文摘gydF4y2Ba
人类嗜酸性粒细胞是由整合素表达的迁移,构象改变,胞质磷脂酶的激活gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。糖皮质激素可以抑制cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在人类嗜酸性粒细胞水解。本研究的目的是确定丙酸机制(FP)单独或结合氟替卡松加沙美特罗(SM)阻塞粘附由βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba整合素在人类嗜酸性粒细胞。gydF4y2Ba
人类嗜酸性粒细胞被负磁分离的选择。βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba必经integrin-mediated嗜酸性粒细胞粘附是衡量残余嗜伊红的过氧化物酶活性。嗜酸性粒细胞是12 h预处理与FP 24小时,有或没有SM 30分钟。gydF4y2Ba
独自SM和FP单独抑制嗜酸性粒细胞粘附在浓度和时间的方式。SM仅小幅(∼30%)抑制白介素(IL)检测5列车引起嗜酸性粒细胞粘附。封锁IL 5必经诱导引起嗜酸性粒细胞粘附10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba10米FP 24小时被增强gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM从41.5%降至72.5%。类似的封锁也观察到eotaxin-induced嗜酸性粒细胞粘附。SM, FP、FP + SM阻塞:1)upregulation CD11b表面表达;或2)磷酸化cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
β的封锁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba必经integrin-mediated嗜酸性粒细胞粘附在旁边加丙酸氟替卡松加沙美特罗。减少粘连的结果增强核易位的胞质磷脂酶的封锁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba通过添加氟替卡松加沙美特罗fluticasone引起的。gydF4y2Ba
- 粘附分子gydF4y2Ba
- βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量受体激动剂gydF4y2Ba
- 嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba
- 丙酸gydF4y2Ba
- 糖皮质激素gydF4y2Ba
- 氟替卡松加沙美特罗gydF4y2Ba
这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所(NHLBI)授予HL高46368 NHLBI再保险公司格兰特HL 56399(境列夫)和AI高52109(朱x)和葛兰素史克(Research Triangle Park,数控,美国。gydF4y2Ba
嗜酸性渗透的组织血管包括多个步骤包括定向趋化性、附着力和血球渗出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。嗜酸性粒细胞粘附βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba高整合素在CD11b / CD18 (Mac检测1),免疫球蛋白表生的,细胞间粘附分子(ICAM 1)应承担的,早期是一个重要的步骤在过敏性炎症细胞迁移发生在哮喘gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。封锁的CD11b子单元人类嗜酸性粒细胞粘附抑制gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba并导致抑制嗜酸性粒细胞浸润到航空公司gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
最近的调查表明,氟替卡松加沙美特罗(SM)、长效βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba高选择性肾上腺素能受体激动剂可能也有一个独立的抑制作用在哮喘炎症反应gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。SM已经报道的嗜酸性粒细胞减少依从性大鼠呼吸道粘膜血管gydF4y2Ba12gydF4y2Ba和嗜酸性粒细胞粘附纤连蛋白诱导白介素(IL)检测5和血小板激活因子gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。其他βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂(非诺特罗、舒喘灵和procaterol)已报告抑制CD11b upregulation嗜酸性粒细胞引起的血小板激活因子gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,但另一个长效βgydF4y2Ba2gydF4y2Baformoterol所致肾上腺素能受体激动剂,没有抑制CD11b upregulation表面gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
吸入糖皮质激素也已报告在哮喘减少嗜酸性粒细胞浸润;然而,糖皮质激素减弱嗜酸性粒细胞粘附的机理并不成立gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。当前作者报道之前,胞质磷脂酶AgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)激活对β至关重要gydF4y2Ba1gydF4y2Ba量和βgydF4y2Ba2gydF4y2Baintegrin-dependent粘附的嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。封锁cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba也阻塞气道嗜酸性粒细胞浸润和减毒气道对乙酰甲胆碱的响应能力gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。必不可少的嗜酸性粒细胞粘附监管一步是磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK) 1/2。ERK 1/2然后磷酸化cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在丝氨酸gydF4y2Ba505年gydF4y2Ba的位置。磷酸化在这个网站将酶转化为活性水解形式。水解膜脂质为溶血,调解嗜酸性粒细胞粘附cPLA进一步要求易位gydF4y2Ba2gydF4y2Ba核膜gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
这次调查是确定β的潜在作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba量和皮质类固醇治疗阻断β肾上腺素能受体刺激gydF4y2Ba2gydF4y2Ba量integrin-mediated引起嗜酸性粒细胞粘附IL 5和eotaxin 1人类嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。研究进行确定的机制引起嗜酸性粒细胞粘附IL 5应承担或eotaxin被单独和分析SM和丙酸(FP)。当前作者的数据表明,SM和FP,即使在组合,不阻止IL 5 -或应承担的eotaxin-mediated upregulation cPLA Mac 1和不块gydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化。相反,它是发现βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激前孵化后与皮质类固醇,cPLA FP,街区的易位激活gydF4y2Ba2gydF4y2Ba细胞核周围的膜,从而阻止integrin-mediated粘附IL 5和eotaxin应承担造成的。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
孤立的人类嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞轻度过敏性隔绝人类志愿者根据协议芝加哥大学的机构审查委员会批准。知情同意是获得所有的志愿者在这项研究之前参与。异位性被定义为一个积极的存在radioallergosorbent测试(拉斯特)得分至少两三个过敏原提取物(gydF4y2BaDermatophagoides farinaegydF4y2Ba、盖草或巨大的豚草)通过问卷调查和利用国家心脏,肺和血液研究所哮喘遗传学项目。这项研究包括一共有16个人20-45年岁七个男性和9名女性。在这项研究中,只有美国国立卫生研究院调查问卷,目的是获得从捐赠者没有哮喘或嗜酸性粒细胞哮喘或过敏药物。所有的受试者收到任何药物前至少1个月的研究。这是符合芝加哥大学和美国政府指导健康保险流通与责任法案(hipaa)捐助者不参与对象的研究。gydF4y2Ba
人类外周血嗜酸性粒细胞被孤立的方法从汉斯修改gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。该方法基于Percoll离心(密度1.089 g·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)隔离粒细胞,低渗的裂解红细胞,,最后,immunomagnetic损耗中性粒细胞的磁性细胞分离系统使用anti-CD16检测涂层mac粒子(Miltenyi研究,桑尼维尔,美国)。嗜酸性粒细胞是经常得到纯度98%,作为评估Wright-Giemsa染色。gydF4y2Ba
治疗卡松丙酸氟替卡松加沙美特罗gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞在罗斯威尔公园resuspended纪念研究所(RPMI)缓冲区(10%胎牛血清,250 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba青霉素和250µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba链霉素,pg·10毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaIL 5)。嗜酸性粒细胞粘附时间效应的SM,整除的10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba嗜酸性粒细胞是pre-incubated缓冲或10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM SM 5-60分钟之前附着力试验。对嗜酸性粒细胞粘附SM的浓度效应,嗜酸性粒细胞是pre-incubated 10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM SM 30分钟。FP的组合效应和SM整除的嗜酸性粒细胞孵化与缓冲或10 37°CgydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM FP 12 - 24 h,然后孵化了一个额外的缓冲或SM 10点30分钟gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba−7gydF4y2Bam .重复样本准备附着力试验。重组人IL 5 (pg·10毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)被添加到维护嗜酸性粒细胞可行性实验期间,但没有对细胞粘附的影响gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞粘附试验gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞粘附是评估剩余嗜酸性粒细胞粘附细胞的过氧化物酶(EPO)活动gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。简而言之,96量微型板块被涂上一层100µl牛血清白蛋白(BSA, 10µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)溶解在汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院)和孵化一夜之间在4°C和阻塞200µL / heat-inactivated的胎牛血清在60分钟37°C。嗜酸性粒细胞(1×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ 100µl)与不同浓度的FP pre-incubated或SM(英国葛兰素史克、中的)表示,次为37°C。细胞然后被添加到BSA-coated井有或没有刺激器和允许接受10分钟在冰上。盘子被迅速加热到37°C和孵化了30分钟。与哈佛商学院3×洗涤后,100µl RPMI缓冲区添加到反应井,和系列稀释的原始细胞悬浮液被添加到空井生成标准曲线。100µl促红细胞生成素衬底(1毫米过氧化氢,1毫米gydF4y2BaOgydF4y2Ba苯二胺,0.1% triton X高100年三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值8.0)然后添加到井。30分钟后在室温下孵化,50µl 4 M HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba是添加到停止反应。吸光度测量在490 nM标(Thermomax;分子设备,门洛帕克,CA)。所有分析都在重复执行。刺激嗜酸性粒细胞粘附镀BSAβgydF4y2Ba2gydF4y2Ba量整合素依赖,anti-CD11b或者反CD18抑制性抗体抑制这种粘连明显gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
免疫荧光显微镜gydF4y2Ba
刺激细胞后,5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞准备从cytospin Shandon cytospin模型3 (Shandon,匹兹堡,美国)200×gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟。用锡纸包好的幻灯片被储存在4°C,直到进一步的使用。进行分析,嗜酸性粒细胞的幻灯片在2%多聚甲醛固定20分钟在PBS和0.4%处理gydF4y2BapgydF4y2Ba苯醌(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在PBS 10分钟。幻灯片permeabilised使用0.1%在PBS皂素了15分钟。permeabilisation后,幻灯片被封锁使用2%的人类免疫球蛋白(Ig) G(试剂级我还是4506;在室温下σ)60分钟。洗后一步,幻灯片孵化了单克隆抗体(mAb)针对cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯、钙、美国)在室温下60分钟。绑定马伯cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba是被孵化和20µg·毫升幻灯片吗gydF4y2Ba−1gydF4y2BaBODIPY FL-conjugated山羊anti-mouse二级抗体(分子探针,尤金,或者美国)在室温下60分钟。最后洗后,10µL anti-bleaching代理(0.4%丙酸酯(σ))3:1甘油:TBS盖玻片前使用的应用程序。消极的控制是由用PBS代替主要的抗体或鼠标控制同形像。幻灯片被荧光显微镜在蔡司Axoplan显微镜(放大×1000;卡尔蔡司,Thornwood,纽约,美国)。gydF4y2Ba
免疫印迹分析胞质磷脂酶AgydF4y2Ba2gydF4y2Ba表达和磷酸化gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba·集团gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的存在与否)pre-incubated FP 24 h和SM 30分钟。然后细胞被刺激与10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaIL 5或100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baeotaxin(研发系统、明尼阿波利斯,美国)30分钟,反应是短暂离心拦住了。颗粒细胞溶解在80年µl沸腾的缓冲区(50毫米Tris-HCl, 2毫米EDTA, EGTA 2毫米,2毫米NagydF4y2Ba3gydF4y2Ba签证官gydF4y2Ba4gydF4y2Ba氟化钠,50毫米,2.5毫米DFP, 1% SDS,蛋白酶抑制剂鸡尾酒),用,煮5分钟。之后,14µl 6×加载缓冲区添加,和混合煮5分钟,然后保存在−80°C。样本进行sds - page,用7.5%丙烯酰胺凝胶减少条件下(15马·凝胶gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。Electrotransfer聚偏二氟乙烯膜蛋白质的凝胶是通过使用半干系统(400毫安,60分钟)。膜被2% BSA为60分钟,然后孵化1:1000 anti-phosphorylated cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(美国细胞信号技术,贝弗利,MA)或1:400 anti-cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba抗体稀释Tris-buffered盐水加渐变检测20 (TBS T)应承担的60分钟。然后膜清洗三次20分钟的TBS T。山羊anti-rabbit Ig共轭与辣根过氧化物酶在TBS稀释1:3000 T和孵化与聚偏二氟乙烯膜60分钟。细胞膜又洗了三次与TBS的T和化验的增强化学发光体系(美国Amersham,阿灵顿高温超导,IL)。gydF4y2Ba
通过免疫荧光流式细胞仪分析表面CD11b表达式gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞是pre-incubated 10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM FP 24 h和10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM 30分钟,然后刺激有或没有10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaIL 5或100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baeotaxin为30分钟。此后,嗜酸性粒细胞在400×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,球在PBS / 2% BSA resuspended。整除的5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba嗜酸性粒细胞是孵化10µL马伯CD11b(熊1)或isotype-matched控制抗体在4°C为30分钟。2洗后,细胞被孵化与过度的荧光素isothiocyanate-conjugated山羊antimouse免疫球蛋白在4°C 30分钟。这些细胞被洗两次,resuspended 1%多聚甲醛和保持在4°C到分析。流式细胞术进行FACScan(山景城,正欲、钙、美国)。荧光强度是决定从每个样本至少5000个细胞。gydF4y2Ba
孵化卡松丙酸后测定嗜伊红的可行性gydF4y2Ba
以确定FP嗜曙红细胞生存能力的影响,台盼蓝排斥评估与不同浓度的FP嗜酸性粒细胞孵化。整除的10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba嗜酸性粒细胞是孵化与10 12 - 24 h在37°CgydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba10 M FP的pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的IL 5。嗜酸性粒细胞当时离心机400×gydF4y2BaggydF4y2Ba和颗粒resuspended 10µl哈佛商学院。同等体积的0.01%台盼蓝补充道,在血球计数器和可行的嗜酸性粒细胞计数。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
所有的值表示为均值±sem。组之间的差异被配对t评估测试。以上两组比较,差异组评估单向方差分析(方差分析)。差异被发现的地方,比较组间是由费雪的防护水平低的差异测试。嗜酸性粒细胞粘附正常化是百分之一的刺激响应控制在同一受试者使用以下方程:附着力(%)= 100×(测试样本data-negative控制数据)/(积极控制data-negative控制数据)。SM所表现出的组合效应和FP被指定为:协同抑制时两种药物组合>抑制单靠FP +抑制单靠SM。添加剂抑制定义当FP的综合效应,SM在一起>抑制通过FP单独或SM。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
氟替卡松加沙美特罗对刺激嗜酸性粒细胞粘附的影响gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞粘附镀BSA引起通过10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的IL 5或100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baeotaxin,以前建立的最佳浓度gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。镀Nonstimulated嗜酸性粒细胞粘附BSA为2.1±0.3%(平均±sem)。IL 5应承担造成23.8±2.2%的嗜酸性粒细胞粘附镀BSA,虽然eotaxin造成17.5±3.3%附着力(p < 0.01)gydF4y2Ba与gydF4y2Ba控制,比较)。SM(超大的浓度10gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM)抑制IL 5 -和eotaxin-induced嗜酸性粒细胞粘附镀BSA时间的方式;最大限度的抑制是通过30 - 60分钟(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。因此30分钟孵化时间SM被选为后续实验。量效曲线也与SM (10 pre-incubation后生成gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba打光最后一gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米)30分钟。统计上显著的嗜酸性粒细胞粘附的封锁,SM仅实现了只有在浓度≥10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM。IL 5-induced应承担的嗜酸性粒细胞粘附被10∼29%gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM 71.1±10.3%的刺激控制(p < 0.05)和67.5±4.6% (p < 0.01)的刺激控制细胞激活eotaxin(图1 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
氟替卡松加沙美特罗和丙酸对刺激嗜酸性粒细胞粘附gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞是用FP预处理(10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba打光最后一gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba米)12小时或24小时,然后用10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba米或十gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM 30分钟。封锁造成的嗜酸性粒细胞粘附IL 5与FP就增强了SM早在12 h和大幅增加24 h(图2 a, bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。组合造成的嗜酸性粒细胞粘附抑制IL 5嗜酸性粒细胞SM处理(10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba米或十gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba米)+ FP (10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−6gydF4y2BaM 12 h)添加剂(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。与FP 24小时预处理后,SM和FP也生产添加剂抑制。然而,抑制增效为10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM FP + 10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM(图2 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
几乎相同的结果对附着力的封锁造成eotaxin(图2 c, dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。进步增强的抑制粘附在全浓度范围引起的FP 10gydF4y2Ba−10gydF4y2BaSM和大大增强为同一浓度的FP co-treatment 10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM(图2 c, dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。至于地理IL 5,影响观察到12 h在每个浓度大幅放大FP 24 h后孵化(图2 c, dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。在所有情况下,附着力的封锁与FP + SM co-treatment协同(10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba10 M FP在24小时gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM)或添加剂(所有其他的组合)。gydF4y2Ba
在每个试验中,孵化的影响与FP细胞生存能力评估。FP没有影响嗜曙红细胞生存能力在12或24小时以台盼蓝排斥或propidium碘。生存在每个实验的开始和结束≥98%。因此,封锁粘附的FP并不相关的细胞治疗期间的生存能力下降。gydF4y2Ba
影响丙酸氟替卡松加沙美特罗CD11b表面上表达gydF4y2Ba
进行了研究以确定封锁的Mac量1 (CD11b / CD18) upregulation占引起嗜酸性粒细胞粘附FP的封锁,SM或添加剂的FP + SM。这些研究,大浓度的SM (10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM)和FP (10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba米)被用来检查的影响以FACScan CD11b表面表达。FP和SM独自阻塞造成的表面CD11b upregulation IL 5(图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)或eotaxin(图3 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。FP + SM即使在大浓度的组合也没有抑制CD11b upregulation造成的表面表达IL 5或eotaxin(图。3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
丙酸在胞质磷脂酶的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba蛋白表达和磷酸化gydF4y2Ba
确定的机制SM和FP添加剂/协同增强β的封锁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba高整合素粘附在SM和FP丝氨酸的效果gydF4y2Ba505年gydF4y2Ba的磷酸化cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba研究了免疫印迹分析。孵化的嗜酸性粒细胞FP (10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba米)24小时或SM (10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba米)30分钟没有抑制cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba总蛋白质磷酸化或表达式。联合治疗的结合10gydF4y2Ba−9gydF4y2BaM FP +和10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM,导致> 70%的封锁嗜酸性粒细胞粘附(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)也没有抑制cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
丙酸在胞质磷脂酶的影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位gydF4y2Ba
进一步确定FP的假定的机理和SM阻断βgydF4y2Ba2gydF4y2BacPLA高整合素粘附在细胞内的分布gydF4y2Ba2gydF4y2Ba检查了immunofluorescent染色(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。负控制显示最少的荧光背景(图5 kgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba主要是局部的,如果细胞的细胞质(图5 lgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。刺激后与2µM A23187(作为一个积极的控制),10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaIL 5或100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baeotaxin 30分钟,cPLA immunofluorescent染色gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是局部细胞的细胞核周围的区域(图5 a、f mgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。预处理和10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM FP 24 h完全抑制cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位造成的核激活与IL 5和eotaxin(图5 b, ggydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。预处理与10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba30分钟或10 M SMgydF4y2Ba−9gydF4y2BaM FP 24 h不cPLA大大块gydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位(图5 c, d, h,我gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。然而,10的结合gydF4y2Ba−9gydF4y2BaM FP + 10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM完全抑制cPLA的易位gydF4y2Ba2gydF4y2Ba核被膜(图5 e, jgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
这次调查的目的是确定β的独立影响gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体刺激通过SM和皮质类固醇治疗与FPβgydF4y2Ba2gydF4y2Ba整合素(CD11b / CD18)介导嗜酸性粒细胞粘附。生成进一步的研究来确定SM FP的anti-adhesive效应增强,和额外的研究来确定执行相加或协同的机制增加引起的嗜酸性粒细胞粘附的封锁,IL 5或eotaxin可能发生。gydF4y2Ba
目前的数据表明,SM和FP抑制IL 5 -或eotaxin-induced应承担的嗜酸性粒细胞粘附在浓度和时间的方式,尽管化合物是特别有效的唯一可能达到的浓度在人类航空吸入(英国葛兰素史克、中的)。然而,抑制IL 5 -应承担或eotaxin-induced嗜酸性粒细胞粘附引起10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba10 M FP是大大增强了gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM(图2 b, dgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),这引起了> 2日志FP的功效在低浓度的变化。SM和FP的组合协同(FP≤10gydF4y2Ba−9gydF4y2Ba与10 M在24 hgydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM eotaxin和FP≤10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba与10 M在24 hgydF4y2Ba−7gydF4y2BaM SM IL 5)应承担或添加剂(与所有其他组合测试)β的封锁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba整合素粘附的人类嗜酸性粒细胞(图。2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
确定添加剂的机理和/或协同之间的附着力增强FP和SM,研究进行单独检查这些化合物的作用并在1)β相结合gydF4y2Ba2gydF4y2Ba量整合素upregulation嗜酸性粒细胞表面;2)cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化,磷酸化cPLA 3)易位gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在细胞核周围的膜gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。Upregulation的βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba高整合素在cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化和cPLA易位gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所有需要IL 5量刺激嗜酸性粒细胞粘附gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。封锁任何一步的这些过程也会导致附着力的封锁gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。发现SM + FP的浓度,导致大量嗜酸性粒细胞粘附的封锁在24小时没有影响在Mac量1 upregulation(图3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)或cPLAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化(图4所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)由IL 5或eotaxin应承担造成的。相比之下,很小的浓度SM + FP实质性cPLA的封锁造成的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。当前作者曾表明,FP块LTC嗜酸性粒细胞分泌gydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过阻止cPLA易位gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在细胞核周围的膜gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。这发生的机理尚未进一步定义;然而,抑制要求48小时孵化,这表明FP检测诱导转录cPLA的封锁是必要的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba迁移。本研究发现大量增加的FP检测诱导粘附的封锁与SM在治疗后24小时。SM也大大增强FP阻碍易位的影响(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这些数据表明,βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba应承担的肾上腺素能受体刺激,这被证明能增加核易位的胞质类固醇受体,可能导致时间和量化转录事件块整合素粘附的扩充。cPLA的确切机制gydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位受阻,然而,仍有待阐明。gydF4y2Ba
在实验中,目前作者确保嗜酸性粒细胞可行性期间保持文化。张gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba报道说,《外交政策》引起嗜酸性粒细胞凋亡,增加IL 5减弱FP的毒性作用细胞的可行性gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。因此,pg·10毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaIL 5添加到培养基所有实验在当前的研究中。嗜酸性粒细胞的可行性与FP 24小时孵化后> 98%。然而,IL 5浓度用于维护应承担的可行性对嗜酸性粒细胞粘附在这些研究没有影响。gydF4y2Ba
当前的结果与一些研究,没有发现内皮细胞糖皮质激素对嗜酸性粒细胞粘附的影响gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。这些差异的基础机制的不确定,但可能与不同技术测量的附着力。目前的研究使用单一纯化配体浓度建立之前gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba而不是培养的内皮细胞,表达多个计数器配体如地理ICAM 1,血管细胞粘附分子1和内皮细胞白细胞粘附分子1和有潜在的分泌炎性介质。FP也明显比地塞米松更大的力量。最后,在初步实验在这项研究中,作者发现小功效的FP浓度与吸入后取得的航空公司。添加适量浓度SM FP至关重要实现实质性的抑制的封锁,这封锁在相对较短的时间内实现了课程(12 - 24 h)与之前的研究相比,使用糖皮质激素gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
重要的是要考虑一些重要的当前研究的局限性。在FP和SM的浓度≤那些在人类实现航空公司(英国葛兰素史克公司提供的数据中的,),这些研究仍然进行gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。IL 5介绍了保险应承担的嗜酸性粒细胞生存,因此确保了封锁的附着力不相关的细胞死亡。新孤立的人类嗜酸性粒细胞也在这些研究中使用。尽管如此,这些数据不能直接外推到人类哮喘状态或其他细胞可能参与哮喘气道炎症。因此,这些数据不肯定或否定嗜酸性粒细胞的作用在人类哮喘。相反,当前的研究表明,炎性细胞是非常普遍的在人类哮喘,SM + FP法分析和防止cPLA易位的增效剂gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,这是一个重要的酶在炎性细胞粘附和前列腺素的合成和白细胞三烯的第一步。因此,数据显示添加β的一种机制gydF4y2Ba2gydF4y2Ba像肾上腺素能受体激动剂可能在细胞水平上增加糖皮质激素的抗炎作用。gydF4y2Ba
最后,氟替卡松加沙美特罗和丙酸单独导致大量β的封锁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba量整合素粘附白介素5或eotaxin应承担造成的。然而,在结合,有一个明显的累加效应,在低浓度,是协同整合素粘附阻挡在外面。增强的封锁gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba粘连造成Mac 1 upregulation应承担的封锁和封锁的胞质磷脂酶AgydF4y2Ba2gydF4y2Ba磷酸化而增加的类固醇诱导性抑制胞质磷脂酶AgydF4y2Ba2gydF4y2Ba易位的细胞核周围的信封。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba社论评论见501页。gydF4y2Ba
↵gydF4y2BaMyo和x朱贡献同样这项工作。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2003年6月11日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2003年11月27日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba