抽象的
进行了该研究,以研究慢性稳定哮喘患者诱导痰嗜酸性粒细胞凋亡和临床严重程度,气道阻塞及症状评分之间的关系。
总共,41名Aas评分定义的不同严重程度的慢性稳定哮喘受试者和17名对照组受试者接受了肺活量测定、症状调查表和成功的痰诱导。痰液处理和细胞纺丝进行光镜检查以确定正常和凋亡的嗜酸性粒细胞。
轻度哮喘受试者具有明显较低的痰嗜酸性粒细胞和显着高于中等或慢性严重哮喘的嗜酸性粒细胞凋亡比(AR)。严重的哮喘受试者具有明显更大的年龄,哮喘持续时间和痰液嗜酸性粒细胞计数·mL-1比轻微的哮喘受试者。哮喘受试者的症状评分,严重程度和年龄与AR与AR和痰嗜酸性粒细胞的百分比相反。基线强制呼气量在一秒钟内与痰嗜酸性粒细胞的百分比与AR正相关。
该研究表明,痰中嗜酸性粒细胞凋亡减少与慢性稳定哮喘临床严重程度增加之间存在相关性,提供了额外的证据,表明嗜酸性粒细胞凋亡可能在解决哮喘嗜酸性粒细胞性气道炎症中具有重要作用。
C.J.A.邓肯and A. Lawrie contributed equally to this work.
嗜酸性粒细胞的不适当积累和随后释放的强效介质,包括细胞毒性颗粒蛋白、脂质介质、细胞因子和趋化因子,被认为是哮喘发病机制下气道炎症的重要因素1.细胞凋亡(程序性细胞死亡)是有效免疫系统的基础2对分辨炎症至关重要。细胞迅速吞噬整体或作为由完整膜结合的片段,防止相邻组织暴露于其细胞内含量。一种不断发展的假设,即过敏性疾病和哮喘的嗜酸性粒细胞的组织载荷与凋亡过程中的抑制或缺陷相关的研究得到了研究,其研究提供了培养诱导诱导的证据表明嗜酸性梭菌的嗜酸性粒细胞清除在哮喘中具有临床相关性3.-5..因此,这可以表示新的治疗干预的合理目标。
使用雾化高渗盐水检查诱导的痰是一种在哮喘中评估气道炎症的无效的非侵略性程序5.-8..然而,迄今为止已经利用了这种技术的研究,可以比较嗜酸性粒细胞凋亡或诱导痰中生存之间的关系,疾病严重程度的临床和功能参数5.-10..作者假设有嗜酸性粒细胞凋亡的降低与哮喘表型的全局临床严重性评分和分离组分之间存在关系。目前研究的目的是评估来自临床稳定的哮喘个体的诱导痰样品中的嗜酸性粒细胞凋亡,以研究嗜酸性粒细胞凋亡和临床严重程度,气道阻塞和症状分数之间的关系。
方法
研究科目
从Aberdeen Royal医务室的呼吸门诊部随机招募了48名具有临床稳定的哮喘的临床稳定哮喘。健康的对策(N = 21),20-56岁,呼吸门诊部的工作人员招募。没有关于研究开始前的气道炎症参数的信息可用于患者或对照受试者。根据美国胸部社会标准鉴定哮喘的诊断11..所有受试者都接受了可逆性测试至200μg的沙丁胺醇。所有哮喘患者在一秒钟内定义为强制呼气量的逆转度(FEV1)> 15%预测沙丁酰胺醇。如果在研究前一月内患有呼吸道感染,则被排除在研究之外。如果在前一个月或濒临困境中,哮喘受试者也被排除在外,或者濒临困境1pred <50%。所有哮喘受试者都在继续正常维护药物,包括吸入的皮质类固醇(IC),并且在研究前一月内没有受试者接受口服皮质类固醇或抗生素治疗。哮喘受试者没有其他呼吸系统疾病的临床或放射性证据。夹杂物前,所有受试者均为≥1YR≥1次。所有受试者都提供了书面知情同意书,格拉姆卫生委员会的联合伦理委员会批准了这项研究。所有受试者的捕杀特征如表1所示⇓.受哮喘严重哮喘(AAS 4-5)的受试者的中位年龄和持续时间明显高于温和(AAs 1-2)和中度(AAS 3)疾病。轻度,中度和严重的群体IC剂量之间没有显着差异。
学习规划
使用了Singlecentre横切观察研究设计。所有受试者都参加了初步临床评估,评估症状。哮喘持续时间,目前药物和吸烟历史的细节从患者访谈和临床票据记录,计算AAS评分,并且对外周血嗜酸性粒细胞计数和特异性免疫球蛋白(IG)E水平进行了静脉血针。随后是在2周内进行恢复访问,肌肉测定和痰液诱导。
方法
在初步访问咳嗽的症状,喘息,呼吸困难,胸闷和痰液产生,患者完成了经过验证的圣乔治呼吸问卷的第1部分,评估去年的症状频率12..对每个响应的加权分数并将最终得分计算为可能得分总分数的百分比。使用验证的AAS分数评估临床严重程度,如前所述13..此外,为外周血嗜酸性粒细胞计数(Advia®20血液系统;拜耳诊断,NY,USA)和Atopate评估服用15毫升血液。通过特异性IgE抗体的存在定义了特征状态(≥0.35u·l-1)通过分解代谢基因活化剂蛋白方法(Pharmaciaupjohn,乌普萨拉,瑞典)来至少一种常见的吸入过敏原14..在随后的访问中,使用电子肺仪(Compact II; Vitalograph,Buckinghamshire,UK)进行肺活量测量。在给予200μg的沙丁酰胺醇后,评估对支气管扩张剂的反应15分钟通过一个MeteredDose吸入器。根据p的方法进行痰诱导在等等。15.使用超声波雾化器(Sonix 2000; Medix,Lutterworth,UK)。简而言之,使用施用5ml高渗(3%)盐溶液进行痰液诱导通过雾化器在总持续时间为30分钟的雾化器。浓度以10分钟为3-5%的增量增加1%。在仔细漂洗口腔和喉咙后,在整个程序中随时促使受试者咳出痰。FEV.1每5分钟测量每5分钟,如果fev,则停止该程序1倒塌了<20%的濒临困境价值或发生麻烦的症状。尽快将痰液样品转移到冰上,在1小时内所有情况下。如前所述进行痰液处理16..简而言之,使用四个体积的0.1%二硫代酚(Sputalysin; Calbiochemnovabiochemucchem,Ltd,Nottingham,英国),从唾液中选择痰,称重和分散。在室温下温和摇动15分钟后,通过48μm纱布过滤悬浮液。鳞状细胞污染(%),总细胞计数和总嗜酸性粒细胞计数(105. mL) were obtained using a Neubauer haemocytometer (Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough, UK) and cell viability was assessed using the trypan blue exclusion method. The cell suspension was adjusted to 1×106.细胞·ml.-1使用Shandon Cytocentrifuge(Shandon Southern Instruments,Szwickley,Pa,USA),使用100μM的细胞悬浮液在每分钟450次旋转的每分钟的旋转旋流素5分钟。Cytospins用Kimura和Haematoxylin染色,两位检查员整体计算了400个非正弦细胞。然后平均百分比以给予最终嗜酸性粒细胞计数。此外,在浸出物中计数200个嗜酸性粒细胞,其形态表征为asnormal或凋亡。凋亡嗜酸性粒细胞基于核缩合,核聚集(从Bilobed转移到单溶质核,如前所述的细胞质收缩)分化5..根据先前验证的方法计算凋亡比(AR)5.: 根据上述描述,对用Diffquik(亚甲基蓝色和eosin,Quidiff II; DiaChem,Burscough,UK)染色的另外的细胞源载玻片的代表性样品(n = 31)评估Kimura染色的有效性。使用具有特异性单克隆抗体的细胞源与EG2(Pharmacia,乌普萨拉,瑞典)的胞嘧啶免疫染色的激活的嗜酸性粒细胞数与阳性对照(用粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子激活的隔热孵育激活的分离的外周血嗜酸性粒细胞)和合适的同位素的阴性对照.使用碱性磷酸酶抗超金属磷酸酶(APAPP)方法可视化阳性染色。通过对受试者的临床特征蒙蔽的调查人员对编码细胞源进行所有计数。
分析
为人口统计和痰数据获得了描述性统计数据。使用用于非参数数据的Mannwhitney U-Test和参数数据的独立未配对T检验来检查组之间的差异。通过AAS分数将哮喘受试者分为三组,以分析人口统计和痰数据之间的差异(AAS分数1-2(温和),AAS得分3(中等),AAS得分4-5(严重)。哮喘受试者还分为高剂量IC(依赖塞米松二丙酸盐≥1000μg,浸润二丙酸酯≥1000μg或氟代酮≥500μg)和低剂量ICS组,以评估Daily ICS药物对分析的影响。Spearman Rankcorlelation系数(R.S.)和皮尔逊相关系数(R.计算用于分别评估非参数和参数数据之间的相关性。Kendall相关系数(τ)用于评估与序数AAS分数的相关性。Kimura染色的有效性表示为近似差异的脑内相关系数(ICC)。所有数据都表示为平均值±SEM.或中位数(四分位数范围),在适当的地方使用95%置信区间和p‐值。p‐值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
痰液诱导和加工
共有41名(85%)哮喘受试者和17例(81%)对照产生令人满意的痰样品(表1⇑).Thekimura染色技术导致绿色嗜酸性粒细胞细胞质和蓝色核染色,并且毫无困难地鉴定了正常的Andapofotoot嗜酸性粒细胞(图1A和B.⇓).Kimura和Diffquik之间的计数达成符合百分比痰嗜酸性粒细胞和Ar(ICC = 0.86,0.88)。由于来自对照受试者的痰中的低细胞数,确定了可用的细胞数。痰数据总结在表2中⇓.中位数百分比痰嗜酸性粒细胞,总嗜酸性粒细胞计数·mL-1哮喘组EG2+嗜酸性粒细胞百分比显著高于对照组(p<0.0001),哮喘组AR均值显著低于对照组(p<0.0001)。轻度哮喘组中位痰嗜酸性粒细胞百分比较低,AR均值高于中度(p<0.05, p<0.05)和重度(p<0.0005, p<0.005)组。轻度哮喘组中位总嗜酸性粒细胞计数·mL显著降低-1比严重的哮喘组(P <0.05)。嗜酸性粒细胞参数在高(n = 32)和低(n = 9)剂量ICS疗法之间相似。百分比痰嗜酸性粒细胞(7.4%差异,P = 0.47),Ar(0.15差异,p = 0.19)或外周血嗜酸性粒细胞(0.33差异,p = 0.26)在组之间显着差异。
协会
哮喘率痰中嗜酸性嗜酸性粒细胞与症状分数正相关(R.S.= 0.72,p <0.0001),AAS得分(τ= 0.58,p <0.0001)和年龄(R.S.=0.54, p<0.001),与基线FEV呈负相关1(R.S.= -0.46,p <0.005)(图2⇓).哮喘患者AR与症状评分呈负相关(R.S.= -0.75,p <0.0001),AAS分数(τ= -0.57,p <0.0001)和年龄(R.S.= -0.56,p <0.001),与基线fev呈正相关1(R.S.= 0.51,p <0.001)(图3⇓).在EG2表达和基线FEV之间没有观察到任何关系1(R.S.= 0.08,p = 0.63),症状分数(R.S.= 0.24;p = 0.12)或AAS分数(τ= 0.05,p = 0.67)。外周血嗜酸性粒细胞与AR与AR相反,与痰嗜酸性粒细胞百分比呈正相关(R.S.=−0.57,p < 0.001;R.S.= 0.61,P <0.0001)。外周血嗜酸性粒细胞计数和基线FEV也存在相关性1(R.= -0.39,p = 0.03),AAS得分(τ= 0.33,p = 0.008)和症状分数(R.S.= 0.57,p = 0.0002)。ICS剂量和AR之间没有显着关联,痰嗜酸性嗜酸性粒细胞或外周血嗜酸性粒细胞(R.S.= -0.1,p = 0.48;R.S.= 0.1,p = 0.54;R.= 0.24,p = 0.16)。
讨论
本研究表明,在临床上病情稳定的患者中,嗜酸性粒细胞凋亡减少和痰嗜酸性粒细胞增多均与哮喘严重程度(由Aas评分确定)显著相关。此外,本研究表明,嗜酸性细胞凋亡的减少和痰嗜酸性细胞负荷与年龄、自述症状的程度和FEV显著相关1这些患者的限制。
从气道组织中移除嗜酸性粒细胞被认为是通过紧张的细胞凋亡或细胞死亡机制的死亡,然后通过巨噬细胞进行识别和吞噬作用17.或驻留的支气管上皮细胞18..因此,已经提出了具有相当大的兴趣,已经提出了参与嗜酸性粒细胞清除和延迟嗜酸性粒细胞凋亡的因素,为哮喘肺中嗜酸性粒细胞的组织负荷增加了显着贡献19..最近提出了腔腔进入气道作为嗜酸性粒细胞清除的机制20..然而,可以设想作为嗜酸性粒细胞处理的唯一机制的腔入口,因为凋亡,如果凋亡嗜酸性粒细胞会丧失膜完整性,如果没有从肺部清除。去除嗜酸性粒细胞渗透通过细胞凋亡和伴随的吞噬作用具有显着性哮喘炎症的可能性具有相当大的潜力3.那5..
虽然许多研究已经研究了哮喘受试者诱导痰中的嗜酸性粒细胞凋亡,但这是研究慢性稳定哮喘患者痰嗜酸性粒细胞凋亡和肺功能的措施与肺功能,临床症状评分和全球哮喘严重程度评分之间的第一份报告。目前研究中的研究结果与嗜酸性粒细胞与FEV相关联1与J的研究一致ang等等。7.研究急性严重哮喘患者嗜酸性粒细胞凋亡和气道阻塞之间的关系,其中BCL-2表达(降低嗜酸性粒细胞凋亡的标志物)与FEV相反1:强制致力的能力。另外,v伊格兰等等。4.证明,来自哮喘受试者的支气管活组织检查中的凋亡嗜酸性粒细胞的比例与AAS分数相反。与目前的研究结果一起,这些数据表明肺中凋亡嗜酸性粒细胞比例与哮喘表型(气流梗阻和症状)的全球严重程度和单独组分的哮喘之间的关系进一步表明嗜酸性粒细胞凋亡在哮喘中的气道嗜酸性粒细胞的分辨率可能是重要的。此外,woolley.等等。5.阐明了痰液嗜酸性粒细胞AR的增加,并在皮质类固醇治疗诱导哮喘加剧患者后痰嗜酸性粒细胞数减少。因此,延迟嗜酸性粒细胞凋亡可能是哮喘中嗜酸性粒细胞组织载量增加的重要原因9.那10..然而,GIBSON.etal。8.调查单一高剂量吸入的蛋白质的抗炎作用报道,治疗后的痰嗜酸性粒细胞百分比的随后降低不伴随凋亡嗜酸性粒细胞比例的增加。本研究与以前研究结果之间的差异的原因尚不清楚,但强调其他因素在确定气道中的嗜酸性粒细胞载荷,包括在骨髓中增强嗜酸性粒细胞产生,它们增加进入循环的释放,然后选择性积聚,然后选择性积累增强了气道的生存3.那21..
目前研究中的ICS剂量和嗜酸性炎炎症参数没有关联,特别是嗜酸性粒细胞:凋亡。这可以解释:由AAS分数分类的受试者的ICS剂量与温和,中等和严重的受试者之间没有显着差异,因为即使那些分类为轻度的人也接受高IC剂量。因此,作者不能排除ICS治疗对这些患者中炎症参数的影响。痰嗜酸性粒细胞是本研究大多数患者的一个特征,是其他群体报告的发现。例如,wardlaw.等等。22.据报道,在99名患者的研究中百分比痰嗜酸性粒细胞的各种变化,在几种患有ICS药物治疗药物治疗药物治疗药物的几个患者中观察到高百分比的嗜酸性粒细胞,以及患有急性严重哮喘的医院的哮喘。此外,L.ouis.等等。23.研究了74例哮喘和22例对照受试者的诱导痰,疾病严重程度根据哮喘(吉纳)指南的全球倡议进行分类。哮喘严重程度与痰嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白水平相关。尽管用高剂量的IC治疗,但嗜酸性炎症是突出的。作者得出结论,尽管用ICS治疗,持续性哮喘的严重程度与气道炎症有关。这些发现对应于目前研究的数据,表明哮喘患者中痰嗜酸性粒细胞症各大变化,痰嗜酸性粒细胞症可以是患者治疗IC的患者的特征。尽管用IC治疗痰液嗜酸孢菌菌持续存在的可能机制包括疾病或过度活跃的炎症1, ICS难以进入或难以进入的小气道存在炎症24.,糖皮质激素抵抗或降低的糖皮质激素受体结合亲和力25.,吸入技术不良或不合规26.,或无法识别的加重因子,例如鼻息蛋白27..这表明测量痰嗜酸性粒细胞可以提供有用的疾病监测信息。
本研究发现,重度哮喘组的中位年龄和病程大于中度和轻度哮喘组(表1)⇑).所有群体中发病和性别的年龄相似,表明群体之间的主要区别是疾病的年龄和持续时间。年龄与Ar和痰嗜酸性粒细胞相关,这表明气道炎症程度可能与受试者年龄有关。的确,十B.林可等等。26.,研究慢性严重哮喘的132项受试者,表明年龄较大,哮喘持续时间较长,持续的气道阻塞和痰嗜酸性粒细胞率强烈相关。多元逻辑回归分析表明,只有痰嗜酸性粒细胞与持续气流限制有关。作者的结论是,“嗜酸性气道炎症有助于严重哮喘的持续气流限制”26..然而,最近的一项研究证明了气道炎症和肺功能之间的关系,疾病患者患有疾病持续时间的哮喘症,虽然持续时间<16年时,这种关系很明显28..为什么较长持续时间的严重哮喘似乎与痰嗜酸性粒细胞有关,但持续时间的温和Nonics治疗的哮喘似乎不成为,是一个有趣的问题。这种明显的悖论可能的解释可能是嗜酸性炎症的持续性可能导致严重疾病的发展尽管用IC处理,但其他因素,特别是气道重塑29.和自主功能障碍27.在肺功能的病理生理劣化中是重要的,该肺功能与哮喘持续时间更长30..
该研究利用了痰染色素的Kimura染色,以通过光学嗜酸性粒细胞的光学显微镜测定细胞凋亡。使用Kimura染色作为悬浮液中凋亡嗜酸性粒细胞的存在的量度是验证和敏感的技术31.目前的研究表明,Kimura与Diffquik相当,用于评估嗜酸性乳溶素的嗜酸性粒细胞形态。
总之,本研究表明,痰嗜酸性粒细胞凋亡与慢性稳定哮喘的临床严重程度,慢性稳定哮喘测量,在一秒钟内强制呼气量,症状症状分数。本研究提供了额外的体内嗜酸性粒细胞凋亡可能在哮喘炎症的分辨率中发挥重要作用。
- 已收到2002年11月28日。
- 公认2003年4月8日。
- ©ers Journals Ltd