文摘gydF4y2Ba
本研究的目的是探讨端粒酶活性的诊断疗效歧视的恶性和良性胸腔积液。gydF4y2Ba
胸膜腔积液收集从109年连续患者的诊断与细胞学或组织学检查证实。细胞学样本归类为恶性(n = 63)和良性(n = 46)。端粒酶活性测定与聚合酶链反应测定端粒重复扩增协议。gydF4y2Ba
端粒酶活性检测在52个(82.5%)和9(19.6%)样本的恶性和良性组,分别,这是一个重要的区别。细胞学检查的敏感率结合端粒酶活性(92.1%)显著高于细胞学检查(53.9%)。端粒酶活性的敏感性和特异性分别为80.4%和82.5,分别。诊断准确性的端粒酶活性为81.6%。gydF4y2Ba
端粒酶是一种高度敏感的诊断恶性肿瘤生物标志物,可能用作辅助细胞学结果确定恶性胸腔积液。gydF4y2Ba
这项研究得到了医学院的研究基金,安卡拉,土耳其Hacettepe大学(项目号1-01-02.101.021)。gydF4y2Ba
胸膜腔积液原因不明的频繁,经常在临床实践中创建一个两难境地。虽然诊断与微创胸腔镜收益率可以达到87%程序、胸膜腔积液的诊断可以建立在33 - 72%的患者常规诊断方法gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。大量的程序,包括免疫细胞化学、染色体分析、组织培养技术,脱氧核糖核酸(DNA)流或图像血细胞计数,和细胞成像结合免疫细胞化学提出了胸膜腔积液的鉴别诊断提高细胞学检查的敏感性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。尽管有这些先进的诊断方法,明确诊断胸膜积液可能仍然是困难的。此外,胸膜腔积液的性质是特别重要的在肺癌患者和需要澄清的,作为一个恶性胸腔积液共存意味着一个高级阶段,这就排除了可能的手术切除gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
端粒是专业结构在真核细胞染色体的两端提供基因组稳定性和允许完整的复制。他们缩短每次细胞分裂,导致细胞衰老,他们限制细胞的繁殖能力,这被认为是细胞的“生物钟”。端粒酶是一种核糖核蛋白,补偿,即损失通过合成端粒DNA和被认为是恶性肿瘤的发展起着重要的作用gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。端粒酶表达在多种人类肿瘤细胞系中被永久地传颂gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。此外,端粒酶活性的测定已被认为是一个潜在的癌症生物标志物的检测在体腔液gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。这个研究来确定使用oftelomerase表达式在诊断恶性胸腔积液的结果进行了比较与细胞学检查。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
病人和胸腔积液样本gydF4y2Ba
胸膜液体样本收集从109年连续病人诊断或治疗胸腔穿刺术Ibn-i新浪安卡拉大学医院,安卡拉Kirikkale大学医院,Kirikkale,土耳其,2001年1月至2002年3月。病人包括69名40岁男性和女性的平均年龄为54.0±12.6年(范围17 - 77岁)。诊断与细胞学或组织学检查证实。细胞学样本分为恶性或良性。所有患者的平均随访13个月(范围7-22个月)。gydF4y2Ba
恶性组包括63例恶性胸腔积液患者。病人包括36个男性和27岁的女性平均年龄为56.1±12.0年(范围17 - 72岁)。确诊证实等侵入性程序关闭或胸腔镜胸膜活检的病人缺乏明确的细胞学诊断。最常见的组织学诊断恶性间皮瘤在20例(31.7%)患者中,紧随其后的是肺癌患者18例(28.5%),10例(15.8%)转移性乳腺癌患者,转移性卵巢癌患者10例(15.8%),三个转移性胰腺癌患者(4.7%)和两个恶性淋巴瘤患者(3.1%)。18的肺癌患者,16 nonsmall-cell肺癌(NSCLC)和两人小细胞肺癌(SCLC)(表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
良性组由46个良性胸腔积液患者。病人包括33名男性和13名女性平均年龄为51.0±12.9年(范围26 - 77岁)。诊断是临床和放射学特征的基础上,对治疗的反应和胸膜液细胞学检查。此外,诊断确诊患者24关闭或胸腔镜胸膜活检和开胸。没有一个病人或先前的癌症疾病共存,没有发达的恶性肿瘤在随访期间。确诊是parapneumonic积脓症19例(41.3%)患者,11例(23.9%)患者的充血性心力衰竭,创伤后积液在5例(10.8%)患者中,5例(10.8%)患者的肺结核,急性胰腺炎在四个(8.6%)病人和肾病综合症在两个(4.3%)病人。gydF4y2Ba
端粒酶活性测定gydF4y2Ba
端粒酶活性测定和聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增协议(陷阱)测定。在这个引物延伸分析端粒酶综合了端粒重复到寡核苷酸引物和扩展产品然后作为PCR扩增的模板gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
胸腔积液样本被运送到了集合的实验室在3 h。离心后1400×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,悬浮细胞分离与冰冷的10毫米洗两次磷酸盐(pH值7.4)。细胞颗粒(100µL)处理200µL冰冷的家伙(3》{高chlomidopropyl区域[3]-dimethyl-ammonio} 1必经propanesulfonate)应承担的裂解缓冲包括0.5%的皮套裤,MgCl 1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Baβ5毫米高巯基乙醇在1毫米EGTA(乙二醇双(β检测氨乙基醚)应承担的N, N, N ', N '必经四乙酸),0.1毫米AEBSF(4量高氨乙基区域[2]-benzenesulfonyl氟化物hydrochlorine), 10毫米Tris-HCl (pH值7.5)和10%的甘油。样本被保存在冰在13000×30分钟,然后离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。上层清液仔细被移除,布拉德福德的蛋白浓度测定方法gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。浮在表面的样品被稀释3µg·μL蛋白质的浓度gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba裂解缓冲和储存在−70°C。gydF4y2Ba
金正日pcr陷阱的分析,如前所述gydF4y2Ba等等。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba被用来测量端粒酶活性。两个µL上层清液(3·μLµg蛋白质gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)被添加到包含50µM 43µL反应混合核苷酸,0.1µg TS引物(5′AATCCGTCGAGCAGAGTT应承担的还是3′)和1×陷阱缓冲区(20毫米Tris-HCl (pH值8.3),1.5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba渐变20 63毫米氯化钾,0.005%,1毫米EGTA)。Afterincubation 30分钟在室温(25°C), 5µL放大组合包含0.1µg残雪引物(5′CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA应承担的还是3′)和2 U Tag-DNA聚合酶(美国WI震中麦迪逊)添加到PCR管。端粒酶在33个PCR产品放大周期为30年代在94°C, 50°C 30年代和90年代的72°C在热循环(珀金埃尔默2400;美国珀金埃尔默,诺沃克,CT)与热开始为90年代在90°C。gydF4y2Ba
此后,20µL PCR产品被加载到12%聚丙烯酰胺nondenaturing凝胶电泳和解决的200 V为0.5×120分钟Tris-borate-ethylenediamine四乙酸缓冲。凝胶是沾SYBR绿色我核酸凝胶染色(分子探针,尤金,或者美国)30分钟和形象化。gydF4y2Ba
端粒酶活性的评价gydF4y2Ba
样品展示产品六个碱基对的梯子增量被认为是积极的。extractof 2µL从每个样本处理1µg deoxyribonuclease-free核糖核酸酶(核糖核酸酶)在37°C陷阱试验和样品前60分钟敏感核糖核酸酶治疗被认为是抑制端粒酶活性。海拉细胞被用作积极控制,而皮套裤裂解缓冲被用作-控制(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。端粒酶活性测定和细胞学或组织学检查在蒙蔽的方式独立进行。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
结果分析与卡方测试。细胞学检查的敏感性和端粒酶活性与恶性组McNemar检验法检验。数据被表示为平均数±标准差。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
细胞学检查证实的良性46例(100%)在良性组样品,然而,细胞学检查确诊的恶性本质34(53.9%)样品恶性组(p < 0.0001)。端粒酶活性检测在52个(82.5%)和9(19.6%)样本恶性组与良性组,分别,这是一个显著的差异(p < 0.0001)(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。样品中消极的恶性组端粒酶活性,4人非小细胞肺癌,两人恶性间皮瘤,两个转移性乳腺癌,有转移性卵巢癌,转移性胰腺癌和一个恶性淋巴瘤。样品中积极的良性组端粒酶活性,三个有肺结核,六个积脓症。gydF4y2Ba
29胸膜腔积液的没有一个明确的细胞学诊断恶性组,24例(82.8%)显示积极的端粒酶活性,而细胞学检查是诊断的11个恶性样本6个(54.5%)与恶性组的负端粒酶活性(p = 0.002)。细胞学检查的敏感性和特异性率分别为100%和53.9,尽管这些为端粒酶活动率分别为80.4%和82.5,分别。诊断产量达到58例(92.1%)患者恶性组的细胞学检查结合端粒酶活性,而恶性组34例(53.9%)患者诊断为细胞学检查,这是一个显著的差异(p < 0.0001)。端粒酶阳性预测值为0.85和0.77的负面预测价值。细胞学检查诊断精度和端粒酶活性分别为81.6%和73.4,分别为(表2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
胸腔穿刺术可能第一和最有效的诊断过程的诊断原发性或转移性胸膜恶性胸腔积液。它也可能提供一些减轻肺妥协的限制性积液的效果。胸膜腔积液的诊断方法应用细胞计数与微分细胞学,直接考试和文化对细菌,真菌,抗酸的杆菌,乳酸脱氢酶和蛋白质与流体血清比率和葡萄糖含量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然而,准确的诊断pre-assumptive恶性积液有时可能会与这些传统的方法是困难的。gydF4y2Ba
细胞学诊断可能是建立在53%的患者一个胸腔穿刺术,与两个thoracenteses 64%, 69%有三个thoracenteses可能达到72%有四个或更多的独立样本gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。同样,目前的数据表明,明确的细胞学诊断的速度从单一样本在恶性胸腔积液是54%。相反,有些恶性肿瘤,如何杰金氏病,表现出较小的诊断细胞学(23%),而细胞学诊断产量范围63 - 73%的肺癌、转移性乳腺癌和卵巢癌gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。尽管总体率确定的细胞学诊断为54%在这项研究中,细胞学诊断肺癌的收益率为66%和60%的转移性乳腺癌或卵巢癌,这些研究结果是一致的。gydF4y2Ba
除非诊断明显第一次胸腔穿刺术后,第二个胸腔穿刺术是表示,甚至应该伴随着封闭胸膜活检。然而,胸膜活检并发症的风险大于简单胸腔穿刺术,应该留给更困难的情况下,最初的胸腔穿刺术和细胞学的检查未能得出诊断gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。胸膜活检的诊断产量可能达到81 - 90%,结合细胞学检查,然而,胸膜活检的诊断价值仍不优于细胞学gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。当前数据显示,组合方法的诊断准确率为95%,明显高于单独的细胞学检查(p < 0.0001)或以上的速度。gydF4y2Ba
当两个或两个以上的胸膜液的研究包括封闭胸膜活检失败提供诊断、更多侵入性手术如胸腔镜活检可能是最佳的选择,因为它有一个较低的风险比开胸,诊断收益率为87%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。然而,胸腔镜手术需要全身麻醉和有更大的患病率与一个简单的胸腔穿刺术在这组患者损害心肺功能有限。因此,新的和微创的方法,可能检测开发的“肿瘤生物标志物”应该作为一个替代方法来提高细胞学的敏感性检测在恶性胸腔积液的诊断。gydF4y2Ba
众多的生物标记研究了区分恶性胸腔积液和良性胸腔积液。在这其中,癌胚抗原似乎是最敏感的生物标志物,敏感率25 - 57%不等gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。因此,更可靠的生物标记物,如端粒酶活性的测定,在调查中发现恶性肿瘤在胸膜腔积液gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。端粒酶逆转录酶酶,通过添加hexameric稳定端粒长度(TTAGGG)重复的染色体端粒末端使用自己的核糖核酸(RNA)作为模板和补偿thecontinued侵蚀的端粒gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。检测到端粒酶的表达在不同的人类癌症表明端粒酶可能是细胞不灭的标志,可能表明肿瘤细胞的扩散gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
最近的数据显示积极的端粒酶活性> 85%的各种人类恶性肿瘤的使用陷阱化验,如前所述,金姆gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。此外,端粒酶表达已被证明是一个潜在的诊断体液中生物标志物的体腔,然而,目前的作者意识到只有少数报告研究端粒酶活性与胸膜腔积液gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。这些报告表明,端粒酶活性在恶性胸腔积液的敏感性是91%和67,分别。目前的数据显示一个类似的率为82.5%,介于这个范围和与这些报告是一致的。因此,作者可能会表明,端粒酶表达合理胸腔积液是一种高度敏感的诊断为恶性肿瘤生物标志物。gydF4y2Ba
缺乏端粒酶活性在恶性胸腔积液是17.5%。假阴性结果端粒酶活性可以归因于几个因素,如聚合酶抑制剂(haemoglobine)核糖核酸酶和蛋白酶用于样本gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。此外,端粒酶活性与恶性肿瘤细胞的数量密切相关,和足够数量的细胞,如10000 - 100000应该从30 - 50毫升样品中提取gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。因此,肿瘤细胞的低浓度样品也可能导致消极的端粒酶活性。此外,酶可能在冻融过程中灭活组织提取gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
虽然低的端粒酶活性已被证明在单核炎症细胞和增殖细胞更新的组织(如肠隐窝、皮肤基底细胞、毛囊和子宫内膜细胞),良性的体细胞通常不会显示端粒酶表达gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。同样,积极良性的细胞学标本中端粒酶活性报道∼10%在以前的报告gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。46良性的样本中,共有9个(19.6%)样品,由六个与肺结核积液、积脓症和三本研究表明端粒酶表达。淋巴细胞和白细胞的强烈渗透肺结核积液、积脓症,分别可以解释这些样本的假阳性端粒酶活性gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。然而,端粒酶活性的特异性为80.4%在当前的研究中,这一发现支持该提案,端粒酶是一种可靠的诊断方法在胸腔积液的鉴别诊断。gydF4y2Ba
作为定量分析的常规圈闭分析是不够的,需要post-PCR操纵,如聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶联免疫吸附试验,这是费力而耗时的。新技术需要准确量化的端粒酶活性在大规模样本在很短的时间内。在实时定量(RTQ)应承担的陷阱的方法,PCR反应和数据分析同时进行。这使得端粒酶活性测定不仅简单快捷,也消除了遗留污染gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。需要精确量化的端粒酶活性anti-telomerase疗法的发展未来。gydF4y2Ba
总之,端粒酶的表达是一个高度敏感的恶性胸腔积液的诊断方法。诊断恶性胸腔积液的产量将大幅增加,如果端粒酶活性与细胞学检查用于胸膜恶性肿瘤。应该进行进一步的研究来确定端粒酶表达水平确定的准确量化的参考价值分化的恶性良性胸腔积液。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2003年1月7日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2003年4月24日。gydF4y2Ba
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