抽象克ydF4y2Ba
痰标本应诱导防止细胞退化后不久进行处理。用于中间储存,冷冻样品均质化或直接固定的已被证明适合于细胞离心涂片。这项研究的目的是探讨通过流式细胞仪是否冻结或痰直接固定影响淋巴细胞亚群的分析。克ydF4y2Ba
从24份痰标本中挑选的塞子均化。立即处理一份小份样品,并用流式细胞仪进行分析。第二份等分试样均匀化,加入二甲基亚砜后在-20°C下冷冻,并平均保存6天。在6个样品中,第三份等分样品在诱导后固定在福尔马林中,并在进一步加工前保存72 h。克ydF4y2Ba
与直接处理相比,冷冻后总淋巴细胞和T抑制细胞的百分比升高,T4/T8比值略有下降。自然和冰冻标本中淋巴细胞总数、辅助性T细胞和抑制性T细胞的比例相关,类内相关系数分别为0.74、0.85和0.70。福尔马林固定小份不能用抗体分析。克ydF4y2Ba
结论:冰冻保存痰标本可作为流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8淋巴细胞亚群的一种适宜方法。与受试者之间的差异相比,其影响较小。克ydF4y2Ba
这项研究是由Landesversicherungsanstalt(LVA)的支持 - 柏林自由UND Hansestadt汉堡和劳动克莱默博士UND Kollegen,盖斯特哈赫特,德国。克ydF4y2Ba
通过流式细胞术可以分析痰细胞以获得淋巴细胞亚群的数据克ydF4y2Ba1个克ydF4y2Ba以及细胞内细胞因子的产生克ydF4y2Ba2个克ydF4y2Ba。对于细胞针上的差异细胞计数,建议在咳痰后立即处理痰液,以防止细胞降解克ydF4y2Ba三克ydF4y2Ba. 有人建议,冻结或固定痰可以延长处理时间,例如,可以将痰输送到专门的实验室克ydF4y2Ba4个克ydF4y2Ba。本研究的这个目的是利用冷冻和固定方法,以评估对细胞亚群的流式细胞术分析的中间存储的效果克ydF4y2Ba4个克ydF4y2Ba。克ydF4y2Ba
材料和方法克ydF4y2Ba
学科克ydF4y2Ba
对18例患者共24份痰标本进行分析。6名受试者健康(2名男性/4名女性;平均±标准差年龄28±6 ;1秒用力呼气量(FEV克ydF4y2Ba1个克ydF4y2Ba预测(106±15%)例,9例有不同程度哮喘(男性5例/女性4例;年龄40±11岁;FEV克ydF4y2Ba1个克ydF4y2Ba73±14% (pred), 3例无哮喘变应性鼻炎(3例男性;年龄32±7年;FEV克ydF4y2Ba1个克ydF4y2Ba110±17%前)。所有受试者均给予知情同意,测量结果由当地伦理委员会批准。吸入3-5%或0.9%生理盐水诱导痰。用Sputolysin®均匀化后,立即将选定的塞子分为两份(室温下20 min,6.5 mM二硫苏糖醇;Calbiochem,Darmstadt,德国)克ydF4y2Ba6个克ydF4y2Ba. 将一份等分试样与含有1%BSA和30%二甲基亚砜(DMSO;Sigma,慕尼黑,德国)的PBS按1:1混合,并在-20°C下冷冻保存(中间保存时间6天(范围1-16))。第二份(自然痰)照常处理克ydF4y2Ba6个克ydF4y2Ba。克ydF4y2Ba
在6个样品中,取第三个样品,然后用Kelly提出的方法进行均化处理克ydF4y2Baet al。克ydF4y2Ba5个克ydF4y2Ba,但用福尔马林作固定剂。简而言之,加入10ml中性缓冲福尔马林,使混合物短暂涡流。样品储存在室温下,中位时间(范围)为64小时(54-78)。然后以300×离心克ydF4y2Ba克克ydF4y2Ba用10ml PBS洗涤3次,每次10min。新解冻的用于酶扩散的溶液克ydF4y2Ba5个克ydF4y2Bawas added (3 µL to 1 mg of sputum), briefly vortexed and incubated at 37°C for 6 h before flow cytometry analysis.
流式细胞仪克ydF4y2Ba
甲FACSCalibur®(BD Biosciences公司,海德堡,德国)用于四色流式细胞术。细胞调节为0.5×10克ydF4y2Ba6个克ydF4y2Ba细胞·毫升克ydF4y2Ba-1个克ydF4y2Ba在PBS含有1%BSA。三个等分试样,并测定使用单克隆抗体进行直接免疫荧光(MultiTest®; BD Biosciences)中。抗体面板I包括CD45(白细胞)和碘化丙啶(PI;生存力),面板II CD3 / CD8 / CD45 / CD4(成熟T,抑制/细胞毒性,辅助细胞/诱导T细胞)和面板III CD3 / CD16 + CD56 /CD45 / CD19(自然杀伤(NK)细胞,B细胞)。天然样品根据生产商的说明,用荧光标记的抗体一起温育。接着,0.4-mL的FACSFlow®(BD Biosciences)中的溶液中加入。在16个样本的子集,流-Count®荧光微(Beckman Coulter公司,德国Krefeld)与抗体以得到绝对细胞数孵育后加入。Frozen cells were treated in the same manner, after they had been quickly thawed, dispersed in 4 mL CellWASH®克ydF4y2Ba(BD Biosciences)500倍离心克ydF4y2Ba克克ydF4y2Ba为5分钟。洗两个步骤之后,细胞在350年resuspendedµL CellWASH®。克ydF4y2Ba
淋巴细胞被定义克ydF4y2Ba通过克ydF4y2BaCD45和侧向散射(SSC);他们的群体表现出痰的低SSC和前向散射(FSC)的延长宽度特征克ydF4y2Ba八克ydF4y2Ba. 为了获得主要形态完整的细胞,并避免降解细胞和碎片,该种群被选入FCS分布的更上部,并检查细胞存活率的最佳值克ydF4y2Ba通过克ydF4y2Ba排除PI染色(图1)。在相应的双变量图中识别淋巴细胞亚群(图1)克ydF4y2Ba⇓克ydF4y2Ba)。克ydF4y2Ba
统计分析克ydF4y2Ba
比较采用Wilcoxon检验。重复性采用类内相关系数(ICC)进行量化。为了检验结果的一致性,用100%减去T‐、B‐和NK细胞的百分数(校验和1),用CD3+细胞的百分数减去CD3+/CD4+和CD3+/CD8+细胞的百分数(校验和2)进行计算。p<0.05为差异有统计学意义。克ydF4y2Ba
结果克ydF4y2Ba
根据光散射特征判断,冷冻状态下形态完整的淋巴细胞数量较自然状态下略有减少(几何平均值(sd) 0.048(3.1))。克ydF4y2Ba与克ydF4y2Ba0.036 (2.5)×10克ydF4y2Ba6个克ydF4y2Ba细胞·毫升克ydF4y2Ba-1个克ydF4y2Ba). 不管怎样,在所有的样本中都可以识别出一个很好区分的淋巴细胞群,从而实现直接的进一步选通(图1克ydF4y2Ba⇑克ydF4y2Ba)。克ydF4y2Ba
自然样本和冰冻样本之间的一致性是可以接受的,特别是对于CD4和CD8(图2克ydF4y2Ba⇓克ydF4y2Ba)。Intraclass correlation coefficients for CD3, CD4 and CD8 were ≥0.70 (table 1⇓克ydF4y2Ba)。贮藏时间与细胞质量无明显关系。由于在预期的荧光范围内没有可解释的信号,因此无法通过流式细胞术分析福尔马林固定的样品。克ydF4y2Ba
讨论克ydF4y2Ba
本研究的数据表明,冷冻诱导痰中间贮液对流式细胞术检测CD3、CD4、CD8淋巴细胞亚群无明显影响。尽管中值存在微小的差异,但原生样本和冷冻样本之间的相关性很高,特别是在这些主要的兴趣子集方面。克ydF4y2Ba
由于冷冻细胞是易碎的,所以在解冻和混合过程中,所有的样品都被尽可能轻柔地处理。包括在免疫门中的形态完整的淋巴细胞总数只有轻微的损失。显然,较低的数量并不影响天然和冷冻小份之间的相关性,表明潜在的选择性损失并不相关。形态完整细胞形态的差异(图1a-d克ydF4y2Ba⇑克ydF4y2Ba)可能与冻肉和本地鱼的生存能力缺乏相关性有关;尽管如此,中值是相似的(表1)克ydF4y2Ba⇑克ydF4y2Ba)。CD3+和CD8+细胞数量的轻微增加,加上T4/T8的相应减少,可能是由于形态学门控的改变导致了免疫门控的改变。但是,不能排除冷冻对CD4+和CD8+细胞的额外差异效应。重要的是,CD4+细胞的鉴定似乎不受冷冻和淋巴细胞亚群中值的影响(表1)克ydF4y2Ba⇑克ydF4y2Ba)对应以及公布数据克ydF4y2Ba1个克ydF4y2Ba. 此外,校验和接近预期值,表明在原生和冻结小份中都有合理的选通。克ydF4y2Ba
除了冷冻之外,最近描述的一种固定痰液的效果克ydF4y2Ba5个克ydF4y2Ba对淋巴细胞亚群的测定进行了评价。使用固定剂可以进一步简化物流运输,因为它不需要一个冷却链。然而,使用这种方法,福尔马林固定的样本不能用流式细胞术分析,可能是由于缺乏抗体的结合。相关抗原可能对福尔马林敏感或被福尔马林掩蔽;CD4、CD16、CD19和CD56的表位被福尔马林固定破坏;CD3、CD8和CD45需要抗原回收。福尔马林固定标本的流式细胞术是否可以通过不同的抗体或处理步骤的调整来实现仍有待评估。在这方面,首先加入抗体然后固定样本的程序值得进一步研究。克ydF4y2Ba
总之,目前的数据表明在-20与15%二甲亚砜冷冻的痰℃下适合于存储在〜1周,并且不显着地影响CD3,CD4和CD8淋巴细胞亚群的流式细胞仪分析。因此,冷冻可能有助于痰液分析在多中心临床试验的使用,以及临床实践。克ydF4y2Ba
- 收到克ydF4y2Ba2003年11月10日。克ydF4y2Ba
- 认可的克ydF4y2Ba2004年4月14日。克ydF4y2Ba
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