文摘gydF4y2Ba
本研究的目的是评估的存在二型分泌磷脂酶A2 (sPLA2-IIA)肺泡空间及其可能作用的破坏表面活性剂在三大鼠急性肺损伤模型。gydF4y2Ba
肺泡滴剂lipopolysaccaride或生活gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba导致显著增加肺部水肿和减少呼吸系统的静态合规alveolar-neutrophil一起涌入与健康控制老鼠。gydF4y2Ba
信使核糖核酸的upregulation sPLA2-IIA肺是显而易见的。这是与表面活性剂退化和减少大:小比例的表面活性剂聚集在bacteria-instilled老鼠。之间的负相关合规和支气管肺泡灌洗液sPLA2-IIA活动。相比之下,在αnaphthylthiourea-induced伤害,无论是alveolar-neutrophil涌入sPLA2-IIA活动也增加了。gydF4y2Ba
额外的实验老鼠接受特定的二型分泌磷脂酶A2抑制剂活动(3 acetamine-1-benzyl-2 ethylindolyl-5氧;丙烷膦酸(LY311727))证明没有改善生理参数尽管生化效应,表明其活动的只有一个多种因素参与肺损伤的病理生理学。gydF4y2Ba
表面活性剂退化已被证明是一个关键的特征的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)导致减少肺合规和氧化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。因此,一些临床试验评价外源性表面活性剂的影响。然而,这种方法的相对无效归因于不足肺泡的外源性表面活性剂和/或抑制/肺泡降解酶的活动gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。沿着这条线,iia分泌磷脂酶A2 (sPLA2-IIA)、肺泡炎症细胞产生的一种酶在急性肺损伤(ALI),曾参与表面活性剂的降解gydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。sPLA2-IIA属于总科的水解的酶gydF4y2Basn-2gydF4y2Baphosphoglycerides脂酰酯键,产生溶血和游离脂肪酸gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。这些酶诱导炎症反应中发挥重要作用gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba合成的脂质介质,如血小板激活因子,白细胞三烯和前列腺素gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。大量的研究表明,sPLA2-IIA参与炎性疾病包括ARDS的发病机理。事实上,临床试验证明sPLA2-IIA活动增加支气管肺泡灌洗(BAL)流体ARDS患者的水平与疾病严重程度呈正相关gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
sPLA2-IIA活动的评估作用的表面活性剂和遵从性障碍的主要价值,抑制以来可能构成一种治疗方法。因此,本研究的目的是评估指标之间的相关性是否可以建立损伤(肺部水肿、动脉氧合、肺力学)和表面活性剂退化阿里的实验模型。此外,评价三种不同大鼠模型的阿里允许评估各自的角色的肺部水肿和肺泡炎症肺遵从性障碍。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
动物gydF4y2Ba
成年男性Sprague-Dawley老鼠(IFFA信条实验室、L 'arbresle、法国)重225 - 250克都是用于实验。老鼠被安置在air-filtered,温度控制单元和被允许免费获取食物和水。gydF4y2Ba
实验程序gydF4y2Ba
三个模型大鼠ALI,前面描述的gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,进行了评估。1)第一个模型包括生活gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在肺泡滴注法gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。在这些实验中,使用低细菌培养液,导致没有死亡。然而,alveolar-neutrophil涌入显然与肺部水肿。2)第二个模型包括lipopolysaccaride((有限合伙人)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Baendotoxin055: B5;西格玛化工、L 'lle d 'Abeau Chene、法国)肺泡滴注法gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。剂量灌输induceda类似alveolar-neutrophil涌入之后gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba滴注法,然而,几乎没有明显的严重伤害(没有死亡率,轻度肺部水肿)。3)第三个模型包括腹腔内注射αnaphthylthiourea(安妥;柯达,罗切斯特,纽约,美国;10 mg·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba溶解在二甲亚砜(DMSO))。这种损伤模型的特点是肺的存在水肿对比与alveolar-neutrophil涌入的缺失gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
控件组:1)肺泡盐水滴剂(gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba和有限合伙人车辆);和2)腹腔内注射的DMSO(安妥车辆)。gydF4y2Ba
老鼠牺牲在第六或24小时。肺损伤评估是基于:1)细胞涌入到肺泡空间(BAL)细胞计数;2)肺部水肿(wet-to-dry重量肺(W: D)比例);和3)静态依从性。gydF4y2Ba
在额外的实验中,动物的预处理的具体sPLA2-IIA抑制剂3 acetamine-1-benzyl-2 ethylindolyl-5 oxypropane膦酸(LY311727;美国礼来印第安纳波利斯,)。老鼠服用8 mg·kggydF4y2Ba−1gydF4y2BaLY311727抑制剂或其车辆DMSO腹腔内立即在滴注法gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba。老鼠牺牲在第六或24小时后细菌的挑战。24小时,为集团研究动物收到两个剂量的抑制剂;过一次滴注法和滴剂后第二次注射12 h。gydF4y2Ba
制备细菌培养液gydF4y2Ba
一个nonmucoidgydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba使用应变(血清型11)。当天实验中,细菌被离心机,洗,最后resuspended盐水的浓度2 - 4×10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba细菌·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肺泡的脂多糖或滴注法gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba
肺泡滴剂的细菌培养液或有限合伙人执行如前所述gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。简单地说,在氟烷麻醉,气管被暴露在管理1 mg·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba有限合伙人(量0.5毫升·公斤体重gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或0.5毫升·公斤体重gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在无菌生理盐水的细菌培养液。gydF4y2Ba
确定静态合规gydF4y2Ba
机械通风进行了报道gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,呼吸系统和压力/体积曲线绘制来确定静态合规所描述的罗西gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
动脉血液气体测量gydF4y2Ba
主动脉进行穿刺的时候牺牲和动脉血液气体测量。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
落下帷幕了在这些实验中,与整个肺部,W: D肺比率与基底进行左肺的一部分,和顶端的一部分,左肺切除,在液态氮冷冻和储存在−80°C到使用。左侧支气管夹允许落下帷幕的肺(中、尾叶),使用气管切开术。五4 ml整除37°C,无菌,pyrogen-free, 0.9%生理盐水冲洗通过气管切开术。五个分数是恢复和汇集。细胞的总数统计使用一个标准的血球计。球液离心机在300×gydF4y2BaggydF4y2Ba7分钟。浮在表面的收集和储存在−80°C。gydF4y2Ba
Wet-to-dry肺重量比gydF4y2Ba
刚收获的左肺分离,称重,然后干在40°C 72 h,最后又重。W: D比率计算除以湿干重的重量。gydF4y2Ba
制备大鼠肺匀浆gydF4y2Ba
肺被切除,在液态氮冷冻和储存在−80°C到使用。肺匀浆准备如前所述,然后膜分数被用于测定sPLA2-IIA活动(见下文)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
细菌培养gydF4y2Ba
细菌的浓度是量化描述gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,结果被表示为每克组织菌落或毫升BAL液体。gydF4y2Ba
测量iia分泌磷脂酶A2活性gydF4y2Ba
sPLA2-IIA活动的测量进行了使用荧光测定,已被证明是选择性sPLA2如前所述gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。简而言之,荧光磷脂基质干下氮和悬浮在乙醇浓度为0.2毫米。囊泡是由乙醇混合溶液和缓冲溶液的荧光磷脂含有50 mM Tris-HCl, 100毫米氯化钠,1毫米ethyleneglycol-bis——(β-aminoethylether) - N, N, N′, N′-tetraacetic酸(EGTA) pH值为7.5。然后衬底的解决方案是混合脂肪酸10%免费的,牛血清白蛋白和整除BAL液体和肺膜。的反应与CaCl发起gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在10毫米最终浓度。的荧光测量进行Jobin et Yvon JY3D荧光谱仪(英国Stamnore)配备了氙气灯。来验证是否观察到的活动是由于sPLA2-IIA, BAL液体样本和肺匀浆与sPLA2-IIA preincubated抑制剂LY311727酶试验。gydF4y2Ba
提取和分析iia分泌磷脂酶A2信使核糖核酸的水平gydF4y2Ba
总核糖核酸(RNA)提取肺组织如前所述gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。RNA(10µg·莱恩gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)是由甲醛在1%琼脂糖凝胶电泳方法,然后转移到尼龙膜(英国白金汉Amersham)。全身的老鼠sPLA2-IIA互补脱氧核糖核酸(互补)标签与α- (gydF4y2Ba32gydF4y2BaP)脱氧胞苷三磷酸(ICN生化药剂,奥赛,法国)使用一个随机primer-labelling系统(Amersham)。一夜之间,这些墨迹被杂交在68°C和放射自显影法。屁股被冲洗掉,与鼠标β-actin cDNA rehybridised 65°C作为内部控制。gydF4y2Ba
表面活性剂磷脂脂肪酸释放的定量分析gydF4y2Ba
脂质提取BAL液体,蒸发干燥和磷含量决定如前所述gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。(LA)和大小(SA)骨料分离及其比率计算如前所述gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。提取脂肪酸根据Tsujishita程序修改gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba并与重氮甲烷甲基化。甲基化衍生品通过毛细管柱气相色谱法分离包含Supelcowax 10键合相(直径0.32毫米,30米长(Supelco))在惠普5890系列二气相色谱仪(惠普、伊西转les Moulineaux、法国),检测到质谱(Nermag 10-10C)。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
结果表示为±sem手段。使用非参数方法进行组间比较,即克鲁斯卡尔-沃利斯rank-sign方差分析,Mann-Whitney测试、斯皮尔曼等级相关系数是合适的。统计学意义是定义为p < 0.05。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
大鼠急性肺损伤模型gydF4y2Ba
索引的肺损伤gydF4y2Ba
比较三种模型的阿里(表1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)表明,不同指标的肺损伤发展并行至少从某种程度的这些指标之间的相关性明显(表2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
iia分泌磷脂酶A2活性和表面活性剂磷脂定量gydF4y2Ba
肺泡滴注法有限合伙人或livebacteria导致类似水平的嗜中性粒细胞流入肺泡空间和静态依从性下降。在两次伤,sPLA2-IIA信使核糖核酸(mRNA)是调节肺匀浆(图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),这导致sPLA2-IIA活动平行增加(表1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这是伴随着表面活性剂磷脂含量的显著损失后24 h有限合伙人或细菌滴剂(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。没有重大变化观察内容后6 h滴剂(数据没有显示)。在有限合伙人,bacteria-instilled老鼠,老鼠和健康之间的负相关sPLA2-IIA活动BAL液浓度的增加和减少是明显(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。相比之下,ANTU-induced受伤没有导致alveolar-neutrophil招聘或增加sPLA2-IIA mRNA表达和活动(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba);它还没有导致surfactant-phospholipid退化(数据未显示)。当检查所有组的老鼠,sPLA2-IIA活动和BAL细胞数量呈正相关(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。此外,静态肺匀浆合规与sPLA2-IIA负相关活动(图4 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
气相色谱/质谱分析bacteria-treated BAL流体的老鼠显示游离脂肪酸的含量的增加,与十六烷酸和亚麻酸是主要脂肪酸释放(图。2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。棕榈酸的水平与sPLA2-IIA活动的增加密切相关,表明这种酶的水解有关表面活性剂磷脂在这个模型(数据没有显示)。沿着这条线,与LY311727预处理的动物,一个特定抑制剂sPLA2-IIA活动,减毒的表面活性剂磷脂相关内容和自由脂肪酸浓度的增加(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),引起细菌滴注法。然而,没有任何生理测量的重大修改(甚至细菌培养)在bacterial-instilled老鼠明显,无论他们是否收到了抑制剂(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
接下来作者调查是否表面活性剂磷脂的水解gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba灌输老鼠伴随着改变表面活性剂的拉比SA。LArepresented 103%(94 - 112年,n = 2)和33±6% (n = 4)总聚合物在盐水和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba分别instilledanimals (p < 0.05)。当动物被使用之前LY311727滴注法gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba洛杉矶的百分比是38±13 (n = 3,无意义的不同比例的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba灌输的老鼠没有抑制剂)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
建立了表面活性剂不足的主要原因呼吸衰竭新生儿呼吸窘迫综合征,和表面活性剂transbronchial应用制剂已经成为这种疾病的治疗的黄金标准。然而在ARDS,表面活性剂缺似乎不是主要的重要性;相反,一个广泛的生物化学和生物物理表面活性剂异常导致呼吸衰竭gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。其中包括磷脂和脂肪酸概要文件的变更,降低表面活性剂载脂蛋白的水平,减少内容的大型表面活性剂聚集,抑制表面活性剂功能和泄露的血浆蛋白的抑制炎症介质。在这些因素中,高浓度的sPLA2-IIA表面活性剂可以参与抑制功能gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。作者曾表明sPLA2-IIA主要是合成由肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF) -α控制gydF4y2Ba3gydF4y2Ba期间,参与表面活性剂退化endotoxin-induced阿里因为豚鼠gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。然而,功能增加sPLA2-IIA活动没有评估的后果。因此,三个模型大鼠ALI调查评估是否增加sPLA2-IIA活动是阿里的特征,以及这种活动是否与受伤的参数。gydF4y2Ba
阿里的三个老鼠模型的特点是所示不同程度的肺损伤,显著降低呼吸系统静态合规和显著增加肺部水肿而健康的老鼠。有趣的是,静态合规相关肺部水肿和肺泡细胞计数(表2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。因此与后者发现,IngenitogydF4y2Baet al。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba展示了一个合规的相关性(gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba实验从acid-instilled动物肺片)和细胞浸润。此外,激活白细胞,引起表面活性剂功能障碍gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba表面活性剂的丝氨酸protease-mediated降解蛋白质agydF4y2Ba16gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
增加iia分泌磷脂酶A2活性与肺泡炎症gydF4y2Ba
阿里的三个模型之间的主要区别表明alveolar-neutrophil涌入后才被观察到的有限合伙人,或者细菌滴剂,作为证明gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。作者曾表明,炎症反应发生在有限合伙人和bacteria-instilled肺,至少在TNF-α分泌gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,其局部分泌参与肺泡液体间隙gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。因此,它可以解释这些模型没有显著持久水肿在24小时。相比之下,期间并没有明显的中性粒细胞涌入ANTU-induced受伤。这种差异可以解释缺乏肺泡巨噬细胞活化ANTU-induced受伤期间,可能导致缺乏嗜中性粒细胞趋化因子的分泌。沿着这条线,它最近被证明TNF-α安妥受伤后甚至由肺泡巨噬细胞分泌表达下调gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。此外,肺泡sPLA2-IIA活动水平之间的关系和肺泡细胞数量之间的联系进一步加强激活巨噬细胞和/或招募中性粒细胞gydF4y2Ba19gydF4y2Ba这种酶的分泌。gydF4y2Ba
功能的结果增加iia分泌磷脂酶A2活性gydF4y2Ba
sPLA2-IIA活动功能的贡献减少静态依从性之间的相关性表明了酶活性的增加和减少合规LPS - bacteria-instilled老鼠和表面活性剂恶化的证据。这一发现,加上surfactant-function变更,此前被Vanderzwan所示相同的动物模型gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。目前的结果扩展他们的结果,因为表面活性剂磷脂所示sPLA2-IIA的主要目标。因此,高浓度的棕榈酸,表面活性剂的主要脂肪酸酯化磷脂,被发现在BAL bacteria-instilled老鼠的液体。其他脂肪酸的浓度的增加(亚麻油酸和亚麻酸)也观察到这表明sPLA2-IIA水解不仅表面活性剂磷脂,还细胞膜磷脂。LY311727总局sPLA2-IIA活动的一个特定的抑制剂,显著减少了表面活性剂的水解phospholids无需修改细菌间隙ALI模型(数据未显示)。然而,其他因素可能参与肺损伤自LY311727无法恢复正常的静态合规。沿着这条线,静态合规与肺泡细胞计数,因此其他介质由这些激活细胞分泌的改变可能参与肺力学。与目前的作者发现,FuruegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba最近展示的有利影响sPLA2-IIA抑制剂(s - 5920 / LY315920Na)在肺力学阿里油酸引起的动物模型。从本研究的实验设计的主要区别是,FuruegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba评估损伤参数在第一次发病后6 h油酸管理。gydF4y2Ba
结果还表明,细菌滴注法明显减少拉比SA。然而,政府sPLA2-IIA抑制剂LY311727未能阻止这种减少,这表明表面活性剂磷脂的水解sPLA2-IIA可能不会发挥重要作用比总量中观察到的变化gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba治疗的老鼠。本研究的局限性是没有直接测量表面活性剂水解的功能结果。然而,这两个gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba已gydF4y2Ba研究已经证明,这种水解大大增加表面活性剂的表面张力gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
总之,大鼠ALI模型表明,sPLA2-IIA活动的增加和表面活性剂退化发生在肺泡炎症。这是与静态依从性下降有关。本研究证明了感应sPLA2-IIA及其参与表面活性剂的降解在ARDS动物模型诱导细菌感染。这个模型比之前报道的病理生理学相关性模型用有限合伙人作为阿里的诱导物。gydF4y2Ba
感兴趣的是调查lipopolysaccaride是第一个细菌组件是否参与二型分泌磷脂酶A2的感应。动物用特定的二型分泌磷脂酶A2抑制剂治疗活动一点也没有改善生理参数尽管生化效应,表明其活动(也许表面活性剂退化)只有一个多种因素参与急性肺损伤的病理生理学。因此,进一步的实验的探索是否二型分泌磷脂酶A2活性抑制外源性表面活性剂可以关联到其他治疗。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢h . Arita(赢家研究实验室,大阪,日本)老鼠sPLA2-IIA cDNA的慷慨的礼物。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2002年10月11日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2003年2月4日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba