文摘gydF4y2Ba
本研究的目的是比较醛含量造成脂质过氧化在呼出的气息凝结(EBC)和诱导痰(是)上层清液的主题与哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。gydF4y2Ba
醛(丙二醛(MDA)、丙烯醛、gydF4y2BangydF4y2Ba己醛(C6),gydF4y2BangydF4y2Ba庚醛(C7),gydF4y2BangydF4y2Ba壬醛(C9), 4-hydroxynonenal (HNE)和4-hydroxyhexenal(7))在生物体液被液体chromatography-tandem质谱测量。gydF4y2Ba
MDA浓度痰是132.5(82.5 - -268.8)和23.7 nM EBC (9 - 53.7)。同样,C6, C7和C9浓度比EBC高出1.5 - -4.7倍。丙烯醛含量分别为131.1(55.6 - -264.6)和45.3 nM EBC (14.4 - -127.1)。HNE和7的浓度没有显著不同于EBC的水平。醛含量EBC没有任何关联与醛的含量与微分或痰液细胞计数。在慢性阻塞性肺病,MDA EBC,但不是它的对手,与疾病的严重程度负相关。gydF4y2Ba
总之,本文提供的数据表明,醛能被探测到的呼出气息凝结和诱导痰液浮在表面的,但它们的相对浓度是不同的,彼此不相关。因此,对脂质过氧化作用的产品,呼出的气息凝结和诱导痰必须被视为独立的技术。gydF4y2Ba
本研究支持部分由格兰特1 r01 HL72323-01国家心脏、血液和肺研究所(NHLBI;美国贝塞斯达)。其内容是完全的责任作者,不一定代表官方观点NHLBI或国家卫生研究所。gydF4y2Ba
氧化应激是炎症过程的一部分常见许多肺部疾病与慢性气道炎症,如哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。增加氧化应激哮喘和慢性阻塞性肺病患者来源于吸入氧化剂的负担,和活性氧生成一些炎症,免疫细胞和结构的航空公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
氧化应激可以评估和监控通过测定生物标志物的水平,如过氧化氢gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,脂质peroxidation-derived产品,即醛和isoprostanesgydF4y2Ba4gydF4y2Ba和蛋白质羰基化合物gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。氧化生物标记可能会发现在不同的生物样品,如血清gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,支气管肺泡灌洗(BAL)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba、痰gydF4y2Ba9gydF4y2Ba和呼出的气息凝结(EBC)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
当前作者最近建立了一个强大的分析方法同时测定不同的醛类,即丙二醛(MDA),丙烯醛,gydF4y2BangydF4y2Ba己醛(C6),gydF4y2BangydF4y2Ba庚醛(C7),gydF4y2BangydF4y2Ba壬醛(C9), 4-hydroxynonenal (HNE)和4-hydroxyhexenal(7),在液体EBC使用chromatography-tandem质谱(质/女士)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。选中的醛类脂质过氧化物的副产品,它被认为反映oxidant-induced损伤细胞膜不饱和脂质gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。使用这种分析方法,增加水平的醛(主要是MDA)已经证明了EBC的哮喘儿童和成人慢性阻塞性肺病与对照组相比gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。这些数据支持这个安全、简单的使用方法评估氧化应激在肺部疾病慢性气道炎症的生物标志物。gydF4y2Ba
但必须指出,EBC技术仍处于起步阶段,才能成为接受例行调查,进一步的工作是必需的。除了持续改进的技术应用于检测和分析不同的生物标志物EBC,还有缺乏信息的相对比例在其他相关生物标志物的生物液体gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。虽然在一些研究中生物标志物水平与炎症指标相比,EBC已经通过其他有效手段,如痰gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,没有研究已经测量了这些生物标志物在生物体液。Thecomparison生物标志物水平在两个不同的生物液体还可以揭示出抽样的呼吸道内的两个方法是相似或不同的。此外,没有研究应用质/ MS分析痰浮在表面的氧化应激的评估疾病如哮喘或慢性阻塞性肺病。gydF4y2Ba
本研究的目的是比较醛含量EBC的溶胶阶段诱导痰(是)的慢性气道炎症,患者通过一个新的基于质/ MS分析方法。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
轻度到中度哮喘的研究包括10个科目,11个科目与轻度到中度和严重的慢性阻塞性肺病,和9个健康不吸烟的控制。病例和对照组住院患者和健康志愿者招募参加单位和变态反应学和免疫学的康复肺病学单位Maugeri基金会(意大利帕维亚)。研究对象的特征如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
所有的COPD患者符合慢性阻塞性肺疾病的全球倡议(黄金)慢性阻塞性肺病的诊断标准gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。COPD患者有咳嗽和痰生产连续> 2年,对于大多数天连续三个月期间,和固定的气流阻塞,这被定义为post-bronchodilator在一秒用力呼气量(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)/用力肺活量< 70%,FEV post-bronchodilator可逆性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba< 12%,测量基线后,吸入βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂(400µg舒喘灵,gydF4y2Ba通过gydF4y2Bametered-dose吸入器)。所有慢性阻塞性肺病患者有吸烟史(两人目前的吸烟者,50±11.8 pack-yrs),其余患者曾经抽过烟。三个COPD患者正在接受吸入皮质类固醇治疗。gydF4y2Ba
被诊断为哮喘,根据美国国立卫生研究院的指导方针gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba组成的,如增加FEV≥12%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在回应一个支气管扩张剂。三个哮喘病患者当前吸烟者(8.8±4.4 pack-yrs)和剩余的哮喘病患者是不吸烟者。三个哮喘病患者正在接受吸入皮质类固醇治疗。gydF4y2Ba
没有COPD和哮喘患者在口服糖皮质激素和没有报告任何恶化的症状(恶化)前至少2周EBC并集合。gydF4y2Ba
这项研究符合赫尔辛基宣言,Maugeri基金会的内部审查委员会批准。从所有患者知情同意了。gydF4y2Ba
研究设计gydF4y2Ba
这是一项观察性研究,受试者被要求收集EBC第一,紧随其后的是诱导痰。EBC和样本存储在相同条件下(−80°C)同一段时间(≤8个月)。gydF4y2Ba
呼出的气冷凝收集gydF4y2Ba
EBC收集的样本在冷凝装置,由两个玻璃钱伯斯(Incofar Srl、深紫色、意大利),如前所述21。短暂,受试者,没有鼻夹,指示totidally用嘴呼吸到双向nonrebreathing阀(Mallinckrodt医疗Srl、深紫色、意大利)20分钟。唾液污染降到最低,双向阀作为唾液陷阱,有12厘米带状管垂直定位喉舌和冷凝装置,当志愿者的嘴里仍低于设备的进口。此外,受试者被要求定期咽下口水。的唾液污染EBC样本被测量唾α-amylase排除在外。EBC样本然后立即存储在无菌聚丙烯试管−80°C。LarstadgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba此前报道称,EBC样品可以存储3个月在−80°C没有损失。这个观察进一步扩展在最近的研究中,表明EBC醛水平没有统计学上改变存储长达8个月时−80°C(数据没有显示)。gydF4y2Ba
长期的再现性醛测量在一群EBC评估正常吸烟者(n = 15),连续5次评估,收集六周时间。gydF4y2Ba
痰诱导和收集gydF4y2Ba
痰是诱导和加工的变态反应学和免疫学单位Maugeri基础。根据国际准则得到吗gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。简单地说,FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba测量之前和之后10分钟吸入舒喘灵(200µg)。超声nebulised (De Vilbiss 65;美国德Vilbiss有限公司,萨默塞特,PA)高渗盐水(4.5%)被吸入1,2,4,6和16分钟。FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba测量1分钟每次吸入后时期。受试者被要求用水充分冲洗口,咳嗽和产生痰每次吸入后时期。gydF4y2Ba
是保存在4°C处理开始在2 h。根据文献进行处理gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。简单地说,从唾液痰插头被选中,与体积重和治疗(µL) 0.1%的二硫苏糖醇(德勤)(sputolysin 10%;美国Calbiochem拉霍亚,CA),稀释3%牛血清白蛋白(BSA),等于4倍(µL)痰栓的重量(毫克)。是样本混合和孵化37°C,持续15分钟。随后,同等体积的磷酸缓冲盐(PBS)被添加到混合,过滤70 -µm细胞过滤器(猎鹰;美国新泽西,正欲富兰克林湖)。细胞被分离从上层清液离心300×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟和稀释1% BSA在PBS的体积等于体积德勤第一补充道。细胞计数和可行性的台盼蓝排斥与光学显微镜测定。Cytospins沾Diff-Quick(戴德Diagnostika GmbH, Unterscheiheim,德国)和微分细胞计数分析。痰液样本与< 30%鳞状细胞被认为是可以接受的。痰液上层清液储存在−80°C。gydF4y2Ba
在初步实验,验证,添加0.1%德勤醛类水标准的混合物,以及天真EBC样本,及其随后的孵化并不影响任何醛的浓度,也当10-fold-more浓溶液(1%德勤),也不是当孵化持续60分钟(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
醛测量gydF4y2Ba
醛EBC和分析是进行工业毒理学实验室的大学的帕尔玛(意大利帕尔马)。醛在EBC,即MDA,丙烯醛,7,HNE, C6, C7和制备过程,测量与2 derivatisation之后,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)质/女士(API 365;珀金埃尔默Sciex, Thornhill,加拿大),如前所述gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。简而言之,分析物的电离作用是通过大气压化学电离作用,在正离子模式下对MDA和所有其他醛在负离子模式下。DNPH衍生物分离在Supelcosil C18 DB列(75×4.6毫米内径,3µm;Supelco;Bellefonte,宾夕法尼亚州,美国),使用变量比例20毫米的水乙酸和甲醇。gydF4y2Ba
样品制备过程是适用于痰液样本。样本添加使用derivatising代理(DNPH)溶解在乙腈,漩涡和离心机10000×gydF4y2BaggydF4y2Ba4分钟,为了获得蛋白质的沉淀。随后,20µL上层清液的注入质/ MS系统和分析。gydF4y2Ba
由于小样本体积,是不可能将标准添加法应用于每一个样本。校准是由飙升样本与标准混合物池时,为了获得浓度增加20 - 200 nM范围为MDA,丙烯醛,C6, C7和制备过程,为7和HNE(范围1 - 20 nM rgydF4y2Ba2gydF4y2Ba> 0.997)。醛测量的intra-session可变性是所有分析物在2 - 8%。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
数据值(范围)。比较组间被Mann-Whitney评估紫外线测试和Wilcoxon matched-paired测试,在适当的时候。变量之间的相关性进行评估的斯皮尔曼等级测试。假定值< 0.05表示统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
临床和安全gydF4y2Ba
和EBC收集没有显著的不利影响。gydF4y2Ba
醛诱导痰和呼出的气息凝结gydF4y2Ba
MDA, C6, C7和C9检测所有样品的生物标本。丙烯醛是没有检测到任何控制标本,但在EBC检测。7在19和21个样本检测,EBC,分别。HNE 22和23个样本中检测到的是和EBC,分别。gydF4y2Ba
醛的平均变异系数(%)测量EBC是:为MDA 18.5±7.8;12.6±10.1丙烯醛;34.7±12.7 7;HNE 25.2±13.0;C6 17.0±7.9;为C7 20.5±8.9;制备过程和17.7±8.0。gydF4y2Ba
不同的醛类的色谱测量样品如图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。这个例子演示了识别的可行性研究醛的上层清液是通过质/女士。gydF4y2Ba
考虑到所有情况下,不同醛水平高于EBC(无花果2水平gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和表3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。在这种背景下,MDA浓度分别为132.5(2.5 - -268.8)和23.7 nM (9 - 53.7) EBC (p < 0.01)(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。同样,C6, C7和C9浓度高出1.5 - -4.7倍比EBC(图。3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。丙烯醛含量131.1海里(55.6 - -264.6)和45.3海里(14.4 - -127.1)在EBC (p < 0.001)。相比之下,羟化醛的浓度(7和HNE)的浓度没有显著不同于EBC(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
没有不同的醛浓度在是和哮喘和慢性阻塞性肺病患者EBC之间(表3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。没有观察到醛含量的差异是和EBC之间患者吸入激素治疗和那些werenot。gydF4y2Ba
在控制、MDA、C6, C7和C9浓度比高EBC样本。相反,丙烯醛含量只在EBC但不是是样品检测。MDA、丙烯醛、C6比控制水平较高的情况下,在两个标本(表3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
相关性gydF4y2Ba
醛含量是没有任何关联的醛含量EBC,对案件或控制。与EBC相比,一些醛在显著相关,考虑所有科目:MDAgydF4y2Ba与gydF4y2BaC6 (r = 0.7, p = 0.0004), C6gydF4y2Ba与gydF4y2Ba制备(r = 0.6, p = 0.004), C7gydF4y2Ba与gydF4y2Ba制备(r = 0.6, p = 0.003)。gydF4y2Ba
和EBC醛水平没有与微分痰细胞计数,在哮喘和慢性阻塞性肺病。在慢性阻塞性肺病,MDA水平与FEV EBC负相关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba%预测(r =−0.70, p = 0.01)(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而醛含量之间没有相关性观察EBC在哮喘和肺量测定的值。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
通过质/ MS测定醛浓度,并使用它们作为生物标记物的氧化应激和脂质过氧化和EBC的慢性气道炎症患者,这项研究表明:1)它是可行的衡量醛浓度使用这种技术在上层清液以及EBC;2)在EBC大部分醛浓度较高,和醛含量是EBC没有关联;3)醛和EBC不与细胞结构;4)一些醛的浓度是彼此有显著相关性;5)在慢性阻塞性肺病患者,EBC中MDA的含量,但不是在与FEV呈负相关gydF4y2Ba1gydF4y2Ba值。gydF4y2Ba
最好的作者的知识,这是第一个报告证明生物标志物的脂质过氧化(醛)可以衡量质/女士在EBC的主题以及慢性气道炎症。因此,这个机会比较一些生物标记物的浓度的脂质过氧化作用在不同生物液体取样肺部分泌物通过非侵入性技术。更高水平的除了羟化醛(7和HNE)是观察与EBC;EBC醛水平没有任何关联与各自的浓度。gydF4y2Ba
几个可能的解释可能解释这样的结果。1)不同稀释因素。是用水稀释可能低于EBC;事实上,众所周知,EBC由aerosolised粒子与一个非常大量的水蒸气稀释gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。在这方面,它是承认一个适当的分析对比化合物在不同生物液体需要每个液的稀释因素的知识,为了比较绝对的摩尔数,而不是浓度。然而,是和EBC,在这一阶段的研究中,关于金本位稀释系数还没有可用的。此外,它会有一个比较感兴趣的标记(如总脂质或由氧化脂质不变的),比较氧化产品。这将不是一个稀释标记,而是一种化合物可以作为一个内部监测氧化不平衡。2)不同组成和EBC。痰可以被认为是一种生物凝胶,高浓度的不同类型的细胞和酶gydF4y2Ba26gydF4y2BaEBC可以被认为是水溶液中,低浓度的盐、脂质和蛋白质。因此,醛的退化和/或生物转化中是不同的。3)肺内的不同的抽样。可以推测的是样品主要是近端航空公司的技术gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,大部分的气道分泌物可能更为集中,而EBC被认为更紧密地反映肺泡衬液的成分,因为更大的表面积,代气溶胶可能发生gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在不同的生物标记,只有MDA、丙烯醛和C6明显区分情况和控制,在两个EBC是;因此,这些生物标记物可以作为有用的指标提出调查肺部疾病。然而,与年龄性别匹配的控制是需要进一步的研究来进一步验证横断面研究。gydF4y2Ba
有趣的是,丙烯醛中没有检测到任何来自控制,但可测量的水平存在于各自的EBC标本。一个可能的解释的数据可能与丙烯醛的反应活性高,这可能会导致丙烯醛加合物;可能的潜在目标数量是EBC相比是低得多。相反,丙烯醛含量总是可检测的情况下,可能是因为高水平相比的控制。gydF4y2Ba
实际结论来自这些数据,对脂质过氧化作用的产品,EBC,是必须被视为独立的矩阵。gydF4y2Ba
评估氧化应激,落下帷幕,和EBC曾。然而,没有黄金标准的无创性评估脂质过氧化作用。因此,目前尚不清楚这技术是“更好”或者“更准确”。gydF4y2Ba
而在EBC没有不同醛之间的相关性被发现,一些醛是重要的相互关联。一个正在进行的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验在目前作者实验室旨在评估波动是否会影响各种醛EBC的恢复,可以部分解释数据;事实上,它验证了更多的挥发性醛类,即丙烯醛和饱和醛(但不是MDA波动较小),可能是由于其较高的蒸汽压力在生理温度,更难以捕捉任何冷凝器使用和可能是丢失了,在某种程度上,呼出的气体和蒸汽阶段空气。这也许可以解释缺乏相关性,观察醛中EBC。相反,是浓度似乎每个物质和波动的影响较小,因此,它可能被视为更均匀采样气道分泌物的方法。然而,浸润细胞及其碎片可能代表醛的来源。因此,后者可能代表不那么相关生物标记物的氧化应激和lipoperoxidation上皮细胞膜。gydF4y2Ba
醛含量与肺功能不相关。符合Paredi的结果gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba显示呼出乙烷,脂质过氧化作用的另一个生物标记,与COPD气道阻塞,MDA之间找到了一个负相关EBC和疾病严重程度,FEV的评估gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在这项研究中。MDA在EBC和FEV之间的相关性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba不是哮喘病患者的观察,可能是因为他们中的大多数正常肺功能测试。丙烯醛和饱和醛值EBC没有与肺功能;因此,相比于其他醛,MDA似乎是一个更好的生物标志物来评估COPD严重性。然而,主要是由于低数量的受试者招募,还需要进一步的研究来确定呼出MDA可能对慢性阻塞性肺病严重程度进行评估。此外,MDA(相对挥发性物质)之间的负相关关系,FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba也可以由一个微分稀释相同的MDA产量变量值的呼出空气。gydF4y2Ba
EBC和醛的浓度是不区分哮喘和慢性阻塞性肺病患者,这可能与脂质过氧化的事实不是一个针对疾病的过程。然而,认识到病人的特点很异类,因为有些是吸烟者,而另外一些则是使用类固醇。这些差异和数量有限的科目不应影响EBC和之间的比较(研究的主要目的),尽管他们可能意味着还需要进一步的研究来更好的哮喘患者和慢性阻塞性肺病患者对这些参数进行比较。gydF4y2Ba
这里给出的数据是符合Paredi和同事的出版物gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,谁发现了类似哮喘的呼出乙烷含量(2.06 ppb(含量)和慢性阻塞性肺病(2.77磅)。相反,微分细胞计数明显区分哮喘和慢性阻塞性肺病。后者的数据是完全与以前的研究一致gydF4y2Ba32gydF4y2Ba和支持的有效性是用于描述细胞在气道炎症过程和呼吸道疾病之间的差别gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
MDA的测量作为氧化应激的标记已经被一些批评。然而,这主要是与MDA的事实通常是量化的硫代巴比土酸反应物质测定(稍后通知),这是一个通用的分析生物样品中的脂质过氧化(MDA代表只有一小部分检测氧化产品,形成和TBA-reactive材料在加热的样品)gydF4y2Ba35gydF4y2Ba。增加特异性的MDA的决心,以前的作者已经成功地测量了采用高效液相色谱法测定醛(MDA和HNE)gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。进一步提高测量数据的质量,是醛和EBC测定质/女士在这项研究中,目前被认为是参考技术分析分析gydF4y2Ba37gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在目前的研究中,MDA的含量,C6、C7 EBC的慢性阻塞性肺病患者低于之前报道gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,从而强调指导方针的需要定义标准化的程序,和限制差异由于冷凝设备和采样技术。这不会消除差异的研究由于受试者接受检查的特点。此外,长期再现性的评估选定的生物标志物的EBC表明,一定程度的变异存在于结果。可能的正常化EBC数据与选定的变量,如压缩空气呼出的数量或内部标准,可以减少这种可变性。gydF4y2Ba
总之,本研究中给出的数据显示,大多数醛诱导痰液的浓度更高比呼出的气息凝结,而醛水平抽样方法之间没有关联。因此,对脂质过氧化作用的产品,呼出的气息凝结和诱导痰必须被视为独立的技术。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2004年1月8日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2004年8月6日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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