抽象的
人类Y‐box结合蛋白YB‐1是一种调节基因表达的多功能蛋白。YB‐1的核表达与肿瘤患者的化疗耐药和预后不良有关。
通过免疫组织化学来研究来自77例NSCLC患者的原发性肿瘤的尸体肿瘤的代表性样本,用于评估YB-1核表达的预后作用。
在所有肿瘤样品中发现细胞质YB-1表达,而核表达仅在48%中观察到。与组织学分类,临床参数或肿瘤大小,阶段和转移状态没有相关性。然而,与没有核表达的患者相比,肿瘤中阳性核YB-1表达的患者表现出降低的存活时间。包括关于P53的组织学和突变状态的信息增加了核YB-1的预后价值。核YB-1表达和P53突变的患者具有最糟糕的预后(3个月中位生存期),而无核YB-1和野生型P53(15个月中位生存期)患者发现最佳结果。
这表明两个标记的组合分析允许更好地识别具有不同预后的亚组。Y箱结合蛋白的核表达似乎是一个独立的预后标志物。
肺癌是西方世界癌症死亡的主要原因之一1。已经开发出新的化学治疗药物和多式化治疗策略,包括第一次试验基因替代疗法,以改善预后[2-4]。然而,非物质细胞肺癌(NSCLC)患者的存活时间保持不变和差。鉴定新的预后标记表征肺癌生物学似乎是必要的,以鉴定患者亚组,从这些新概念中受益[5]。
人Y盒结合蛋白Yb-1是一种多功能蛋白,其调节转录和平移水平的基因表达[6]。作为转录因子,它与若干基因的启动子区中的Y型箱序列结合,一个例子是编码p-糖蛋白的人多药抵抗1基因[7]。如果过表达,这种p-糖蛋白似乎通过减少耐药细胞的药物积累来与多药耐药相关[8]。这导致了它是评估化疗疗效的预后标志物[9]。
YB‐1蛋白主要位于细胞质中。当人类癌细胞被紫外线(UV)照射或抗癌剂处理时,YB‐1易位到核[10]。对于卵巢癌,已经证明YB‐1的核表达与获得性顺铂耐药[11]相关。转染具有YB‐1反义结构的人表皮样癌细胞可增加对顺铂、丝裂霉素C和紫外线辐射的敏感性,这表明YB‐1对诱导脱氧核糖核酸(DNA)[12]交联的药剂的细胞毒性作用具有保护作用。此外,YB‐1与肿瘤抑制因子p53相互作用,p53也可被基因毒性应激和DNA损伤激活,支持DNA损伤反应和DNA修复中的功能作用。此外,这种相互作用已经被证明可以相互调节两种蛋白的DNA结合功能,从而改变含有YB‐1或p53结合位点的基因的表达,例如多药耐药1基因[13]。
已经对乳腺癌[14],人骨肉瘤和滑膜肉瘤的进一步临床研究表明了YB-1和高p-糖蛋白水平之间的关联[14] [15,16]。此外,康马拉等等。[17]报道YB‐1在卵巢腺癌中是一个有用的预后标志物。对于非小细胞肺癌,Shibahara等等。[7]报道,YB-1的核表达可能是疾病进展的重要因素。与细胞质YB-1表达患者相比,它们对那些核患者的患者发现了较差的预后,特别是在鳞状细胞癌中。
因此,在本研究中,研究了NSCLC中YB‐1核表达与p53[13]的预后相关性。
患者和方法
耐心
代表性肿瘤样品(n = 4)在来自77例NSCLC(59名男性,18名女中位65 ys,范围46-83 YRS)的初前肿瘤的尸体肿瘤中获得。研究从肿瘤和分析中研究的所有患者进行了回顾性。所有患者均在莱比锡大学医疗中心和相关学院医院的1991年至1996年之间进行处理。根据世界卫生组织指南,两位病理学家进行组织学肿瘤分类[18]。根据经修订的肿瘤,节点,肺癌转移(TNM)分期系统的诊断时测定肿瘤阶段[19]。回顾性评估存活时间和临床数据(表1⇓).
Western印迹分析
用于Western blot分析,从Hela细胞(No。CCL地理分部2;美国类型培养收集,Manassas, VA, USA),采用三氯乙酸沉淀法和免疫印迹法,采用1:25 500稀释的YB‐1抗血清,按照标准程序进行。该多克隆肽抗血清与其他Y‐box蛋白不发生交叉反应,使用相同的肽[6]亲和纯化。阻断肽在10‐倍摩尔过量使用。
免疫组化分析p53和Y‐box结合蛋白
通过免疫组织化学使用2μm福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片,分析P53和YB-1的蛋白质表达。对于抗原解压缩,在柠檬酸盐缓冲液(0.01μm,pH6.0)中,将切片煮沸10分钟。用鱼血清封闭(海块TM值;Pierce,Rockford,IL,USA),用初级单克隆抗P53抗体(DO-1,稀释1:50; BDBiosciences,Heidelberg,德国)或用多克隆YB-1抗血清(稀释),将切片孵育60分钟1:200)。通过生物素 - 缀合的第二抗体和过氧化物酶 - 共轭链霉抗生物素蛋白(杰克逊免疫研究实验室,West Grove,Me,USA),使用金属增强的3,3'-二氨基苯胺作为底物(Pierce),所染色的一抗。切片用血红素染色。
通过两种观察者以未知的临床和组织学数据的观察员以盲化的方式分析切片。评估四个高功率场(400×),用于定位和阳性细胞的百分比(0-100%,5%步骤)。如果> 10%的肿瘤细胞显示出中度或强烈的核染色,则被认为是阳性的样品。
P53的突变分析
将DNA从30μm嵌入的组织中提取。基因组DNA在Demaraffination后分离并使用Invishorb进行再水化TM值基因组DNA套件II(Invitek,德国柏林)。
对于P53单链构象多态性(SSCP)的DNA结合区域中的突变检测,进行聚合酶链反应(PCR)分析[20]。它被用作既定的标准方法,尽管SSCP可能会错过一些P53突变,因此患者被归类为P53的野生型可能携带未检测到的突变。使用寡核苷酸引物对对模板DNA进行PCR,用于扩增外显子5-8。根据制造商使用DNA银染色试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech,Freiburg,德国)的银染料,分析了扩增的片段。根据制造商。
统计分析
Kaplan-Meier产品限制方法估计总生存率。统计比较通过对数级型搭扣-COX测试进行。COX回归进行多变量存活分析。大多数生物和病理变量用作二分法(分类)变量。患者分层阳性(P53p,YB-1p)相对负(p53负的,YB-1负的).P53遗传状态在P53野生型中细分(P53WT.)相对p53突变(p53mut)。P53和YB-1的免疫组化学数据的截止值设定为10%呈正染色的细胞,IE。肿瘤中≥10%染色细胞被认为是阳性结果,认为<10%染色的细胞被认为是阴性[21]。
对于P53表达和YB-1核定位与肿瘤分类的相关性,以及临床参数,应用Pearson的Chi-Squared试验。将渔民的确切试验应用于存活分析,以测试P53和YB-1的阳性和阴性亚组中不同疗法的分布。
结果
跟进
在诊断时,51%的患者(77个)的患者在肿瘤阶段IV中,而只有49%是阶段I-III(38个,共77个)。由于其先进的阶段,12名患者仅接受了最佳的支持性护理,通过手术切除,18次通过化疗和13次通过放射治疗治疗。九名患者接受手术和辅助化疗,四个新辅助手术和放疗,以及六种接受的化疗和放疗。三名患者用手术,佐剂化疗和放射治疗治疗。这些患者在Yb-1(p> 0.21)的正和阴性亚组中,以及P53(p> 0.67),以及P53突变状态子组(P> 0.99)。
中位数总生存率为8个月。总体1-和2 yr的存活率(包括手术治疗的患者的30天围闭性死亡率)分别为34%和12%。
P53表达的免疫组织化学分析
P53蛋白的过度表达(图1A⇓)在77例中发现了平均数量(平均值±SEM)62±3%的P53表达细胞的41例。二十九个肿瘤显示出0%,其中77例中的一个77个,77个样品中的6个,显示出10%的细胞呈正染色的p53。
为了分析P53的临床相关性,蛋白质表达状态与肿瘤和临床参数相关。肿瘤参数(大小,淋巴结转移状态,远端转移状态,肿瘤阶段,分级和组织学分类)也不是年龄,性别或治疗状态表现出与P53表达的显着相关性。
Y‐box结合蛋白表达的免疫组化分析
用于免疫组织化学的Yb-1抗血清的特异性通过Hela细胞的蛋白质印迹分析显示(图2⇓).使用抗血清在细胞(泳道1)中滴落的50kd Yb-1蛋白质,而添加相应的阻断肽废除信号(泳道2)。
在77nsClc肿瘤样品中发现细胞质中的YB-1表达。YB-1的核表达(图1B⇑)在77名患者中观察到,而在77名患者中的40例中观察到,发现没有发现核YB-1表达的细胞。这些37个NMSCLC患者中,具有正核YB-1表达的细胞的级分为50±3%。
组织学分类和临床参数均未显示出与核YB-1状态显着相关性。肿瘤大小,阶段或淋巴结转移状态和核YB-1表达之间也没有相关性。
然而,远处转移状态和分级类型与YB‐1核表达显著相关。有远处转移的肿瘤YB‐1核表达阳性的比例为61%,阴性的比例为39%,而无远处转移的肿瘤YB‐1核表达阳性的比例为36%,阴性的比例为64% (p<0.05)。
关于肿瘤分级,在G3中的36%的分级型G2和61%样品中观察到YB-1的核染色,而核染色在64%的分级型G2和39%的样品中不存在核染色G3(P <0.03)。这些数据表明YB-1的核表达可以与较低的组织学分化的肿瘤组织相关。患者型G1和G4未在肿瘤样品中表示。
P53突变分析
在77个主要肿瘤(53%)中的40中,发现p53基因中的突变。检测到共44个突变:在外显子5,7中的7,在外显子7,18中的七,在外显子8中有九个初级肿瘤显示出两个外显子的突变。突变P53的肿瘤没有显着增加的蛋白质表达。其中案例,58%,P53突变相对49%没有P53突变的病例染色P53阳性。
y箱结合蛋白与存活组织学,P53状态和核定位的相关性
为了确定P53蛋白表达和突变状态(外显子5-8)的预后值,以及Yb-1的核表达,进行了单变量的存活分析。
P53蛋白表达没有预后影响(p53p中位生存期6个月,p53负的中位生存9个月;p = 0.56)以及P53突变状态(P53WT.中位生存期10个月,P53mut中位生存5个月;p = 0.16)。
肿瘤中阳性核YB-1表达的患者表现出与没有核表达的患者相比减少存活时间(中位存活5个月)(中位存活13个月,P <0.0001;图3⇓).此外,通过比较I-III期、IV期和治疗干预等亚组的生存时间,排除了由于异质患者组造成的人为影响(表2)⇓).
基于Okamoto的数据等等。[13],谁描述了P53与YB-1的直接相互作用,P53的进一步存活分析WT./ p53.mut和p53p/ p53.负的进行亚组和YB-1核表达(表2⇑).P53中可以看到最好的结果WT./ YB量1负的组(中位生存期15个月;图4⇓),在p53中负的/ YB量1负的组(12个月中位生存;图5⇓).
自谢哈拉以来等等。[7]发现对组织学的预后,比较了腺癌和鳞状细胞癌的存活时间的差异。在肿瘤的两种组织学亚组中,核YB-1表达的患者比核YB-1表达的患者存活时间(腺癌YB-1p中位生存5个月,YB-1负的中位生存期14个月,P <0.009;鳞状细胞癌YB-1p中位生存期3个月,YB‐1负的中位生存15个月;P <0.0005)。由于少量细胞癌(n = 7)和支气管肺泡癌(n = 4),对这些基团进行比较了存活时间。
为了进一步证实核YB-1表达作为独立因素的预后重要性,进行多元分析。这种多变量的存活分析显示出核YB-1表达以外的潜在预后因素(TNM,分级,P53,组织病理学,治疗)没有显着影响,这表明这是独立的预后因素(表3⇓).
讨论
该分析的数据显示NSCLC患者核YB-1表达的预后值。请注意,本研究的标本是从死亡肿瘤死亡的患者的尸肌肌肌肌肌肌肌肌肌杂物中获得。因此,不能排除存活时间可能偏向于较短的存活率。然而,这不会影响/影响本调查的主要结果。观察,核YB-1表达的预后影响,当分析YB-1亚组以排除由分析的组的异质性引起的妄想效应(表2⇑),建议YB-1作为独立的预后标志物。仅P53过表达以及单独的P53突变状态对存活没有显着影响。结果,肺癌中P53改变的弱预后意义,同时伴随着其他群体的结果[22,23]。当加入约p53的表达状态到YB-1的核表达状态的信息,但是,核YB-1表达的负预后相关的二分法变得更加醒目。核YB-1表达和P53突变的患者具有最严重的预后(中位存活3个月),而没有核YB-1表达和野生型P53(15个月中位生存期)的患者发现了最佳结果。自奥卡莫托以来等等。[13]先前已经证明YB-1直接与P53相互作用,并且该结果不需要调节野生型P53,所以该结果不是出乎意料的。占据这些数据表明,两个标记的组合分析可以提供改善的准确性,以鉴定具有不同预后的亚组的准确性。
核YB-1表达的预后影响还用于其他癌症如人乳腺癌[6],卵巢浆液腺癌[17]和滑膜肉瘤[16]。建议YB-1的核定位作为骨肉瘤中的多药耐药的预后标志物[15]。在NSCLC,Shibahara等等。[7]与细胞质YB-1表达(P = 0.049)相比,观察到核YB-1表达的预后性较差的预后患者。然而,在分析组织学亚组的情况下,这种预后显着性仅为鳞状细胞癌而不是腺癌[7]。对不同组织学亚组的分析并未指出组织学对预后结果的影响。在腺癌和鳞状细胞癌中,本作者发现核YB-1表达是阴性预后标志物。对这些发散观察的可能解释可能是患者群组的差异。虽然在本研究中,39例患有肿瘤阶段IV的患者,但在Shibahara的分析中只有7名患者在IV阶段等等。[7]。
临床病理学标志物和核YB-1表达的相关性显示核YB-1表达与远处转移状态以及肿瘤分级的相关性。对于参数,远处转移和较低的组织学分级,更频繁地发现与核YB-1表达的关系。Shibahara发现了相同的结果等等。[7]分级。然而,这些作者还描述了核YB-1表达与肿瘤阶段,T因子和N因子的相关性,除了不同的NSCLC组织学形式的变化。结果中的这种不间断可能是由本研究中研究的较少数量的患者引起的,患有肿瘤阶段的患者群体的差异引起。
在人类癌症细胞中观察到响应于基因毒性应激YB-1的核表达如UV辐射或化疗[12]。ISE的进一步调查等等。[24]提示YB‐1可作为顺铂损伤DNA的识别蛋白。YB‐1调控编码P‐糖蛋白的多药耐药基因MDR1的表达。该蛋白在多药耐药肿瘤表型[25]的发展中起着重要作用。在调查扬茨的时候等等。[25],核YB-1表达的预后影响是根据化疗在两名患者组中的化疗,低风险和高危乳腺癌组中进行评价。在两组中,乳腺癌组织中的高核YB-1表达与不利的临床过程有关。作者得出结论,YB-1表达与临床耐药性以及肿瘤侵袭性相关[25]。在这项研究的结果中,核YB-1表达是NSCLC的独立预后标志物。诸如YB-1,P16或BCL2相关X蛋白[26]的预后标志物是适当的风险组评估的先决条件,以便在NSCLC中的个性化治疗概念。
由于非球细胞肺癌的预后一般是相当差的,因此应加入分子诊断以评估有用的预测标志物,特别是用于化学敏感性。基于Shibahara的数据等等。[7]至于本研究关于核y箱结合蛋白表达在非物质细胞肺癌中的预后影响,有一个受控前瞻性研究是有必要阐明对调查之间的差异,并验证核y盒子的预后价值蛋白质表达与多式式治疗概念有关,包括化疗,辐射,手术和组合概念。
- 收到了2003年3月24日。
- 公认2003年8月21日。
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