摘要gydF4y2Ba
中性粒细胞主导的内核炎症是囊性纤维化(CF)的主要特征,并且易于对预测和干预的易于进行的非侵入性监测的需求增加。gydF4y2Ba
14例稳定的儿科CF患者(8-17岁;平均强制呼气量在一秒钟的预测值中的86.7%)通过分数支气管肺泡灌洗(BAL)和三次痰液诱导,分开2-6周。通过连续10分钟吸入3,4和5%盐水诱导痰。将CFSuTum细胞谱与来自年龄匹配的健康儿童的Bal流体细胞计数和样品进行比较,以及不同时间点以评估再现性。gydF4y2Ba
充足的痰液在> 95%的场合中回收。在所有痰分中,CF患者表现出比健康儿童更高的中性粒细胞计数。中性粒细胞百分比在第一BAL级分(中值92%)中最高,然后是痰,其中连续级分(72,66和64%)下降,而计数在汇集的BAL级分(53%)中最低。增加巨噬细胞百分比反映了中性粒细胞百分比的减少。CF患者不同时间点的痰液诱导结果表明,健康儿童的计数表现出良好的再现性和非体验。gydF4y2Ba
总之,通过在第一个(“支气管”)支气管肺泡灌洗率和较高的汇集中,通过提供低于相对中性粒细胞计数的细胞谱来充分描述气道炎症的儿童痰液诱导的结果。“更多外围”)支气管肺泡灌洗级分。gydF4y2Ba
这项研究得到了Mukoviszidose eV(德国波恩)和Hoffmann-La Roche公司(德国Grenzach-Wyhlen)的资助。gydF4y2Ba
在囊性纤维化(CF)中,胚胎炎症开始于生命的早期,与肺部破坏密切相关gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba.其最突出的特征是持续的中性渗透。早期的抗炎干预可能会阻止这些过程导致肺功能不可逆转的损失。因此,在CF中需要早期检测内核炎症。Bronchoalveolar灌洗(BAL),虽然广泛用于婴儿和儿童的研究目的,但是一种侵入性的程序,因此,在儿科环境中监测不太良好,而不是成年人gydF4y2Ba2.gydF4y2Ba.BAL还被设计用于优先对肺的外周空心进行样本,尽管从BAL中回收的第一种等分试样含有比后续等分试样的支气管组分的第一种等分试样gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba.然而,自20世纪90年代中期以来,痰诱导作为一种敏感和可靠的无创工具在除CF以外的许多气道疾病中获得了重要地位,其结果可与BAL相媲美gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba–gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
先前关于CF患儿诱导痰的研究没有包括与第一次和随后的BAL合用量的比较gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.作为一项前瞻性多中心研究的一部分,本文作者的小组对轻度疾病(1秒用力呼气量(FEV))的CF患者进行了BAL检查gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba) >为预测值的80%),年龄>为5岁gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.在几乎所有的儿童中,中性粒细胞性气道炎症出现在第一次BAL治疗中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,提示其在CF中的诊断价值。gydF4y2Ba
为了评估痰液诱导的有用性,德国柏林柏林医院的儿童被选中和鉴别细胞计数,分析了连续的盐水吸入,因为这些可能在支气管树内的增加深度的区域。gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.更具体地,本研究的目的是将连续痰液样品的炎性细胞谱与来自年龄匹配的健康儿童的Bal流体和痰的曲线进行比较,以及评估痰细胞计数超过三次重复的痰液诱导的重现性.gydF4y2Ba
患者与方法gydF4y2Ba
病人gydF4y2Ba
包括14名CF患儿。所有患儿均参加了支气管肺泡灌洗以评估抗炎治疗(BEAT)研究,这是一项多中心试验,旨在通过反复BAL检查监测支气管内膜炎症的进展,该试验已于3月开始 纳入标准为FEVgydF4y2Ba1.gydF4y2Ba> 80%pred,没有吸入或全身类固醇,无抗炎药(gydF4y2Ba例如gydF4y2Ba布洛芬),没有严重的器官参与。gydF4y2Ba
18名患者中14名患者接受了14名患者的痰检查,其中在节拍学习中的三个BAL检查中的三分之一。四名患者下降,主要是由于缺乏时间。第一次痰液测试时参与患者的临床资料总结在表1中gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.平均值±SD FEVgydF4y2Ba1.gydF4y2Ba36个月前为88.5±15.7%,18个月前为87.9±20.2%。在BAL治疗前,询问患者的临床状况gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba一份标准化问卷,包括温度变化、痰色、体重减轻和咳嗽等问题。所有这些关于患者临床状态恶化的问题在检测前6周的答案都是阴性的。在第一次痰诱导前的一年中,只有4例患者在3个月的检查中能够自动咳痰一次以上。此外,没有人接受正规课程gydF4y2BaI.v.gydF4y2Ba抗生素治疗随需应变gydF4y2BaI.v.gydF4y2Ba治疗必须在最后一个BAL之前的6周完成,这是作为痰液测试的参考。已经用重组人的脱氧来氧核酸酶治疗了五名患者≥3岁。gydF4y2Ba
为了降低BAL和痰液诱导之间变化的可能性,以及避免从前面的BAL或痰液诱导的人工制品,BAL和痰液诱导的间隔以及重复的痰液诱导的间隔为2-6周gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.此外,患者不需要发烧,体重减轻,痰体积增加或痰色,呼吸困难,缺氧或食欲在每次痰诱导之前的损失。由于这种原因,没有患者必须排除。此外,没有患者接受过课程gydF4y2BaI.v.gydF4y2Ba或研究期间口服抗生素治疗的变化。gydF4y2Ba
对照受试者包含25岁匹配的儿童,其特征在于身体检查和调查问卷,以排除任何呼吸道疾病或上呼吸道感染。在这些孩子中没有进行支气管镜检查。gydF4y2Ba
这项研究得到了Charité伦理委员会的批准,并根据法律标准获得了所有儿童和/或其父母的知情同意。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
参与痰液诱导程序的所有节拍研究患者通过由同一调查员进行的标准化协议(PROSE)的标准化协议,经历了3.5毫米(<12 YRS)或4.9毫米(≥12YRS)柔性支气管的支气管镜检查和分数BAL。K.P.保罗)3.gydF4y2Ba.简而言之,滴加20ml级数的0.9%盐水并立即回收至3ml·kg体重的体积gydF4y2Ba−1.gydF4y2Ba. 如前所述,分别对第一部分和后续部分(称为“混合样本”)进行BAL液细胞学检查gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.BAL液体上皮细胞(纤毛状和鳞状)在第一个样本中占<5%,在合并部分中占<2%,并被排除在细胞计数之外。gydF4y2Ba
痰液诱导和处理gydF4y2Ba
CF患者的痰液检查平均在BAL后2.3周进行,此后每隔2周进行两次∼3.2周。健康儿童组进行一次痰诱导试验。所有儿童在同一天的同一时间进行检查。gydF4y2Ba
为了便于与文献数据进行比较,依赖于预先吸入200μg沙丁胺醇和重复血液测定法的验证方案,以尽量减少支气管中的风险gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.从超声雾化吸入高浓度(3,4和5%)的高渗盐水,每浓度吸入2个5分钟。gydF4y2Ba
每隔5分钟进行一次咳痰和肺量测定。痰诱导前也评估肺功能。将痰标本汇集成每种盐水浓度。随后通过计算平均结果进行集中。gydF4y2Ba
通过显微镜目测,从唾液中宏观分离出足够的痰样本(固体和不透明部分较多的是痰,从其余部分中选择,主要是唾液),并在2小时内处理 H(当上皮细胞(鳞状细胞和纤毛细胞)数量小于总数量的5%,且总体积大于1.5%时,这些细胞被认为是足够的 小于1.5毫升的体积 根据显微镜质量,接受mL和上皮细胞>5%的样品)。称重后,将样品以1:2的比例悬浮在sputolysin®(重量/重量)中,培养15分钟 在37°C条件下,在磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH 7.4)中离心10分钟 最小值为600倍gydF4y2BaggydF4y2Ba。然后将细胞重新悬浮在含有1%牛血清白蛋白的PBS中。使用血细胞仪评估细胞计数,并通过台盼蓝排除法评估细胞存活率。细胞离心玻片(Mini Zentrifuge RF;德国哈瑙赫利乌斯)由20000-40000个细胞制备,由一名经验丰富的研究人员计数400-500个细胞(N.Reinhardt)的差异细胞计数(不包括上皮细胞)。痰细菌学不包括在内,因为除两名患者外,所有患者的咽拭子和BAL液细菌学均一致。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
非参数重复措施方差分析用于考虑重复测量的相关性质gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba.为比较健康对照组和患者,对每个细胞类型进行两因素分析,以组和盐水浓度为因素。用单因素分析比较BAL和痰诱导获得的绝对和相对细胞计数的分数型。以时间和盐浓度为因素,采用双因素分析进行重现性检验。此外,确定了类内相关系数以量化重现性gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.p‐值为0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗和诱导痰的安全性和有效性gydF4y2Ba
BAL没有引起并发症,耐受性良好。类似地,痰诱导在儿童研究中被证明是安全的,正如前面对成人所描述的那样gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.FEV的最大秋季gydF4y2Ba1.gydF4y2Ba在诱导期间是〜4.8%,从未超过20%;由于支气管混凝土,没有任何测试必须停止。所有CF患者在连续三个10分钟内吸入时期都产生了足够的痰,但25例健康儿童中的四种仅在一种或两种盐水浓度下进行。CF中的痰液中的重量,作为三次访问的平均值,在3%盐水后为1.1g,在5%后4%和1.4g后1.2g。gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba从7名患者的Bal流体中恢复过来,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba从两个和两个生物到两个。gydF4y2Ba
Bronchoalveolar灌洗液液体细胞学gydF4y2Ba
细胞活力(通过台盼蓝排除法)在第一部分中为79%,在BAL液混合样品中为80%,相应的总细胞数为48×10gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba和60×10gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba细胞·ml.gydF4y2Ba−1.gydF4y2Ba.按照整个击败人口获得的结果gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,参与本研究的患者在第一级分中展现了更大的嗜中性粒细胞与汇集的样品相比:中性粒细胞(在第一个BAL分数中的细胞中的(中位数))92(0.4-96)%和53(2-93)%在汇集样品中(P <0.01)。相应的巨噬细胞百分比为4(0.7-88)%和40(2-93)%,淋巴细胞3(1-11)%和6(1-18)%,嗜酸性粒细胞<1(0.2-2)%两个分数。先前检查相同的14名患者36和18个月,先前已经显示出61和77%的相对中性嗜中性粒细胞计数分别在第一部分BAL流体中。gydF4y2Ba
痰液细胞学gydF4y2Ba
在三个盐水浓度上汇集的样品的可行性在两组(CF患者和对照)中相似(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
鳞状上皮细胞污染在所有病例中<20%,在95%的病例中<5%。CF患者的平均上皮细胞计数为3.2%,对照组为3.9%。与健康儿童相比,CF患者中性粒细胞的绝对数量显著升高(p<0.001)。CF患者中位总计数为3.0×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba,2.2×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba和3.1×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba细胞·ml.gydF4y2Ba−1.gydF4y2Ba3,4和5%盐水后。相比之下,计数低至0.2×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba, 0.1×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba和0.07×10gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba细胞·ml.gydF4y2Ba−1.gydF4y2Ba在对照科目中(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
两组的嗜酸性粒细胞计数均较低,但CF患者的嗜酸性粒细胞计数明显高于对照组(p=0.001)(表1) 1.gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).它们还表现出明显较高的淋巴细胞计数(P <0.001)(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).患者与对巨噬细胞绝对数量的对照没有显着差异。gydF4y2Ba
在CF患者和对照中由不同盐水浓度诱导的痰中中性粒细胞和巨噬细胞的百分比如图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.CF患者的中性粒细胞百分比(中位数72、66和64%)显著高于对照组(中位数11、9和5%;P <0.001),两组之间几乎没有重叠(图1a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
同样,巨噬细胞的百分比不同于CF患者(中位数16,23和30%)和对照(中值83,87和91%; P <0.001)(图1BgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).CF患者和对照组之间嗜酸性粒细胞(p<0.005)和淋巴细胞(p<0.05)的百分比也有显著差异(表1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
连续吸入3%、4%和5%的盐水导致细胞形态的一致变化(图。 1.gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).在健康儿童(p<0.001)和CF患者(p<0.005)中,巨噬细胞作为外周气道和肺泡间隙的标志物,在连续吸入过程中数量显著增加(图。 1bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).相应地,中性粒细胞百分比显著下降(p<0.001和p<0.05)(图1a)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba与gydF4y2Ba痰诱导gydF4y2Ba
总的来说,BAL液中的细胞密度显著低于诱导痰中的细胞密度(p<0.001)。当比较BAL液中的中性粒细胞百分比与CF中的痰中的中性粒细胞百分比时,从BAL的第一部分、三个诱导痰部分和合并的BAL样本中,中性粒细胞的百分比都有一致的下降(p<0.001)(图。 1agydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)作为镜像,巨噬细胞的百分比增加(p<0.001)(图。 1bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。观察到,合并BAL分数中细胞计数正常的两名患者诱导痰中的中性粒细胞百分比增加。在这些患者中,第一组的中性粒细胞数量为1.70±1.84%,合并BAL分数为5.50±4.38%。在诱导痰中,相同的患者显示中性粒细胞百分比3%盐水组为69.33±11.31%,4%盐水组为60.66±17.29%,5%盐水组为64.65±10.39%。至于其他炎症细胞,BAL液和诱导痰中只有嗜酸性粒细胞的百分比有显著差异,痰中嗜酸性粒细胞的百分比更高(p<0.05)。gydF4y2Ba
再现性gydF4y2Ba
为了评估痰细胞计数随时间的可重复性,CF患者在三个不同的场合以3.1-3.4周的间隔重复诱导痰细胞。图 2.gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba描述中性粒细胞的个体百分比(图2a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)和巨噬细胞(图2BgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。第一次和第二次诱导的组内相关系数为0.67 (p<0.05),第二次和第三次诱导的组内相关系数为0.80 (p<0.005),第一次和第三次诱导的组内相关系数为0.71 (p<0.05)。中性粒细胞分别为0.68 (p<0.05)、0.80 (p<0.005)和0.76 (p<0.01)。在非参数方差分析中,巨噬细胞或中性粒细胞没有随时间的显著变化。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究表明,在CF和轻度肺病的儿童中,痰诱导产生炎性细胞的型材,其对应于BAL获得的轮廓。在增加盐水浓度的三次连续吸入后收集的痰样品的分数分析进一步证明了中性粒细胞和巨噬细胞数的梯度,表明通过长时间吸入来采样越来越多的外围气道。虽然在CF患者和年龄匹配的健康对照中可以观察到类似的趋势,但是,蜂窝谱,两组之间可重复区分。痰液诱导良好耐受,所有患者均能够在高渗盐水中吸入后产生痰gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba. 目前的结果表明,在轻度CF儿童的临床和研究中,诱导痰是一种有效且有前途的工具。此外,还提供了随时间变化的重复性数据,这对于未来的治疗干预是必要的。gydF4y2Ba
迄今为止,BAL一般被认为是评估CF儿童气道炎症的金标准。因此,来自本患者的BAL流体差异细胞计数证明了中性炎症,并且与使用相同方法获得的公开数据相当gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.目前对诱导痰的评价是首次对CF患儿的BAL液进行比较。结果表明,诱导痰中中性粒细胞的百分比在BAL液的一级和混合部分的范围内。gydF4y2Ba
年龄匹配的健康对照组的痰细胞计数与文献中描述的成人痰细胞计数相似gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.在这一年龄组之前的报道已经表明,连续盐水吸入的痰样本提供了支气管树深度增加时气道炎症的信息gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.的确,在本研究中观察到的儿童和青少年中性粒细胞数量的变化表明,第一个BAL分数和第一个痰样本更多地来自中央气道,而最后一个痰样本和混合BAL样本更多地来自外周支气管(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).CF患者和对照之间几乎没有重叠的事实是痰中中性粒细胞的百分比是一个强大的论点,即痰诱导样本的支气管树的区域,这对CF中的气道炎症具有高度信息丰富,并且培育者痰诱导潜在优越对这种疾病的平衡gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba. 鉴于第一次BAL组分(通常称为“支气管冲洗”)中的液体回收率(即使在患有CF的稳定儿童中)在数量上也低于后续组分,并且在相当多的情况下,不能产生足够的分析材料,这一点尤其重要gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
尽管如此,痰诱导在CF中的作用是不同的。吸入5%生理盐水后,将BAL液与病情较晚期的成人患者的痰液进行比较,发现炎症指标之间存在合理的一致性gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba然而,在这个人群中,中性粒细胞占了≥痰和支气管肺泡灌洗液样本中80%的细胞,这与支气管内膜炎症随着年龄的增长而发展这一事实相一致。这种极端值可能会对检测治疗效果或监测疾病进展造成问题。因此,替代炎症参数可对炎症变化或支气管肺泡损伤作出反应气道和肺部将是有用的。相反,目前的数据不太接近上限,可能与研究干预对晚期肺部疾病患者的影响有关。gydF4y2Ba
值得注意的是,在第一次吸痰前一年,在3个月的检查中,仅有4名CF儿童能够自发咳痰超过一次。然而,在吸入盐水后,它们都产生了足够的物质。高渗盐水确实是已知的一种有效的动员剂的分泌物在这一患者组,并用于治疗的情况下,否则治疗难。但是,关于耐受性,应考虑到所有儿童的情况都是稳定的。此外,可以进行痰诱导的最小年龄不是本研究的主题。所有患者年龄≥8岁,是否适用于年龄更小的儿童尚不得而知。gydF4y2Ba
如来自腹部相关系数的判断,痰中性粒细胞和巨噬细胞和巨噬细胞百分比对具有轻度CF的儿童高度可重复。由于在6-12周内进行了三次重复的痰液诱导,因此无法对所述疾病的个体长期监测进行结论。通过严格的临床标准排除急性劣化后,获得了轻度疾病患者的BAL的数据gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。BAL和首次吸痰之间的时间间隔仅为2.3周,重复吸痰检查之间的时间间隔为3.2周,因此BAL对吸痰或吸痰对后续吸痰的影响不大。由于不同治疗方式的混杂影响已降至最低,患者在排除了抗炎物质的情况下,目前关于再现性的数据很可能为临床稳定儿童痰中性粒细胞百分比的短期变化提供无偏估计。然而,再现性不仅对于监测疾病的自然病程至关重要,尤其是在p轻度疾病患者,但也用于评估治疗干预措施。这对儿童特别有意义,因为持续的细菌感染需要大力治疗,以防止中性粒细胞炎症,这可能导致肺功能受损之前的肺损伤。即使是两名患者中性粒细胞数量增加(与健康对照组相比)在合并的BAL液中明显可见,显示所有痰成分中的粒细胞数量增加。未来的研究可以前瞻性地评估抗炎治疗对痰细胞学的影响,类似于哮喘,以便在疾病早期对患有CF的儿童进行随访gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
总之,从诱导痰的三个连续部分以及支气管肺泡灌洗液的第一个和合并部分获得的差异细胞计数表明,轻度囊性纤维化儿童气道内存在中性粒细胞炎症。结果一致表明,随着气道深度的增加,中性粒细胞的百分比降低。就中性粒细胞的评估而言,诱导痰被证明是安全和可重复的。因此,痰液诱导应成为未来研究的主题,作为监测囊性纤维化和轻度肺病患儿气道炎症的有效敏感无创工具。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者要感谢U.Schneider(德国柏林洪堡大学Charité)在BEAT研究过程中对支气管肺泡灌洗液中不同细胞计数的评估。gydF4y2Ba
支气管葡萄球菌的成员gydF4y2Ba抗炎治疗研究组评价的灌注:gydF4y2BaF. Ratjen(埃森大学,埃森大学,德国),E.Rietschel(Cologne大学,科隆大学,德国),M. Griese(慕尼黑大学儿童医院,慕尼黑大学,德国),M。Ballmann(汉诺威大学医学院,德国汉诺威大学),G.Döring(Tübingen大学卫生学院,Tübingen,德国),D. Reinhardt(Humboldt大学,柏林,德国),U. Wahn(Charité,洪堡大学,柏林,德国),H.Von der Hardt(汉诺威大学医学院,汉诺威大学)和K.Paul(Charité,Humboldt University,柏林,德国),是这项研究的主任。gydF4y2Ba
- 已收到gydF4y2Ba2002年5月24日。gydF4y2Ba
- 认可的gydF4y2Ba2003年4月14日。gydF4y2Ba
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