / 2小鼠持续正常水平的弹性蛋白酶抑制能力(共同)BALF样本,C57Bl / 6 j小鼠有显著较低水平(−40%的其他菌株)6。
当长期暴露(7个月)香烟,ICR小鼠应变没有显示肺弹性蛋白含量下降,没有形成肺气肿。相比之下,肺弹性蛋白含量显著减少在C57Bl / 6 j和DBA / 2小鼠开发重要的肺气肿6。
在目前的研究中,差异描述香烟烟雾诱发实质病变研究的发展,以及气道变化两个敏感菌株:C57Bl / 6 j和DBA / 2。本研究试图将进行香烟烟雾诱发病变发展的某些表型鼠标应变的响应特征。
方法
动物
雄性老鼠岁2个月的菌株C57Bl / 6 j和DBA / 2(查尔斯河、Calco、意大利)。动物实验是经当地大学的伦理委员会批准锡耶纳,锡耶纳,意大利。
慢性暴露于香烟烟雾中
方法慢性吸烟暴露之前已经详细描述6。简而言之,菌株C57Bl / 6 j小鼠和DBA / 2受到·天3支烟的烟−1(商业弗吉尼亚香烟过滤:12毫克焦油和0.9毫克的尼古丁),5天·周−11、3、6和10个月或室内空气(控制),在专门设计的macrolon笼子(Tecniplast、Buguggiate、意大利)。
光学显微镜:形态、形态测量学、免疫组织化学和tunel检测
在不同的时间间隔在慢性暴露于室内空气或香烟,两株,曝露了醚组动物,然后抽血切断腹主动脉。肺切除和缓冲福尔马林固定气管内的(5%)的恒压20厘米H2O≥24 h。被水Post-fixation肺容积测量位移。所有的动物都被处理的肺组织学检查和沾haematoxylin-eosin和/或定期acid-Schiff (PAS)。两株小鼠的肺牺牲在6和10个月也沾着马森的三色的。
纤维化
的形态学评估纤维化表现在6 - 10个月所有的动物,包括确定的每分钱纤维化的体积密度,通过点计数。点估算是由使用多用途确定每张幻灯片20个随机领域和网格数45分领域总共900点为每个幻灯片。纤维化肺泡隔内被定义为炎症细胞浸润,肺泡空间与细胞外基质的沉积9。
杯状细胞化生
因为老鼠没有支气管的杯状细胞10,一只老鼠被认为有杯状细胞化生(GCM),至少一个或多个中间大小支气管/肺显示积极的PAS染色。
免疫组织化学
从小鼠组织部分(8µm厚)菌株都是彩色的转化生长因子(TGF) -β,白介素(IL) 4, IL-13, MUC5AC在3和6个月(所有),中性粒细胞弹性蛋白酶,血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体2 (R2)(三1和3个月)的immunoperoxidase方法。
主要的多克隆抗体(Ab)使用:兔子Ab鼠标TGF-β(英国温布利洞察力生物技术有限公司),山羊Ab鼠il - 4或中央5 ac,兔子Ab鼠标VEGF或VEGF-R2(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国),山羊Ab移动IL-13(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国),兔子Ab人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(与小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶打)稀释1:50 0 (Calbiochem-Novabiochem、圣地亚哥、钙、美国)。疣状的消极的控制,主Ab取代nonimmunised兔子和山羊血清。的部分与苏木精复染色。
Tunel检测
Tunel检测,石蜡包埋肺部分菌株1和3个月。测试是根据商用设备(原位细胞死亡检测装备,荧光素;罗氏诊断GmbH德国曼海姆)。
透射电子显微镜法
接触三个月后,一些动物的肺的菌株都是加工透射电子显微镜和检查300年飞利浦电子显微镜(飞利浦电子光学、埃因霍温、荷兰)如前所述11。
统计分析
意味着不同的意义使用单向方差分析计算(野生)。的假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
实质的变化
两种类型的病变影响薄壁组织在不同程度被认为吸烟两株小鼠,即肺气肿和纤维化。然而,有明显的形态学差异这两个菌株之间的病态。
关于肺气肿的量化数据的Lm和ISA后获得两株1,3、6、10个月接触室内空气或香烟是表1中给出⇓。
经过1个月的香烟烟雾暴露DBA / 2和C57Bl / 6 j小鼠Lm和ISA平均值不同于各自的控制。然而,五个DBA / 2小鼠表现出明显的肺气肿和两个5显示一些参差不齐的桶状病变。3个月后烟雾暴露DBA / 2小鼠明显肺气肿的特点是显著变化Lm和ISA。
在这个时间点,C57B1/6J老鼠显示统计Lm的增加。ISA的但是,没有减少,表明在这个应变破坏性变化尚未充分发展。为了调查的作用机制(s)肺气肿的发展这两个菌株,中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫组织化学调查,VEGF和VEGF-R2 Tunel检测进行了1和3个月后开始曝光,即。肺气肿时发展。免疫组织化学检查,进行3个月,显示阳性反应的小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶隔DBA / 2和C57Bl / 6 j小鼠(图1⇓和b)。
不同程度的凋亡被发现之间的DBA / 2和C57Bl / 6 j香烟烟雾暴露1和3个月后(图2所示⇓)。特别是,DBA / 2小鼠显示大量的薄壁组织中凋亡细胞均匀分布在1月后吸烟(图。2⇓)。在3个月,这些老鼠的细胞凋亡水平显著降低(图2 b⇓)。相比之下,没有凋亡细胞被认为在C57Bl / 6 j在吸烟后1个月,同时在3个月温和凋亡被认为在这些老鼠(图2摄氏度⇓和d)。
免疫组织化学反应VEGF-R2 DBA / 2和C57Bl / 6 j小鼠控制如图3所示⇓和d。C57Bl / 6 j小鼠有明显反应扩散在整个实质而令人惊讶的是,DBA / 2小鼠没有任何反应。香烟烟雾暴露后,C57Bl / 6 j小鼠显示在1和3个月逐步递减的免疫反应(图3 e⇓和f)。相比之下,DBA / 2小鼠微不足道的轻度免疫信号被香烟在1和3个月后,分别(图3 b⇓和c)。
至于VEGF免疫组织化学,没有看到差异控制以及实验人群的吸烟两菌株1和3个月后(数据没有显示)。
经过6个月的香烟烟雾暴露,肺气肿是公开的菌株。在C57Bl / 6 j小鼠损伤的特征是传播严重肺气肿的焦点显然还夹杂着正常的薄壁组织(图4 d⇓)。DBA / 2小鼠肺气肿的疫源地分布在什么似乎是一个均匀扩张实质网络(图4 b⇓)。在这两个菌株在这个时间点有显著变化的Lm和ISA。
没有进一步增加这两个参数在10个月的烟表明一定稳定气肿的病变。
病灶纤维化的接触从6个月烟起老鼠的两株,但其严重程度和分布是不同的两种。DBA / 2小鼠,纤维化病变是由胸膜下的焦点(图5⇓)。偶尔,一些地区的肺实质纤维化反应被认为点缀。这些地区有时与肺气肿的焦点。体积密度的纤维化应变为5.2±1.4%和4.8±1.6%在6 - 10个月,分别。这些数据都明显不同(p < 0.05)的各自的控制没有纤维化(0%)。没有纤维化或微不足道的纤维化病灶的C57Bl / 6 j小鼠。这种应变体积密度的纤维化是0.6±0.2%和0.7±0.2%在6 - 10个月,分别。这些值都显著高于各自的控制(0%),但明显低于DBA / 2小鼠在同一时间点。这些变化在两种菌株的特征是积极immmunohistochemical TGF-β反应;然而,尽管这个反应是标记为DBA / 2小鼠(图5 b⇓)只有微弱的C57Bl / 6 j小鼠。
气道变化
有一个显著的区别的两个菌株GCM暴露于香烟烟雾后的发展。C57Bl / 6 j组2的5(40%)动物显示出积极的PAS反应的大型或中型支气管在1个月,12个(75%)在3个月(图6所示⇓14),11(78%)在6个月和7 10个(70%)在10个月。DBA / 2组没有PAS-positive动物在1、3和6个月,只有两个8例(25%)显示一个积极的PAS染色在10个月。
在C57Bl / 6 j小鼠免疫组织化学染色显示阳性反应在气道上皮细胞对il - 4 3和6个月与IL-13和MUC5AC阳性染色(图7⇓,b和c)。
没有区别的菌株deciliation,上皮损伤和修复,用透射电子显微镜评估。因此,它是可能的在同一轴向观察支气管的DBA / 2小鼠3个月后的烟接触(图8⇓)所有形态阶段描述损伤和修复过程。特别是基底细胞上皮细胞分离后积累(图8 c⇓);低分化细胞微绒毛较短的过程中覆盖裸露的区域(图8 e⇓);和气道上皮由区分基底细胞层(图8 d⇓),有可能恢复正常上皮结构如图8 b所示⇓。类似的变化也出现在C57BL / 6 j小鼠。
在两株smoke-exposed老鼠的航空公司,领域的deciliation点缀着正常的纤毛上皮的地区。然而,显然是正常的纤毛地区一个迷失方向的纤毛轴常常可以观察到。图9 b⇓显示了该病变的DBA / 2小鼠3个月后香烟烟雾暴露。相比之下,air-exposed DBA / 2小鼠的纤毛区呈现在图9中⇓。
讨论
本研究的主要观点的异同C57Bl / 6 j和DBA / 2株小鼠的反应慢性香烟烟雾暴露。
老鼠的肺气肿后烟株发达不完整的。然而,DBA / 2小鼠肺气肿发展速度高于C57Bl / 6 j小鼠,已经充分发展接触三个月后。有趣的是,在DBA / 2小鼠肺气肿的疫源地实质之间的网络出现均匀扩张。这个统一的扩张可能导致Lm高值出现在这些老鼠。
这个统一的实质扩张在C57Bl / 6 j小鼠未见。自C57Bl / 6 j小鼠,相比其他菌株的纯系小鼠血清和BALF启德值较低6,12香烟烟雾中氧化剂和敏感6,13的发展,它是合理的假设香烟烟雾诱发肺气肿在C57Bl / 6 j小鼠可能归因于这些危险因素。前危险因素的作用是由积极的免疫组织化学反应的观察小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶的隔膜C57Bl / 6 j小鼠,加上以前的报告描述显著降低肺弹性蛋白香烟烟雾暴露后的内容6。为中性粒细胞弹性蛋白酶的片状分布immunohistological反应气肿病变的分布是一致的。
DBA / 2小鼠BALF有正常的共同价值观。然而,他们对吸烟与BALF的抗氧化能力的下降6。因此可能在当前的研究中观察到的肺气肿可能与氧化剂的敏感性。慢性氧化应激可能导致肺气肿通过直接影响肺矩阵和/或组件通过α的间接影响,如失活1-π14和/或封存的中性粒细胞在肺微血管构筑15。后面这两个因素可能是导致elastolytic增加负担。这也是建议的事实,在这个压力,积极的免疫组织化学反应对小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶在肺泡隔明显,因此可以解释显著降低肺弹性蛋白含量香烟烟雾暴露后报告6。此外,细胞凋亡的作用在DBA / 2小鼠肺气肿的发展不能排除在外。事实上,大量凋亡细胞被均匀分布在整个实质一致的均匀膨胀空气空间中观察到这种压力。细胞凋亡是明显的外观时空气的膨胀空间还没有发育完全。它可能推测凋亡细胞死亡可能是肺气肿的发起者通过促进中性粒细胞弹性蛋白酶的涌入到肺泡隔。同时,接触后,这一毒株凋亡信号烟VEGF-R2加上一个微不足道的信号,这与先前的数据是一致的在实验动物和人类16,17。这些后者研究应力对细胞凋亡作用香烟的氧化应激。同样,在目前的研究对香烟烟雾中氧化剂的DBA / 2小鼠6可能的贡献通过发病机理的凋亡通路的扩张这一毒株的空气空间和肺气肿。这也是支持的发现ICR小鼠对香烟烟雾增加他们的抗氧化能力,也不会发展成肺气肿时,长期暴露于香烟烟雾6。
明确的差异观察关于纤维对香烟烟雾的反应。同时开发的C57Bl / 6 j小鼠没有纤维化或只有微不足道的疫源地的纤维化,纤维化区域位于胸膜下和/或点缀的实质是明显的DBA / 2小鼠。这种差异的原因是未知的。然而,纤维化反应可能归因于不同程度的纤维化细胞因子激活,如TGF-β,在这两个菌株。
香烟烟雾暴露后,最常见的变化观察到航空公司的两株小鼠在电子显微镜deciliation领域。纤毛细胞结束阶段细胞,他们很容易受损,不是由直接部门修理。因此,更换涉及部门和重新通过其他类型的细胞(即。基底细胞)ciliogenesis紧随其后。细胞微绒毛较短,通常覆盖气道上皮细胞,被认为是不成熟的纤毛细胞。
在这两种菌株明显正常的纤毛地区,纤毛轴定向障碍,缺乏统一的视觉效果的基底的纤毛的取向,也见过。相信影响纤毛不表现出协调的运动18。这人类的缺陷通常被认为是一个主要的缺陷与原发性纤毛运动障碍有关。然而,当前的研究的实验条件下,它似乎是一个缺陷二次吸烟暴露。
老鼠明显不同的两个菌株GCM的发展。GCM的出现是一种罕见的事件发生的DBA / 2小鼠很晚烟时期(10个月)。相比之下,GCM在场大多数C57Bl / 6 j小鼠在所有时间点从1月开始接触后烟。在这些老鼠GCM与MUC5AC阳性免疫染色。这是分泌黏液,杯状细胞中表达,至少在男人,可能导致粘液阻塞19。最近,GCM被发现与MUC5AC mRNA的表达和粘蛋白过敏性哮喘小鼠模型19。il - 4和IL-13高效诱导粘蛋白合成和/或GCM在实验系统20.- - - - - -23。同样,中央气道的表达il - 4和IL-13导致粘液分泌过多吸烟和慢性支气管炎24。在目前的研究中,一个积极的免疫组织化学反应对il - 4和IL-13在C57Bl / 6 j小鼠的航空公司。Th2细胞il - 4的影响包括招聘,发布IL-13。因此,一连串的事件组成的香烟烟雾,il - 4, IL-13 GCM和粘蛋白分泌可能是底部的气道变化观察到这里。
很可能的赤字BALF anti-elastase屏幕的C57Bl / 6 j小鼠,再加上他们对氧化剂的发展发挥了重要作用的敏感性的气道这些老鼠的变化。中性粒细胞弹性蛋白酶刺激粘蛋白生产、分泌和释放25- - - - - -27。这种效应是最近发现发生通过表皮生长因子受体的蛋白水解激活涉及TGF-α信号级联28。一个额外的机制提出了涉及活性氧29日。自DBA / 2小鼠对氧化剂敏感,有正常的BALF共同价值观和GCM不发展重要,它可以假定MUC5AC激活的蛋白水解途径更相关的实验条件下,当前的研究。在这个领域的研究正在进行中在实验室目前的作者。
总之,慢性暴露于香烟烟雾中两株小鼠后显示上皮细胞损伤和deciliation在航空领域。然而,外表的GCM C57Bl / 6 j小鼠中常见但罕见的DBA / 2小鼠。自从C57Bl / 6 j小鼠气道变化不会导致阻塞的形态学证据(空气滞留),他们可能不是实质病变的发病机制相关。然而,C57Bl / 6 j模型可以用于解决致病GCM的问题。关于实质变化,两株肺气肿在场但在DBA / 2小鼠发展更快。此外,DBA / 2小鼠开发了一个统一的实质扩张和疫源地的纤维化反应不存在或者在C57Bl / 6 j小鼠微不足道。
总之,应变特征(即。alpha1-proteinase抑制剂水平,对氧化剂和血管内皮生长因子受体2的本构水平)和不同的表型反应(即。细胞凋亡和细胞因子分布)可能条件不同的实质和气道改变香烟。
- 收到了2004年6月7日。
- 接受2004年8月13日。
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