抽象的
肺泡蛋白沉积症(PAP)是一种罕见的疾病,组织学上以肺泡内嗜酸性和周期性酸-希夫阳性物质的细颗粒堆积为特征。
在一项回顾性研究中,采用免疫组织化学和免疫印迹的方法分析了成年PAP患者肺泡内堆积物质的组成。
在患有PAP的患者中,目前的作者发现了表面活性剂蛋白(SP)-A,SP-B,SP-B,SP-B的前体的肺泡积累,单体,二 - 和低聚SP-C形式的形式以及SP-D。仅在一个患者中只检测到SP-C的前体。通过免疫电子显微镜检查,目前的作者不仅鉴定了标记为SP-B和SP-C的前体标记的输送囊泡,而且还鉴定了II型肺泡中的II型肺细胞中的SP-B或SP-C前体的囊泡人肺。
结论:成人肺泡蛋白沉积的特点是肺泡内表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B的前体、表面活性剂蛋白B、C和d的积累。运输也异常分泌囊泡含有表面活性剂前体蛋白B(但不是表面活性剂蛋白质C)和表面活性剂蛋白质C的棕榈酰化不足,这可能导致形成寡聚表面活性剂的蛋白质和di - C形式,在肺肺泡蛋白质沉积症的发病机制中发挥作用。
该研究由NIH P01-19737(M.F.BEERS)和NIH HL-59959(S.H.Guttentag)部分支持该研究。
肺泡蛋白沉积症(Pulmonary alveolar proteinosis, PAP)于1958年由Rosen首次描述et al。1作为一种独特的肺障碍,其特征在于通过细粒嗜酸性嗜酸性和周期性酸 - 席夫(PAS)正材料的肺泡积累。PAP代表新生儿,婴儿和成年人的异质性,特发性或继发性疾病。成年人的特发病是最常见的形式。最近,已经表征了对成年性患者患者的粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)的中和抗体已经表现了,并且已经表明这种自身抗衡性是对特发性PAP的诊断2那3..GM-CSF的应用可以纠正GM-CSF缺陷小鼠的表面活性剂积累。此外,GM-CSF在肺上皮细胞中的选择性表达和GM-CSF的给药显示了特发性PAP患者的治疗活性4.那5..在几种临床环境中报道了继发性肺泡蛋白病;它包括对感染和吸入矿物质或化学物质的异常反应,或者可能与潜在的疾病相关,例如淋巴瘤和急性和慢性白血病6..
尽管肺泡内表面活性剂脂质、表面活性剂蛋白(SP)-A、SP- b和SP- d在特发性PAP的成年患者中已得到证实6.几乎是关于SP-C的,以及SP-B和SP-C的前体。在回顾性研究中,通过免疫组织化学和蛋白质印迹分析了成年性发育性和次毒毒剂的成年患者的肺泡累积材料的组成。
材料和方法
肺泡蛋白沉积症患者
在26例成年患者中,肺泡蛋白病被诊断为症状,计算机断层扫描扫描和跨血管(21名患者)或肺活量(四名患者)或支气管肺泡灌洗(BAL)液(一名患者)7.那8..所有患者中排除了肺部感染。根据标准程序进行血清毒素和PAS染色。BAL流体可从12名患者获得。通过K.Nakata(Deptory疾病,日本,日本国际医疗中心,日本,日本东京,日本国际医疗中心,日本,日本,日本)3..这些患者中的两个包括在先前进行的GM-CSF治疗研究中5..表盘患者的基线特征总结在表1中⇓.
正常的人类肺
作为免疫组织化学和免疫电子显微镜(EM)的对照,使用了来自10例尸检病例的八种非翻译人单身体育肺和肺标本(对急性心脏衰竭的患者死亡并且没有肺病的历史)。只有在荷兰莱顿莱顿莱顿,莱顿才能提供适合的受援人员,才用于调查供体肺。所有的肺部都经过两名董事会认证的病理学家(F. Brasch,K.M.Müller)仔细检查。没有用于目前研究的尸检的非翻倒的供体肺和肺标本显示出任何病理变化。通过滴注固定剂进行人肺的固定通过确保快速、均匀的固定。
人体II型肺细胞
如前所述制备了分离的II型肺细胞9..简单地说,1毫米3.在Waymouth的培养基中过夜培养来自于妊娠中期治疗性流产的人胎儿肺实质的组织外植体(方案由美国费城儿童医院人类研究委员会批准)。过夜培养后,在培养基中加入10 nM地塞米松、0.1 mM 8-Br-cAMP和0.1 mM异丁基甲基黄嘌呤,培养6-7天诱导ii型细胞分化。ii型肺细胞从组织外植体中通过酶消化和在塑料培养皿上淘洗去除成纤维细胞分离。
抗血清
对SP-A的单克隆抗体PE-10购自达科(Glostrup,Denmark)。对成熟SP-B的兔抗血清购自Chemicon(Cemecula,Ca,USA)。用Y.Suzuki(日本京都大学的超微结构研究部门,讨论危害人类SP-B的单克隆抗体。通过例如,对SP-D的多克隆抗血清是由克劳奇(病理学和免疫学,Barnes-jewish医院,圣路易斯,Mo,Mo,USA)提供。使用重组C末端肽产生针对SP-B ProProtein(抗Prosp-B)的多克隆兔抗血清。针对PROSP-C熵E的多克隆抗血清11.-R.23.(抗prosp-c)以前特征在于10.那11..针对成熟重组人SP-C的多克隆抗血清是由W. Steinhilber(Altana Pharma,德国Konstanz)提供的。
免疫组织化学
如前所述,进行了来自罂粟,非翻译人单身体育肺和尸检病例的肺试样的组织制剂和免疫染色12.那13..简而言之,根据制造商的规格(Techmate 500; Dako),在自动染色系统中进行脱蜡石蜡切片的免疫染色。使用碱性磷酸酶 - 抗碱性磷酸酶试剂盒(DAKO)来证明免疫反应。快速红色(DAKO)用作碱性磷酸酶底物。
统计分析
肺泡内材料的染色根据以下系统进行分级:0级,肺泡内没有染色;1级,只有肺泡内的焦点染色;2级,超过五个肺泡完全填充了中度染色的材料;3级,超过五个肺泡由强烈染色的材料完全填充。所有部分都被技术人员蒙蔽,并由三个调查人员独立分级(F. Brasch,J.Birzele和K.Müller)。使用Mann-Whitney Rank Sum Rese进行分析对照和PAP之间的差异。
免疫电子显微镜
如其他地方详细描述的,进行组织制剂和正常人肺的免疫标记12.那13..简单地说,根据以下步骤,从低温取代和Lowicryl hm20包埋(Polysciences, Eppelheim, Germany)肺标本中提取超薄切片,对pro - b、pro - c和SP-B进行三标记。首先,用抗pro - b多克隆抗血清和抗SP-B单克隆抗体标记切片,无需在网格上安装。用10nm抗兔和15nm抗小鼠金偶联抗体孵育,观察免疫反应。最后,将切片用贴有标签的平面向下安装在formvar涂层的铜或镍网格上,并干燥过夜。第二天,在栅格上标记针对pro -c的第3个一抗和第2个5nm抗兔金偶联抗体。用Leo em900电子显微镜(Leo, Oberkochen, Germany)在50 kV下系统地观察和拍照标记的切片。
Western印迹分析检测表面活性剂蛋白
对于免疫印迹,在4-12%的纽扣双三丙烯酰胺凝胶中分离II型肺细胞的肺泡蛋白变液或萃取物,然后根据制造商的方案(Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA)转移到硝化纤维素膜中。封闭后(2小时在5%胎牛血清/ 0.1%Tween20 / 0.5%牛血清白蛋白内肠缓冲盐水pH 7.5)中,用针对PROSP-B,SP-B或PROSP-C的抗体一起温育膜。抗兔免疫球蛋白G碱性磷酸酶缀合物(底物:硝基苯甲醛/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐)用作二抗(Promega,Madison,Wi,USA)。为了检测SP-B的前体,SP-B和SP-C的前体,在未还原条件下进行Western印迹。由于SP-C在蛋白蛋白患者中形成淀粉样蛋白原纤维,其可以仅通过钠二亚甲基磺酰酸盐 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳来解决,因此在未还原和还原条件下进行免疫印迹-C(图1⇓).
结果
正常人肺中表面活性剂蛋白的分布
如前所述13.SP-A显示ii型肺细胞的弱标记和肺泡上皮表面的局灶性阳性染色(1级;图2一个⇓).SP-B的前体弱染色II型肺细胞(图3A⇓),但显示成熟SP-B的强颗粒染色(图4A⇓).在肺泡空间,SP-B(1级;图4A⇓)被发现,但没有SP-B的前体(0级;图3A⇓),如前所述详细描述14..PROSP-C的免疫组织化学染色仅限于人肺中的II型肺细胞(图5A⇓)如前所述12..仅观察到ii型肺细胞SP-D染色非常弱,肺泡中仅局部呈阳性染色(1级;图6⇓)被检测到。
为了表征含有SP-B的前体的细胞内隔室,在正常人肺中的SP-B和SP-C的前体,进行免疫 - EM三重标记。发现GOLGI囊泡含有SP-B(10-NM金颗粒)或SP-C(5-NM金颗粒)的任一种前体(图7A⇓).Golgi囊泡不含SP-B(15纳米金颗粒),也没有Golgi囊泡,具有SP-B和SP-C的两个前体。检测到两种类型的多物体体(MVB)并定义为类型-A或-B MVB;类型-A MVB含有SP-B和成熟SP-B的两体,但是没有SP-C的前体(图7A⇓).b型mvb含有SP-B和SP-C的前体,有时还含有成熟SP-B(图7b)⇓).SP-B(15纳米金颗粒;图7a和b⇓).此外,SP-C的前体也被用在复合体中和如前所述的少量层状体中鉴定12..
人ii型肺细胞的电泳分析
在II型肺细胞中,抗PROSP-B(图3E⇑)确定了SP-B(〜23kDa和〜17kDa)的两种前体。此外,II型肺细胞含有成熟的单体〜8kDa和二聚体~18kDa sp-b(图4D⇑).抗PROSP-C鉴定〜21kDA,~14kDA和〜10kDA前体的SP-C(图5D⇑)和抗SP-C检测II型肺细胞中的单体SP-C(图1⇑).
肺肺泡蛋白缺血中表面活性剂蛋白的分布
在所有PAP患者中,超过5个肺泡被SP-A染色较强的物质完全充满(3级;图2b和c⇑)和SP-D的中等至强的染色(2-3级;图6B和C.⇑).与正常人肺相比(图3A⇑),PAP中的肺泡累积材料显示出SP-B前体的中等至强染色(2-3级;图2B-D⇑),而II型肺细胞的染色模式(图3B⇑)类似于正常的人肺(图3A⇑).对应于SP-B的前体的肺泡内材料的中等至强的染色,抗PROSP-B鉴定了所有PAP患者的BAL流体中的SP-B〜23kDa前体(图2E⇑;患者1 - 12)。此外,在4例患者的BAL液中检测到SP-B的一个~ 17kda前体(图2e)⇑;患者2,4,7和11)。
Anti-SP-B显示中-强染色(2-3级)的肺泡内堆积的物质(图4b和c⇑).所有患者的BAL液中均存在二聚体~ 18 kDa和不同数量的单体~ 8 kDa SP-B(图4d)⇑;患者1 - 12)。SP-A中肺泡材料的免疫组织化学染色模式的统计分析,SP-B(PROSP-B)的前体,成熟SP-B和SP-D显示对照和PAP之间的显着差异(P <0.0001)。
在所有情况下,抗Prosp-c适度染色的II型肺细胞(图5B⇑).只有1例患者观察到肺泡内物质(2级)染色(未显示),BAL液中检测到SP-C的约12 kDa前体(图5d)⇑;患者8)。然而,对照和PAP的染色模式之间的差异不足以排除差异是由于随机采样的可变性的可能性。
可变量的单体〜4kDa,二聚体〜8kDa,oligomeric〜12kDa,以及PAP患者的BAP液体中的~16kDa SP-C形式在未还原下的BAL流体中发现(图1B⇑)和还原条件(图1c⇑).只有在患者8中是一种异常〜5kDa SP-C检测到(图1B⇑).
讨论
最近的研究表明GM-CSF信号在表面活性剂稳态中起重要作用。GM-CSF-和常见β-链缺陷小鼠在肺泡腔内逐渐积累表面活性剂脂质以及SP-A、SP-B、SP-C和SP-D,类似于人类PAP15..采用免疫印迹法回顾性分析了5例特发性PAP患者治疗前血清中gm - csf中和自身抗体3..符合已发布的数据2-4.,在每个病人身上都发现了一种中和抗体。2例患者发生继发性PAP,要么是急性硅暴露(急性硅蛋白沉积),要么与骨髓增生异常综合征相关。继发性PAP是接触二氧化硅或钛后的一种罕见的肺部并发症,或在造血源的恶性肿瘤患者中,文献中只有少数病例被描述6..矽肺引起的肺泡蛋白沉积的动物模型表明,蛋白沉积与表面活性剂生物合成、分泌和清除之间的不平衡有关16..然而,由于SP-A,SP-B,SP-C和SP-D的未妨碍表达,它已被HASBEEN表明,由于抑制GM-CSF的作用,肺泡巨噬细胞的表面活性剂清除损伤,可能在GM-CSF和白细胞介素(IL)-3 / gm-CSF / IL-5βC-受体缺陷小鼠中提出杂志4.那17.-19..
对照组,SP-B和SP-D在对照和PAP与PAP的动物模型和生物化学发现中,SP-A,SP-的生物化学结果良好的免疫组织化学染色模式的显着差异。B和SP-D在人类的肺泡蛋白酶发球菌中增加20.-23..然而,使用免疫组织化学和蛋白质印迹,在所有患有PAP的患者中也发现了SP-B前体的显着肺泡积累。由于目前的作者和其他人在正常人肺中,因此目前的作者和其他人没有发现SP-B的前体或肺泡巨噬细胞14.那24.,PAP中SP-B前体的异常肺泡外观不能仅通过表面活性剂组分的缺陷清除来解释。
SP-B在II型肺细胞中合成为381-氨基酸40-KDA ProProtein(Prosp-B)25..蛋白的加工包括信号肽的裂解、c端糖基化、n端和c端前肽的裂解11..PROSP-B的翻译后处理发生在GOLGI复合物和MVB之间的II型肺细胞中,在将成熟的SP-B转移到层状体和肺泡空间中的分泌物之前11.那24..在正常人肺和PAP中,ii型肺细胞SP-B呈中到强颗粒状染色模式,与SP-B主要位于板层小体的定位一致。尽管PAP肺泡腔内SP-B前体聚集,抗pro - b染色的ii型肺细胞胞浆与正常人肺相似,但未染色板层小体。由于在肺泡蛋白沉积液中发现的前体,PAP在大小和抗原特征上与人ii型肺细胞中pro - b的加工中间体非常一致,因此在PAP中pro - b的异常酶加工似乎不太可能。染色模式和生化数据均提供了间接证据,说明未充分处理的pro - b可能会绕过板层体分泌到肺泡腔。
通常接受,在生理条件下,SP-B和SP-C均通过MVB与层状体一起递送,并用肺泡中的层状体分泌26.那27..SP-C由ii型肺细胞合成为21-kDa蛋白(pro -C),经过翻译后的C-和n端加工28.那29..虽然在mvb中完成了pro - b的加工,但在复合体和层状体中,加工中间至成熟SP-C的~ 6 kDa pro - c的最后n端加工步骤发生12.那29..尽管SP-B和SP-C的运输和分泌通过在生理条件下的途径相同,仅在一个患者用PAP的患者中检测到肺泡表面活性剂中的SP-C中的前体。
为了研究正常人肺中SP-B和SP-C在II型肺细胞中的细胞内分布,进行SP-B和SP-C的前体和成熟SP-B的免疫组成三重标记。当前作者鉴定了含有SP-B或SP-C的前体的高尔基囊泡和电子光MVB,以及A型(用于SP-B的前体和成熟SP-B的染色,但不是SP-前体c)和型B(SP-B和SP-C前体染色,偶尔,成熟的SP-B)MVB。以前,显示MVB是含有SP-C或组织蛋白酶的前体的囊泡的融合产物12..大多数数据表明Prosp-C是插入II型跨膜构型膜中的整体膜蛋白,其具有位于细胞质中的PROSP-C的N-末端29..N-末端的肽是必要的,并且足以使PROSP-C靶向出现的断裂带隔室,但不是层状体,并且可以参与含有SP-C或SP-B的前体的囊泡的融合29.那30..符合生化数据,表明SP-B是最终加工和SP-C前体的预处理到层状体所必需的31.未鉴定出只含有SP-C前体的mvb。a型和- b型mvb的鉴定也与SP-C -/-小鼠的数据一致,其中SP-B已被观察到正确的处理和贩运,以及SP-B -/-小鼠的数据,其中SP-C处理不足已被描述32.那33..此外,在具有SP-C基因的杂合突变的全术婴儿中,仅检测仅含有SP-C前体的小囊泡的聚集体,而P-B和SP-B的前体通常分布(F. Brasch,未发表的观察)。生物化学和免疫 - EM数据一起提供间接证据,即SP-B和SP-C在生理条件下被路由到层状体,同时在特发性和次要毒率的病理条件下,含有SP-B前体的输送囊泡,但不是SP-C可以分泌到肺泡空间中,绕过层状体(图8⇓).
成熟SP-C是一种极其疏水的、单体和二棕榈酰化的蛋白质,分子质量约为4 kDa34.那35..在特发性和继发性PAP患者的BAL液中,抗SP-C不仅鉴定出了单个~ 4kda SP-C,而且还鉴定出了与二聚体和寡聚体SP-C形式相对应的~ 8kda、~ 12kda和~ 16kda的谱带。在还原条件下,单体SP-C形式强度的增加,伴随着二聚体和低聚体SP-C形式的减少,与二硫化物连接的二聚体和低聚体SP-C形式一致,这些形式是通过部分甚至完全去除棕榈酸酯残基来修饰的36.那37..pro - c的棕榈酰化似乎与蛋白靶向无关,因为通常进行棕榈酰化的半胱氨酸残基的替代并不影响蛋白质的分类38..二聚体SP-C可能与肺泡内表面活性剂蛋白的积累有关;由于它从肺中清除的半衰期增加,不能从肺泡巨噬细胞中清除,并且阻碍肺泡巨噬细胞对SP-B和单体SP-C的清除。此外,二聚体SP-C对肺泡巨噬细胞有毒性通过增加反应性氧层的形成39.那40.
总之,目前作者的数据表明,肺肺泡蛋白病的特征不仅是由表面活性剂蛋白A,B和D的肺泡积累,而且还通过表面活性剂蛋白B和单 - ,二 - 和低聚表面活性剂蛋白的前体C表格。此外,目前的数据提供了证据,不仅肺泡巨噬细胞的表面活性剂清除损害,而且还含有表面活性剂蛋白B(但不是C)前体的转运囊泡的anabnormal分泌,并且表面活性剂蛋白C的不充分的棕榈酰基棕榈酰基二聚 - 和低聚表面活性剂蛋白C形式的形成,在肺肺泡蛋白病的发病机制中起作用。
致谢
作者谨此感谢Nakata分析VER 5患者的预处理SERA,为GM-CSF中和自身抗体,G.Goeckenjan,W.Hartmann,P. Heitz,E.Kaukel,D.Köhler,U. Schmid那G。Schultze-Werninghaus, H. Steppling, H-N. Macha, J. Altenwerth, C. Eschenbruch, H. Heyenga, W. Jochum, R. Kappes, C. Oehlschlegel, J. Schildge, E. Scholtze and P. Wex for the referral of lung biopsies and BAL fluid from patients with PAP. The excellent technical assistance of S. Geiger, M. Kochem and U. Thomek is highly appreciated.
- 已收到2003年7月3日。
- 公认2004年5月3日。
- ©ers Journals Ltd