文摘
遗传因素的证据在结节病的病因学包括家族聚集性,与基因多态性的关联,连杆6号染色体上的主要组织相容性复合体类区域p。不幸的是,大部分的基因关联与结节病并没有持续复制。
在目前的研究中,使用基于家庭的研究设计,控制人口分层,作者试图复制以前报道的结节病之间的联系和三个迷人的候选基因研究主要在病例对照样品。
225年核心家庭,确定通过非裔美国人历史的结节病,没有证据被发现为结节病的易感性与血管紧张素转换酶的多态性,维生素D受体和肿瘤坏死因子α基因。进一步分析慢性和急性疾病表型没有透露任何显著的关联。假设一个潜在的遗传模型与一个添加剂等位基因对疾病风险的影响,目前的研究已经∼80 - 90%的统计力量来检测一个3折风险增加相关的假定的风险等位基因多态性研究。
目前作者得出结论,在非洲裔美国人,血管紧张素转换酶,维生素D受体和肿瘤坏死因子α基因不是结节病易感性的重要危险因素。
这项研究是由美国国立卫生研究院的支持格兰特R01 HL54306。
结节病是一种系统性的肉芽肿性疾病可以影响任何器官系统的原因不明,但最常见的包括肺(∼90%的病例),皮肤和眼睛。遗传易感性结节病已经被研究证明家庭支持集群1和疾病的患病率更高一级亲属2。集群的情况下,在特定的民族也表明遗传易感性。在美国,非洲裔美国人有更高的发病率和发病率与白种人相比3。结节病的病理特征是多核noncaseating肉芽肿在受影响的器官。肉芽肿的担子是指示性的疾病活动和长期活动性疾病可导致肝纤维化、器官功能障碍。肉芽肿形成的关键基因发挥作用和持久性包括血管紧张素转换酶(ACE)、肿瘤坏死因子(TNF)高α和维生素D受体(VDR)。
结节病的上皮细胞分泌> 40种不同的细胞因子和其他介质,包括王牌4。结节病肉芽肿的上皮细胞包含高手,高手在单核细胞合成细胞培养可以调制,T淋巴细胞获得肉质的病人5。健康人血清ACE水平6和结节病病人7影响287碱基对Alu序列呈现(插入(I))或缺席(删除(D)) ACE基因在基因内区16。协会的研究ACE I / D多态性和结节病产生了不同的结果。ACE D等位基因,与血清ACE水平较高有关6已经发现,在非洲裔美国人与结节病风险增加有关8,日本女性7从德国人口和sarcoid-affected家庭成员9。相反,其他研究白种人10,11和日本12未能找到一个ACE I / D多态性与结节病易感性或进展。
肿瘤坏死因子α应承担的是一种细胞因子,可能有一个关键的角色在肉芽肿形成13。肿瘤坏死因子α应承担增加疾病活动的网站14和抗肿瘤坏死因子α应承担的代理显示慢性结节病的有前途的治疗价值15。至少11个多态性在启动子区域的肿瘤坏死因子α基因已报告16但这些单个碱基G (bp)过渡位置−307被认为是最有可能影响基因转录16。几项研究已经检查这个多态性与结节病易感性的关系17- - - - - -19与单个病例对照研究,在非洲裔美国人拥有零发现20.。
活动形式的维生素D, 1,25 dihydroxyvitamin D3(1,25 (OH)2D3),一个启动子的多核巨细胞的形成21结节病肉芽肿的生产站点22在结节病,提高病人23。这种激素行为通过绑定在细胞核内的船舶24和已被证明与干扰素γ直接交互,促进肉芽肿性过程25。几个多态性与潜在的功能性意义已确定在VDR基因26。Bsm我和Apa多态性位于非编码区域,而Taq我在一个外显子多态性是但导致无声的密码子改变核苷酸的攻击力和ATC为异亮氨酸352密码子编码。的b等位基因多态性的Bsm,报道与结节病的易感性27是与缺乏强大的连锁不平衡Taq我裂解位点(T等位基因)在白人和非洲裔美国人28。另一个DNA序列变异VDR基因是一个胸腺嘧啶/胞嘧啶(T / C)多态性在第一两个潜在的开始(ATG)密码子被限制使用核酸内切酶片段长度多态性霍英东我的功能意义霍英东我多态是不确定的。然而,大多数数据表明F等位基因,缺乏第一ATG起始密码子导致转录蛋白三个氨基酸短于变体f等位基因,transactivation更有效的1,25 (OH)2D3信号29日。一项研究报告的一个协会f等位基因与肺结核30.。
自冲突的病例对照结节病协会的报告与变异的王牌,VDR和肿瘤坏死因子α基因存在,目前的作者试图复制这些协会在结节病的家庭研究非裔美国人的核心家庭。家庭设计的强度是控制遗传背景与疾病无关。虽然病例对照样品通常比家庭更容易收集和统计更强大的样品在某些情况下31日,病例对照样品会产生虚假的联系因为民族外加剂或不恰当的控制相关的其他问题32。因此,这里给出的结果应该帮助澄清ACE (I / D)的角色,VDR (Taq我和霍英东我)和肿瘤坏死因子α(307−)遗传多态性对结节病风险的非洲裔美国人。
方法
研究样本
这项协议是由亨利福特医院的机构审查委员会批准。诊断组织活检证实了在指数86%的情况下,在所有情况下正常(阶段0)胸片。案件没有组织学确认radiographical双侧肺门腺病的证据,一个兼容的临床表现和观察≥2年没有其他医疗条件是可以解释的临床过程。
从共有623个符合条件的渊源者,359名(58%)与一个或多个一级家庭成员(年代)。其中,234有两个或更多的父母或兄弟姐妹捐赠的血液样本。额外的10岁的非裔美国人的结节病家庭被亨利•福特(Henry Ford)卫生系统外,244年总家庭。父母都是基因分型时可用。父母一方或双方没有基因分型时,所有可用的亲兄弟基因分型。使用一组链接标记,20个家庭(8.2%)与孟德尔分离不一致和两个家庭(0.8%)、渊源者,进一步随访后,没有发现有结节病,被排除在分析之外。三个剩余的222个家庭有两个独立的小家庭,分别进行分析,导致225核心家庭或共704人进行研究。这三个基本的家庭配置如表1所示⇓。虽然大多数家庭成员与结节病的历史渊源者通过家庭确定的是谁,也有22个哥哥和四个额外的家庭成员(他被视为索引病例分析)与结节病的历史根据自我报告的医生诊断这种情况。在18 22 sib的情况下,和其他四个额外的家庭成员情况下,活检证实了诊断。在剩下的四个sib情况下,医疗记录审查揭示一个胸部x光双侧肺门腺病的诊断报告。大多数家庭(90%)有一个影响后代和> 80%的家庭有更多的兄弟姐妹的影响。
表现型
使用先前描述的标准用于器官系统的参与33,影响妹妹下表型分类三大类:轻微、中等和严重。轻微的病例无症状或正常的器官系统如果不治疗,或自发地解决正常2年的演讲。温和的情况下与最小剩余异常症状疾病课程在任何器官有或没有治疗,或一种疾病课程> 3年有剩余异常,尽管治疗。严重病例有进步的器官功能障碍≥3年,尽管治疗。
基因分型
高分子量DNA被洗涤剂溶解从实际上血液分离和有机萃取。双等位基因的王牌多态性基因分型是酶放大的一段基因内区16 190和490碱基对等位基因6%聚丙烯酰胺gelelectrophoresis解决。引物设计如前所述8。放大了使用100 ng的基因组DNA和10 picomol (pmol)每个引物在94°C的1分钟,1分钟58°C和72°C 2分钟,30周期。确认基因型只有一个D乐队而不是输错的ID是真的该等位基因的杂合的由于优惠D等位基因的扩增,第二个反应是使用的底漆执行标记和γ(32P] ATP。丙烯酰胺凝胶电泳等位基因分离,与溴化乙锭染色显示分子量检测等位基因标记和放射能照像。
的论述Taq我和霍英东我多态性被放大和限制片段长度多态性类型如前所述30.。Taq我确定一个沉默改变核苷酸352 T C基地。霍英东我确定了一个C T过渡,创造出另一个新的起始点从第二个ATG开始三个密码子上游站点。等位基因被琼脂糖凝胶电泳分离,并与溴化乙锭检测。每个DNA样本化验每个标记至少两次,确认基因型。
G的过渡位置−307肿瘤坏死因子α基因应承担的由413个基点的放大区域合并两个多态性。放大了使用的引物5 -TTCCTGCATCCTGTCTGGAA-3和反义底漆,5‘-AGGGAGCGTCTGA-TGGCTG-3 1 pmol /反应,2毫米deoxynucleotidetriphosphates, 10 ng DNA,和0.62单位TaqDNA聚合酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。放大条件为60年代94°C, 62°C的60年代,60年代72°C,最终扩展步骤6分钟在72°C。产品在两个方向测序测查贝克曼2000 xl,测查的染料终结者循环测序工具,根据制造商的协议(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。所有基因型进行复制的基因型在分歧(∼10%)运行第三次来验证结果。
统计方法
确定一个或多个等位基因位点的兴趣与结节病表型相关,家庭协会测试(FBAT)统计,年代,计算使用FBAT软件使用34。简而言之,这个测试数据确定某一等位基因在核家庭传播影响后代更多(或更少)通常比预计将在孟德尔隔离。测试统计数据为主导和添加剂继承模型计算。初步分析的结果是一个二分的感情状态变量。更深入表型模型也检查的三个表型水平被视为二分或一个序数变量。前参数化的多元模型使用三个0,1虚变量编码对应的缺席或表型的存在的问题。后者参数化,影响同胞被编码为1、2或3的数量对应于一个更严重的表型水平较高。对于这两种类型的参数化,影响兄弟姐妹被编码为0。
研究样本检测的统计力量之间的关联的假定的风险等位基因多态性与结节病计算功率的计算基于家庭的测试软件35。功率计算条件每个风险等位基因的频率,估计一生1%的风险3研究示例配置,如表1中所示⇑和一系列基因型相对风险(γs)。使用这些参数,预计genotypic-specific外显率值,f2(两个风险等位基因),f1(一个风险等位基因)和f0(没有风险等位基因),根据添加剂(f0f = 21−f2)、乘法(f0= f12/ f2)和显性(f1= f2)继承模型可以计算。的程序用于计算能力估计基于家庭的分析是基于一个二阶泰勒展开,这已被证明有良好的精度≥100个家庭的样本大小35。
结果
Multiallelic测试统计四个多态性检测,ACE I / D,论述霍英东我和Taq我,307,肿瘤坏死因子如表2所示⇓。地理统计p值没有达到意义(p = 0.05)为主导或添加剂模型的继承。表3⇓显示了biallelic协会测试假定的风险等位基因的多态性。在表3中⇓,观察和等位基因传输的期望值,年代和E (S),分别是基于遗传模型假设。计算方差的年代,允许评估的显著性水平为大量的家庭基于Z统计,这是正态分布均值为0,方差为1,定义为: 主导和添加剂的继承模型下,所有的四个等位基因明显偏离零假设。因为它是可能的多态性研究可能是疾病进展的危险因素而非敏感性,疾病表型分析下的结果,而不是感情状态。表型数据用于兄弟姐妹在163年的225(72%)研究家庭。表4⇓描述了四种不同类型的分析基于继承模型(主导和添加剂)和表型参数化。虽然没有统计上显著的结果观察,论述霍英东我多态性近乎显著结果(p = 0.08)相加模型下多元表型。二分的表型结果,没有假设的关系一个表型分类与另一个,而模仿这样的顺序表型结果日益严重的表型分类有更高的协变量值。在phenotyped-affected妹妹,霍英东*f表型的等位基因频率越来越高了程度范畴,即。33.8%在温和的情况下,42.5%在适度的情况下,严重病例的51.7%。的频率霍英东*f等位基因影响的同胞在这些家庭为41.3%。
自提交结果大都是负面的,当前作者接下来测试提供的本研究抽样统计力量。统计能力计算的四个假定的风险等位基因的多态性研究。对于每个等位基因和遗传模型组合,基因型相对风险(γ)在第一类误差范围1 - 5进行测试(α)水平的5和1%(图。1⇓)。ACE I / D * D等位基因,γs≥3被发现在α= 0.05∼80%统计力量在一个添加剂继承模型,和90%的统计力量在一个乘法继承模型。α= 0.01水平的theadditive和乘法模型,γs≥4可以发现≥80%功率取决于遗传模型。显性遗传模型,统计力量只有接近60%的γ值5α= 0.05。对VDR霍英东我*f和Taq我* t等位基因,发现了γs≥3α= 0.05水平≥90%统计权力在所有三个继承模型测试。同样γs≥3可以发现≥70%统计权力在所有三个继承模型测试α= 0.01的水平。统计力量γs≥4可以发现∼100%权力在所有三个继承模型测试在α水平(0.01和0.05)测试。统计能力估计的TNF 307 *一个等位基因是几乎相同的2 VDR等位基因显性和添加剂继承模型和乘法继承模型下略少。
讨论
Noncaseating肉芽肿结节病的组织学特点,因此,本研究调查了候选基因多态性可能参与肉芽肿的形成和维护。冲突的病例对照研究结果对结节病风险存在多态性的王牌7- - - - - -12,36- - - - - -40和VDR27,41和肿瘤坏死因子α17- - - - - -20.,42基因(表5⇓)。因此,当前作者测试了这些基因的多态性对结节病在非洲裔美国人家庭。尽管目前的研究有足够的统计能力检测尺度效应≥3下一个添加剂继承模型,发现无显著关联。
一个可能原因不一致的结果在结节病的遗传关联研究可能是异质性。包含误诊病例对零假设将偏差的结果,但一个代表性案例可以人为地增加或减少一个比值比。结节病的研究依赖于许多案件来自专门的诊所治疗更严重的和先进的病例。如果这些多态性是真正与结节病进展或疾病亚型,作为ACE的几项研究报告8,36和肿瘤坏死因子α17,42多态性,那么疾病类型的不成比例的混合情况下可能偏差比值比测量结节病的易感性。本研究人群大多数情况下是表现型,所以目前的作者能够检查四个多态性之间的关系正在研究和疾病严重程度。没有发现协会之间的ACE I / D或者TNF 307多态性与疾病表型,这将表明,这些多态性与疾病进展相关的非裔美国人,本研究人群的病例组合并不影响其磁化率的结果。如果肿瘤坏死因子量307多态性实际上是一个标记洛夫格伦综合征和结节性红斑结节病,几项研究报告17,42在非裔美国人,那么这些条件是罕见结节病病例43可以解释的负面结果关于这个多态性在当前的研究中。然而,当前作者在多大程度上可以排除疾病进展基因是由一个较小的样本量有限由于缺失和不完整的表型数据,而不允许本研究考虑的各种表型表达的基因在研究展览。
遗传和环境背景也能影响病例对照基因关联的结果。所有四个多态性研究中观察到高加索,日本人口和非裔美国人,但它们对疾病易感性的影响可能改变其他遗传或环境因素。”如果这些因素之间的不同民族,种族特定关联一个给定的多态性与结节病易感性是可能的。
在这项研究中,酒井敦et al。27Bsm,我B等位基因在结节病病人但Guleva和塞茨过多41随后未能复制这一发现发表在德国白人人口。在当前的研究中人口,相应的t等位基因的Taq我没有多态显示优惠传播影响后代。当前的研究也发现了霍英东我VDR多态性,在连杆平衡Taq我/ Bsm等位基因30.,发现这多态性与结节病易感性无关但变体f等位基因可能与慢性结节病。的潜在功能的相关性霍英东我多态29日和VDR基因型与其他协会的肉芽肿性疾病44,45建议在结节病VDR基因需要进一步调查。然而,结节病的易感性VDR等位基因检测在目前的研究中有80%功率检测一个2折风险增加在主导模式下,这是杂合子的风险水平VDR多态性Bsm我先前报道27。
人口的程度分层偏见病例对照基因关联研究的结果是一个争论不休的话题。虽然从理论上讲,选择一个控制样本的人口情况下是应该避免人口分层,在实践中统一的情况下/控制抽样是难以实现的。统计方法调整人口分层使用提出了特定人群的等位基因46但是这些方法还没有被广泛应用,可能容易过校正潜在的偏见。本研究中使用的基于家庭的研究设计提供了一个抽样程序,避免了潜在的偏见没有做任何复杂的病例对照抽样统计修正。
总之,目前的研究发现,没有证据表明为结节病易感性之间的关系在非洲裔美国人,三个关键基因、血管紧张素转换酶,维生素D受体和肿瘤坏死因子α,参与肉芽肿形成。整体结果从过去的病例对照研究这些基因多态性的模棱两可的结节病的易感性。本研究的结果不应受到人口分层自潜在混杂控制遗传背景的研究设计。目前的研究也足够动力来检测水平与疾病的易感性,曾被报导过。给出的结果表明,基因控制的肉芽肿反应是非洲裔美国人与结节病易感性无关。此外,血管紧张素转换酶、维生素D受体和肿瘤坏死factor-α基因可能不是最佳人选研究结节病肉芽肿反应在非裔美国人对疾病易感性的关系。
确认
作者感谢所有研究协调员帮助招聘,主要包括m . t . Turpen b,麦柯莱伦和w .水龙头。
- 收到了2004年1月15日。
- 接受2004年4月9日。
- ©人期刊有限公司