摘要
慢性阻塞性肺疾病(COPD)发展的遗传易感性可能取决于香烟烟雾产品解毒酶的活性变化,如微粒体环氧化水解酶(mEPHX)和谷胱甘肽年代- 转移酶(GST)。研究了这些基因中的多态性是否有任何与COPD和COPD严重程度的易感性相关。
采用聚合酶链反应法测定184例COPD患者和212例正常人的基因型,并对mEPHX、GSTM1、GSTT1和GSTP1基因进行限制性片段长度多态性分析。所有受试者均为吸烟者或戒烟者。
COPD患者的GSTM1-NULL基因型的比例显着高于对照对象(61.4相对42.5%)。在Mephx,GSTT1和GSTP1的多态性基因型的频率下没有观察到差异。在综合分析Mephx,GSTM1和GSTP1的遗传多态性期间,发现存在对COPD的易感性有强指标(基因型组合与至少一个突变MEPHX EXON-3等位基因(组氨酸113),GSTM1零和GSTP1的纯合异氨酸105等位基因)。严重COPD的患者(在预测值的35%的35%)的患者中,Mephx Exon 3和GSTM1-Null基因型的纯合突变体等位基因的频率显着高。
提出遗传变体的组合,包括至少一种突变微粒体环氧化物水解酶外显子-3等位基因和谷胱甘肽年代- 转移酶M1-null和纯合的异亮氨酸105谷胱甘肽年代-转移酶P1基因型是台湾人群对慢性阻塞性肺疾病易感性的重要指标。此外,微粒体环氧化物水解酶外显子3和谷胱甘肽纯合子变异年代-transferase M1-null基因型是发生严重慢性阻塞性肺疾病的独立危险因素。
普遍认为香烟吸烟是慢性阻塞性肺病(COPD)最重要的危险因素。尽管如此,只有10-20%的慢性吸烟者发展了与COPD相关的肺功能的严重损害1,2.这表明了环境或遗传辅因子对COPD的发展可能的贡献。虽然辅助因子,如儿童病毒感染和环境和职业污染,但在发病机制中起重要作用3.,遗传易感性可能是一个重大重要性的因素4.
COPD的唯一建立的遗传危险因素是α的Z等位基因的纯合子1- antiTrypsin(α.1-At)基因。遗传α的患者1-AT缺乏患者在冒烟时具有很高的发展肺气肿风险。然而,这些患者只占所有肺气肿患者的一小部分5.最近的研究报告说,解毒烟雾产品的酶的遗传变异可能与COPD的发育相关。这些酶包括微粒体环氧化物水解酶(MEPHX),谷胱甘肽年代-转移酶(GST)和细胞色素p4501A1。Mephx是涉及吸烟诱导的高反应性环氧化物中间体的一级代谢的酶,并且在大多数组织和细胞类型中以不同的水平表达6,7.人类mephx基因是染色体的长臂的局部8,两种常见的异常等位基因可以被检测到,它们赋予了慢酶和快酶活性9.外显子-3胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)突变将酪氨酸残基113变为组氨酸,酶活性降低≥50%(慢等位基因)。第二突变,对基因外显子4中的鸟嘌呤(A)转变(G)转变,将组氨酸残基139变为精氨酸,并产生活性≥25%(快速等位基因)的酶。外显子3和外显子4之间的距离为6,696个碱基对10..
GST是一个酶超家族,参与多种亲电物质与谷胱甘肽的结合,从而促进解毒和进一步的代谢和排泄。GST分为以下几类:α、μ(GSTM)、π(GSTP)、θ(GSTT)、σ和kappa。GST M1、T1和P1基因分别位于染色体1p13、22q11.2和11q13上。在GST同工酶中,已报道纯合子GSTM1空基因型与肺癌的发病机制有一定关联11.,12., 膀胱癌13.而且,特别是肺气肿14..gstt1缺失突变体也被认为是许多疾病的危险因素15.- - - - - -17.. GSTP1基因型的多态性已被报道,包括外显子5中的异亮氨酸(Ile)105到缬氨酸(Val)突变和外显子6中的丙氨酸114到缬氨酸(Val)突变105.(突变)等位基因比那些有Ile的人患肺癌的风险更高105.(野生型)等位基因18..此外,GSTP1在呼吸组织中表达比其他类型的GST更大量19..
以前的证据表明对COPD的易感性不是单基因事件。此外,存在种族差异。例如,COPD在中国生活中的中国人罕见,日本美国人吸烟的普遍存在>每日20支香烟低于匹配的白种人 - 美国集团(7.9相对16.7%)20..对COPD的家庭聚类的研究还证明了主要的多基因效应的证据21.. 这些发现都表明,在分子水平上探索COPD的危险因素将是有益的,应该在不同种族群体中进行。应调查多个遗传多态性,以阐明这些遗传事件是否具有加性效应或是否可以预测COPD的发病风险。在本研究中,我们调查了台湾吸烟人群中mEPHX、GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型与COPD易感性和严重程度之间的关系。
患者和方法
研究人群
该研究组由184名患者(152名男性和32名女性)组成,吸烟有关的COPD从国立台湾大学医院(台北,台湾)招募。根据美国胸部社会(ATS)指南,COPD被诊断为基于病史,胸部放射线摄影,身体检查和肺活量数据的基础1.纳入COPD标准包括以下内容:慢性气道症状和标志,如咳嗽,呼吸,喘息,慢性气道梗阻,定义为一秒钟(FEV)1<70%和FEV的强制致命能力(FVC)1来自肌肉数据的<80%的预测值;和FEV.1吸入200μg盐丁醇莫酚<12%的预伯因酮FEV后可逆性1.根据严重程度(ATS标准):轻度/中度COPD,患有COPD的患者被分为两个亚组;和严重的copd,用fev1pred <35%。如果他们有哮喘史(气流阻塞的可逆性)或恶性肺病,则被排除在外。
对照组包括212名无症状吸烟者或戒烟者(182名男性和30名女性),吸烟史为≥无COPD临床或实验室证据的10包年。所有受试者都参观了台湾大学医院进行体检。所有对照受试者的肺功能(FEV)均正常1/ FVC> 70%和FEV1> 80%pred)22..获得伦理批准和知情同意。
DNA制备
基因组脱氧核糖核酸(DNA)用QIAAMP血微米(Qiagen,Hilden,德国)从总血细胞中提取。基因组DNA(20ng)扩增通过使用热循环仪(微循环仪)的聚合酶链反应(PCR)TM值在含有1.5 mM MgCl的40µL反应混合物中2,每引物100 ng,三磷酸脱氧核糖核酸苷500µM, 0.6 IUTaqDNA聚合酶(MBI Fermentas,Hanover,MD,USA)。
PCR限制片段长度微晶环氧化物水解基因的多态性分析
PCR条件为:95℃初始单循环10 min, 94℃30 s, 52℃20 s, 72℃5 s,共35个循环。以pcr为基础,合成了特异的mEPHX引物:5 ' -GATCGATAAGTTCCGTTTCACC-3 '(外显子3,意义);5 ' -ATCCTTAGTCTTGAAGTGAGG一个T-3'(反义;工程基础改变,G到A,带下划线);5'-acatccacttcatcaccacgt-3'(外显子4,感觉);和5'-atgcctctgagaagcat-3'(反义)。外来4突变产生aRhodopseudomonas sphaeroides.(RSA.)I限制突变体(快)等位基因(ATAC至GTAC)中的片段长度多态性。将每个PCR产物消化完成大肠杆菌J62 pLG74 RV(外显子3)或RSA.I(外显子4)(新英格兰Biolabs,Inc。,Beverly,Ma,USA),通过电泳通过3%琼脂糖凝胶分离,用溴化乙锭染色并用紫外光进行过滤。预期外显子-3野生型等位基因产生140-22-碱基对(BP)片段,而变异等位基因仍然是未切割的162-BP片段(图。相反,外显子-4野生型等位基因仍然是未切割的210-BP片段,而最终等位基因预计将收益为164-和46bp片段(图1B⇓).根据史密斯和哈里森的报告23.,四组推定的MEPHX表型分类如下:正常(外显子3和外部4突变的突变或杂合),快速(至少一个快速突变(外显子4)和没有外部-3突变),慢(一个慢(外来-3)突变等位基因),非常慢(两个缓慢的等位基因)。
谷胱甘肽的多重PCR扩增年代- 转移酶m1和t1
为了检测GST M1和T1基因的缺失,我们使用β -球蛋白基因作为内控基因进行多重PCR,如Chen所述等等。16.. 每个基因的引物组合如下:GSTM1:5′-gaactctggaaagctaaagc-3′和5′-gttgggctcaatacatagtgg-3′;GSTT1:5′-TTCCTTAGTCTCACATCTC-3′和5′-CAGCGCATTTTGGAG TGCTC-3′;和β-球蛋白:5′-CAATTCACGTTCACC-3′和5′-GAAGAGCCAGGCTAC-3′。PCR缓冲液和周期与用于mEPHX基因扩增的相同。分离多重PCR产物(GSTM1 215 bp、GSTT1 480 bp和β-球蛋白268 bp)(图1d)⇑).对于单独的GST基因,对受试者被分类为非核或零(纯合缺失)基因型。
谷胱甘肽的PCR限制片段长度多态性分析年代- 转移酶P1基因
在GSTP1基因型分析中,外显子5多态性(Ile105.瓦尔105.突变)被选中。PCR和RFLP研究使用Watson描述的方法进行等等。24.单一修改。Exon-5变体的测定使用引物对5'- gtagtttgcccaAGGTCAAG-3'和5'-AgccacctGagGGGTAAG-3'。PCR缓冲液和循环也与用于MEPHX基因扩增的循环相同。用5IU消化PCR产物芽孢杆菌嗜热嗜热疗法A664 AI (New England BioLabs, Inc.)在55°C下加热1小时。凝胶电泳条带(野生型329和104 bp;突变体222和104 bp)如图1c所示⇑.
统计分析
年龄,累积卷烟消耗和肺功能数据表示为平均值±SD。统计分析基因型与临床特征之间的关系,酌情进行了Chi平方或Fisher的确切试验。p值为<0.05是显着的。对所有多态性进行了测试的Hardy-Weinberg均衡,并且发现没有明显的偏差。Logistic回归模型用于计算大量比率并调整有和没有COPD的吸烟者之间的年龄,性和累积卷烟消费。Mephx和GST测定将个体放入不同的类别:那些不携带或携带至少一个缓慢的Mephx等位基因,那些含有零或非空的GSTM1和GSTT1基因型的那些,以及具有纯合子val的那些105.或杂合或纯合的ILE105.GSTP1等位基因。在没有mEPHX慢等位基因、GST M1和T1非零和Val纯合子的参照组个体中,也估计了比值比105./ val.105.GSTP1基因型。
结果
表1总结了COPD和控制受试者患者的年龄,性别,吸烟病史和肺功能数据⇓.在患者和对照组之间的年龄或吸烟病史中没有观察到显着差异。对所有多态性进行了测试的Hardy-Weinberg均衡,并且发现没有明显的偏差。
在四个基因的多变量分析上,COPD患者的GSTM1-NULL基因型的频率显着高于对照对象(61.4相对42.5%)(表2⇓).优势比为2.2(95%可信区间(CI) 1.3-3.5)。mEPHX纯合突变体外显子3 (His .)的基因型频率113./他的113.4(arg139./参数139.),gstt1 null和野生型gstp1(ile105./ ile.105.)组之间没有显示出显着差异(表2⇓).
分析Mephx,GSTT1,GSTM1和GSTP1基因型,以便研究这些遗传多态性的组合是否与COPD的发育有关。如果Mephx基因型被分为正常或快速和缓慢或非常缓慢的两个亚组,则COPD和对照患者之间的MEPHX基因型存在显着差异(或缓慢/非常缓慢相对正常/快2.3;95%CI 1.1-4.3)。COPD患者的至少一种缓慢MEPHX等位基因和GSTM1-NULL基因型的组合基因型在COPD患者中显着频繁发生(48.4相对22.2%)。与正常和快速mEPHX等位基因或非空GSTM1基因型相比,优势比为3.6 (95% CI 1.9-8.6)。COPD患者的频率甚至高于对照组(36.4)相对8.5%),当结合基因型扩展到包括纯合子野生型(Ile105./ ile.105.)GSTP1基因型,并且差距增加到6.8(95%CI 1.6-17.7)(表3⇓).
在184名COPD患者中,COPD的严重程度被划分为轻度/中度(FEV)1≥35%pred)在119名患者和严重(FEV1<35% pred)3..轻度/中度和严重患者之间的吸烟病史没有显着差异(31.2±2.9相对35.9±2.6 pack-yrs;p = 0.22)。纯合子His的频率113./他的113.严重COPD患者的MEPHX EXON-3突变体显着高于患有轻度/中度疾病的患者(63.1相对26.1%)。与纯合子野生型外显子3等位基因患者相比,重度COPD患者的优势比为7.5 (95% CI 2.1-26.3)。两组患者mEPHX外显子‐4等位基因突变频率比较无显著差异。mEPHX的两个单核苷酸多态性之间估计连锁不平衡,未发现显著偏差(p=0.49)。然而,不能断定外显子3和外显子4处于连锁平衡状态,因为只能检测到非常少的突变外显子4纯合子。gst方面,GSTT1和GSTP1基因型的分布与COPD严重程度无关。但GSTM1基因型分布与COPD严重程度存在显著差异。GSTM1-null基因型在重症COPD患者中出现的频率明显高于非null基因型(84.6相对52.9%),优势比为5.6(95%可信区间2.2–13.9)(表 4.⇓).
讨论
在诸如COPD的复杂的多基因疾病中,很可能是多种基因的操作是必要的,并且对疾病的易感性取决于由于多态性引起的几种遗传事件的重合动作。每个基因的多态性可以仅赋予COPD的小相对风险,并且可以推测若干关键态的共存在COPD的发病机制中是重要的。在本研究中,组合分析Mephx和GST M1,T1和P1基因型,以阐明各种基因型组合与COPD的发育之间的关联。当组合至少一个缓慢的乳粉外显子-3等位基因和GSTM1零的两个基因型时,差异比例升高了几乎四倍。加入纯合ile的比率增加到七倍105./ ile.105.GSTP1基因型。预计卷烟烟雾污染暴露的暴露是合理的,导致具有风险赋予遗传多态性的个体中肺实质的更严重破坏和炎症。因此,本研究表明,携带含有Mephx的特异性遗传多态性的香烟吸烟者,GSTM1和GSTP1特别容易受到COPD。
慢性烟草吸烟是COPD发展的主要危险因素。然而,只有相对较小的吸烟者患有气道阻塞。遗传因素被认为与这种易感性有关。涉及蛋白酶/抗滴发酶和氧化剂/抗氧化剂相互作用的基因具有特殊兴趣。在目前的报告中,使用对照组吸烟者,三种基因多态性的频率(至少一个缓慢Mephx Exon-3等位基因,GSTM1零和纯合的ILE105./ ile.105.GSTP1)在控制累积卷烟消费后,COPD患者显然比对照患者显然更高。COPD在慢性重香烟吸烟者中发展的机会随着个体从一到三种遗传多态性携带而逐步增加。
应该承认,多重联合基因型比较有一些缺点。必须考虑基因间的相互作用。目前的基因位于不同的染色体上,连锁不平衡的可能性不大。然而,每个位点都可能与一个未知的偶然基因发生连锁不平衡。潜在的连锁不平衡是候选基因关联方法的基本限制,取决于研究群体中每个位点的连锁不平衡。此外,还需要继续进行功能研究,包括mEPHX和GST信使核糖核酸及蛋白表达分析,以证实二者之间的因果关系,然后才能得出明确的结论。第三,样本量较小的多基因型比较可能存在偏倚和不确定性。然而,目前的作者认为,这些基因多态性与COPD的发展之间仍然存在显著的关联趋势。
众所周知,等位基因频率在种族之间变化。史密斯和哈里森23.首次报道mEPHX基因多态性与肺气肿易感性相关。在他们的研究中,发现肺气肿患者外显子3的突变等位基因频率高于对照组(28相对6%)。然而,在两项日本研究和一个韩国研究中可以证明Mephx Exon 3或4的突变等位基因频率中的COPD患者和对照之间没有显着差异25.- - - - - -27.. 上述三项亚洲研究中mEPHX基因型的分布与本研究中的分布相似。
与mEPHX基因不同,GST基因型在不同种族间的分布更为复杂。GSTT1-null基因型的频率在当前对照组(52.8%)接近韩国人群(62%),但高于白种人(20.4%)。27.,28..尽管本对照组的GSTM1-null基因型的频率与西方国家/地区的频率相似(42.5相对46.9-53%),它低于韩国人(65%)14.,18.,27..ile.105./ ile.105.本控制受试者中GSTP1的基因型分布(46.7%)高于西方生(35-42%)24.,但低于日本(52%)29.基因型频率的差异可能与不同种族抗氧化应激代谢酶活性和优势功能酶类型有关。
在本研究中,GSTM1-NULL和纯合野生型的频率(ILE105./ ile.105.COPD患者的GSTP1基因型较高。GSTP1比Alveoli,肺泡巨噬细胞和呼吸支气管中的其他GST大量表达19.,预计是肺部肺炎的局部外毒药的主要GST同工酶。野生型GSTP1显示致癌芳族环氧化物的较弱催化疗效而不是VAL105.GSTP1突变体30..因此,来自纯合野生型等位基因的GSTP1同工酶在烟草烟雾中对外源物质的解毒能力较弱。无型GSTM1在解毒香烟烟雾中的多环芳香烃方面表现出功能缺陷,并由于氧化剂和自由基过量而促进肺的细胞和组织损伤。与GSTP1不同,在56%的人群中发现远端肺中GSTM1表达明显减少或缺失19..因此,GSTM1对肺部整体解毒能力的贡献是有争议的。但是,包括当前报告的几项研究已经记录了GSTM1与肺病(如肺癌)的敏感性11.,12.和copd.14..因此,本作者推测,具有GSTM1-NULL和野生型GSTP1基因型的人们倾向于在肺中显示出有缺陷或较弱的解毒能力,因为GSTM1和GSTP1同工酶均比其他类型的氧化应激更为主要的催化酶GST在呼吸道中。
在严重的COPD患者中(FEV1<35%pred),突变体Mephx外显子-3等位基因的频率和GSTM1-null基因型显着高于温和/中度COPD。桑福德等等。31.最近报道了纯合子His113./他的139.(非常缓慢)Mephx基因型,肺功能快速下降。Yoshikawa.等等。25.还认为外显子3的个体纯合变形与高级COPD的发展相关,而不是对COPD的易感性相关。不足的Mephx酶活性可能在COPD疾病状态的进一步进展中发挥重要作用。目前的研究结果与上述研究一致,并强调患者气道阻塞非常严重的患者(FEV1<35%pred)损伤显示外显子3纯合子变体的频率高于轻度或中度肺功能患者。本研究也是第一份证明GSTM1无效基因型是发展为严重COPD的独立危险因素的报告。GSTM1空基因型在烟草烟雾中对各种有毒物质的细胞防御中导致解毒功能的明显酶缺陷。具有纯合mEPHX外显子3变体或GSTM1空基因型的个体将表现出缓慢的酶活性,并且可能不太容易对香烟烟雾中的环氧化物或其他有毒颗粒解毒。长期接触外源性物质会导致更大的组织损伤和肺部炎症,并导致肺功能更快地下降。因此,有理由得出结论,携带突变型mEPHX外显子3等位基因、GSTM1空基因型或两者兼有的个体可能出现严重的肺功能损害。
在本研究中,仍有几个限制。首先,雄性和女性的数量并不平衡,招募了相对较小的人群,特别是在严重的COPD组中。主要患者和慢性吸烟者的主要人口是台湾的男性。因此,难以找到一组平衡的基因型研究。其次,征集了案件和控制受试者从第三大学医院招募。这种基于医院的招募患者可能会导致选择偏见。第三,不可用关于香烟吸烟以外的环境污染或吸入刺激物的信息。因此,难以量化它们对气道阻塞的贡献。
总之,发现遗传变体的共存,包括至少一种缓慢突变体微粒环氧化物水解酶等位基因和谷胱甘肽年代-转移酶M1-null(给予有缺陷的解毒酶功能)和纯合异亮氨酸105谷胱甘肽年代-在台湾人群中,转移酶P1(发挥较少保护机制)基因型是慢性阻塞性肺疾病易感性的重要危险因素。此外,微粒体环氧化物水解酶外显子3和谷胱甘肽的突变等位基因年代-Transferasem1-null基因型是发育严重的慢性阻塞性肺病的独立因素。在所检查的受试者的数量的限制方面,本研究是初步工作,并且应使用较大的人群进行进一步的研究。此外,对更候选基因的研究,例如十二生素相I和II代谢酶的研究,仍然是必要的,以阐明慢性阻塞性肺病作为复杂的多基因疾病的遗传发病机理。
致谢
作者要感谢C.A.D.Smith和D.J.Harrison在微粒体环氧化物水解酶多态性基因分型分析方面提供的技术援助。
- 收到2003年9月15日。
- 接受2004年1月28日。
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