文摘
氧化应激参与气道炎症性疾病包括哮喘的病理生理学;因此,抗氧化剂可能是哮喘治疗的临床益处。在目前的研究中,所带来的影响N乙酰半胱氨酸在敏感棕色挪威老鼠了。
N乙酰半胱氨酸(3更易·公斤体重−1口服药物)是每天1周之前挑战和各种antigen-induced肺反应进行了研究。
抗原暴露增加脂质过氧化在支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织氧化谷胱甘肽水平2 h后的挑战。肺核转录因子量κB绑定活动增加2 h后应承担的挑战,和BALF肿瘤坏死因子α和诱导一氧化氮合酶表达在肺见顶4 h后的挑战。细胞间粘附分子1和粘蛋白MUC5AC的表达也增加4 h后的挑战。氧化剂的变化状态、转录因子激活和炎症细胞因子和基因表达降低N乙酰半胱氨酸。这硫醇并不影响最直接的支气管痉挛反应抗原,曝露在老鼠但5羟色胺和抑制气道高反应性增强嗜酸性粒细胞数量在BALF中,有意识的老鼠后出现24小时接触抗原气溶胶和伊文思蓝到BALF废除antigen-induced外渗。
这些结果表明,口服N乙酰半胱氨酸对一种抗氧化剂保护作用和减弱肺在实验性哮喘炎症。
s . Blesa m·马塔和a·塞拉诺科技部支持的(马德里,西班牙)和j . Suchankova北大西洋公约组织(比利时布鲁塞尔)。这项研究是来自欧盟和西班牙赠款支持科学技术部(1 fd97 - 1143, saf1999 - 0111和saf2000 - 0144)和研究资助Zambon Group SpA (Bresso、意大利)。
增加临床、流行病学和实验证据表明,过量生产活性氧和氮物种和有缺陷的内源性抗氧化防御机制可能出现哮喘1。因此,抗氧化治疗可能是哮喘治疗的临床益处。
尽管最初用作黏液溶解的,N地理检测乙酰l半胱氨酸(NAC)应承担的硫醇化合物行为直接作为自由基清除剂,减少谷胱甘肽的前体(谷胱甘肽)2。相比之下各炎症性肺部疾病活动报道,南汽在临床哮喘的影响仍不确定3,4但是最近没有评估。实验研究证明的能力NAC抑制各种炎症元素与氧化剂压力和参与哮喘的病理生理学,如核转录因子(NF)高κB肿瘤坏死因子(TNF)高α诱导一氧化氮合酶和细胞粘附分子(间接宾语)5- - - - - -8。此外,氧化应激刺激粘蛋白MUC5AC在航空公司合成,这一过程也被南汽9。最近有报道说,较低剂量的NAC(口服1更易·公斤体重−1·天−1前1周)降低气道高反应性抗原挑战5羟色胺应承担(5公/ HT)和增强嗜酸性粒细胞数量和伊文思蓝溢出在支气管肺泡灌洗液(BALF)引起抗原暴露在挪威布朗积极敏感的老鼠10。
当前工作的目的是进一步探索口头管理NAC的antihyperresponsiveness和抗炎作用,但使用高剂量(3更易·公斤体重−1)为了更好的评估效果5,11扩展研究,检查肺氧化剂状态和NFκB应承担的表达,肿瘤坏死因子α,应承担伊诺,细胞间粘附分子(ICAM) 1和粘蛋白MUC5AC在这个模型的过敏性哮喘。
材料和方法
动物模型和实验小组
男性布朗挪威大鼠(250 - 300 g)由b和k普遍(西班牙巴塞罗那),保持在22°C的环境温度下一个12 h相光/暗周期和美联储A04丸(Panlab,巴塞罗那,西班牙)。饮用水是免费的。试验机构伦理委员会批准的协议是和遵守西班牙和欧洲共同体规定使用实验动物。
动物是积极敏感了12。敏感的动物被随机分成负控制(车辆+生理盐水),积极控制(车辆加抗原),南京(NAC +生理盐水或抗原)治疗组。NAC (Zambon,巴塞罗那,西班牙;3更易·公斤体重−1)蒸馏水被填喂法作为一个单一的每日剂量的口服药物(h)上午9点在7天之前的挑战,最后剂量被给予前1 h的挑战。口头的路线选择像往常一样在临床设置。剂量水平和进度是基于以前的研究5,11。地塞米松(5毫克·公斤体重−1i.p。)给出了一些实验前24小时挑战作为参考。
动物犀牛和仪器测量肺阻力(Rl),概述了以前12。稳定了10分钟后,动物是挑战与吸入卵白蛋白(100 mg·毫升−15分钟)直接测量的支气管收缩的响应和伊文思蓝BALF溢出。在其他的实验中,unanaesthetised老鼠被暴露于卵白蛋白在生理盐水(1%)或盐气溶胶60分钟,24小时后,气道反应性测定,曝露在动物地理从剂量/响应曲线到5 HT(6.25 -100µg·公斤体重−1注射。)。回归直线的斜率之间的峰值Rl和常用对数(日志10)的5 HT应承担的剂量,使用的数据只有6.25,12.5和25µg·公斤体重−1剂量,计算每个实验组13。获得了一组不同的动物,BALF之前和在不同时间后的挑战和微分单元数量总量的测定13,肿瘤坏死因子α水平竞争酶免疫分析法工具包(美国Chemicon国际,泰梅库拉,CA)和脂质过氧化氢过氧化脂质检测设备;开曼化学,安阿伯市,美国MI)。
谷胱甘肽测定肺组织匀浆中使用谷胱甘肽转移酶的方法14的高效液相色谱和氧化谷胱甘肽(GSSG)15。N高Ethylmaleimide thiol-quenching代理,用于有效地防止谷胱甘肽氧化15。GSH / GSSG比率计算的一个索引组织氧化还原状态。
核转录因子的确定还是κB高绑定活动和诱导一氧化氮合酶在细胞间粘附分子1和粘蛋白MUC5AC表达
核蛋白质提取物是从肺组织准备的16。使用布拉德福德蛋白质进行了量化17化验。整除的核提取物与等量的蛋白质(10µg)是按照制造商的指示处理(挖凝胶转变设备;勃林格曼海姆,德国曼海姆和恩佐诊断,Inc .)法明岱尔,纽约,美国),和绑定反应开始,添加30 fmol的双链digoxigenin-labelled NFκB寡核苷酸(有义链序列5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC应承担的还是3′,GGGGACTTTCC被一个κB绑定主题)从Promega有限公司(美国麦迪逊,WI)。样本分析nondenaturating 6%聚丙烯酰胺凝胶。电泳后转移到尼龙膜(Hybond-N +;Amersham淀粉微球生物科技欧洲GmbH,弗莱堡,德国),复合物呈现是使用化学发光检测系统。乐队的强度是量化使用图像分析系统分析®3.0(软成像系统GmbH,明斯特,德国)。为了确定绑定的特异性反应,进行了竞争分析的一个100折(过剩即。3000 fmol)的未标记的寡核苷酸。
整除的上层清液含有胞质蛋白(40µg)加载到10%聚丙烯酰胺凝胶,报钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳。被转移到蛋白质硝化纤维素膜(Protran®美国NH, Schleicher & Schuell基恩),孵化的屏蔽解决方案包含的主要抗体,兔子anti-iNOS多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国;1:1,000稀释)或者β肌动蛋白鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州,美国;1:10,000稀释)。二级抗体(1:5,000稀释),辣根peroxidase-linked驴antirabbit免疫球蛋白G针对伊诺和辣根peroxidase-linked羊antimouse免疫球蛋白G针对β检测肌动蛋白(Amersham淀粉微球生物科技欧洲GmbH)孵化在屏蔽解决方案2 h 22°C。免疫反应性检测和增强化学发光免疫印迹检测系统(Amersham淀粉微球生物科技欧洲GmbH)。电影进行扫描和执行光密度分析。
的ICAM 1和粘蛋白MUC5AC信使核糖核酸(mRNA)成绩单是使用实时定量测量的逆转录酶聚合酶链反应(RT PCR)应承担的。地理ICAM 1、反向转录的RNA产生互补脱氧核糖核酸(互补)使用SYBR进行®绿色RT PCR试剂盒(SYBR®绿色PCR反应混合液;应用生物系统公司、沃灵顿、英国)的制造商,MUC5AC, Taqman®RT试剂(PE生物系统,Morrisville,数控、美国)。的特异性PCR引物测试在正常PCR反应的条件和产品Nusieve电泳为2.5%®GTG®琼脂糖(BioWhittaker分子应用,Inc .)、大利好,美国)凝胶。预期的分子大小的一个乐队是观察地理ICAM 1、MUC5AC和甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)。相对定量基因表达数据得到使用比较阈值周期(Ct)方法(ΔΔCt所描述的方法)作为制造商(PE必经ABI棱镜7700序列检测系统;美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和报告18。ΔΔ进行验证Ct方法,Ct测量值和参考目标基因在不同输入大量的总RNA (25 - 3000 ng),然后,ΔCt值(目标与引用)策划反对日志总RNA和斜率的绝对值是< 0.1(没有显示),表明类似的两个系统的效率。GAPDH被选为内源性基因的控制。使用超净总RNA提取总RNA组织隔离设备(莫生物,索拉纳海滩、钙、美国)。PCR引物对大鼠ICAM 1,应承担MUC5AC、GAPDH使用引物设计的表达(PE生物系统公司)根据出版cDNA序列(表1⇓)。
数据分析
数据意味着±sem。统计分析的结果进行了方差分析其次是适当的事后测试包括Bonferroni调整和未配对t检验。一个p值< 0.05被认为是显著的。
结果
肺氧化剂状态
BALF中脂质氢过氧化物的浓度显著增加2 h抗原后挑战(2.7±0.4 nmol·毫升−1,n = 5;与生理盐水相比p < 0.05)控制(0.8±0.3 nmol·毫升−1,n = 5),这些增强水平减毒NAC治疗动物(1.3±0.3 nmol·毫升−1,n = 5;p < 0.05与积极的控制)。
肺谷胱甘肽水平显示倾向于减少2 h抗原暴露但未能达到意义(图。1⇓)。相比之下,肺GSSG水平显著增加2 h后挑战与控制;这增加了NAC治疗大鼠。谷胱甘肽(GSSG比率,索引组织的氧化还原状态,降低2 h抗原后挑战,这种变化也逆转了南汽。没有显著改变肺谷胱甘肽和GSSG观察24小时后挑战(数据未显示)。
Allergen-induced核因子量κB高绑定活动和诱导一氧化氮合酶在细胞间粘附分子1,应承担的肿瘤坏死因子α和粘蛋白MUC5AC表达
NFκB应承担的DNA检测绑定活动增加2 h后过敏原的挑战,在下降4和24小时后的挑战。南汽初废除NFκB应承担的激活后观察2和4 h抗原挑战(图。2⇓)与地塞米松相似的结果。过敏原接触产生强烈伊诺蛋白质(图。2⇓)和ICAM 1 mRNA(图3所示⇓)信号4 h后的挑战。没有发现地理ICAM 1的表达增加后24 h挑战(数据未显示)。NAC治疗或地塞米松废除antigen-induced伊诺和ICAM 1表达。
两个小时后抗原挑战,BALF中有显著增加肿瘤坏死因子α应承担的浓度,然后拒绝向prechallenge水平(图。4⇓)。NAC治疗抑郁的早期antigen-induced增加的肿瘤坏死因子α,应承担和地塞米松产生类似的效果。
两个小时后的挑战,有轻微增加MUC5AC表达antigen-exposed组治疗动物,观察和双重增加4 h;这种增强的表达被废除与南汽或地塞米松治疗组中(图5所示⇓)。
Antigen-induced支气管痉挛、气道高反应性、嗜酸性粒细胞和外渗
未经处理的动物抗原气溶胶引起的挑战敏感立即上升Rl(151±16%,n = 5)伴随着溢出(伊文思蓝的浓度增加到617±96 ng·毫升−1在saline-challenged老鼠1335±139 ng·毫升−1每组,n = 5;p < 0.05)。NAC治疗没有显著减少antigen-induced支气管狭窄(103±39%,n = 6),但明显抑制外渗(709±54 ng·毫升−1,n = 5;p < 0.05与antigen-challenged)。NAC单独改变既不Rl也不溢出在saline-challenged老鼠也介绍了动脉血压显著变化(数据没有显示)。
高反应性5 HT应承担在antigen-challenged老鼠与控制(图6⇓),而减少了响应能力(即。antihyperresponsiveness效应)是注意到在南汽-和dexamethasone-treated老鼠。没有明显差异的斜坡剂量/响应曲线5 HT组之间(图。6⇓)。NAC本身没有修改航空公司响应自5 HT应承担的剂量/响应曲线获得saline-challenged老鼠之间没有差别对待和未经处理的老鼠(数据未显示)。
Antigen-challenged老鼠显示显著增加BALF细胞的总数在24小时(0.64±0.04×106细胞·毫升−1(n = 8)与0.21±0.02×106细胞·毫升−1生理盐水组(n = 8);p < 0.05)。24小时的细胞总数antigen-challenged老鼠明显减少了NAC (0.41±0.06×106细胞·毫升−1(n = 14)与盐水控制;p < 0.05)或地塞米松治疗(数据未显示)。微分细胞计数显示嗜酸性粒细胞数量的增加以及在其他细胞类型的BALF antigen-challenged老鼠相比saline-exposed动物(图6 b⇑)。嗜酸性粒细胞数目的增加在24小时降低了南汽,而无显著抑制作用是由该代理上剩下的细胞类型,即。中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞。地塞米松显著降低所有细胞类型除了巨噬细胞的数量。增加少量嗜酸性粒细胞数量后发现4 h抗原挑战和倾向于较低的数字观察药物治疗组(图6 c⇑)。总和微分细胞计数观察saline-challenged老鼠与南汽或地塞米松治疗没有获得不同计数saline-challenged未经处理的老鼠(数据未显示)。
讨论
南京是一个硫醇化合物具有抗氧化性能1减少肺损伤产生的氧化压力在不同实验模型和施加有利影响肺部疾病中氧化剂压力出现pathogenetically相关2。在目前的研究中,初步观察与南汽10一直延伸到显示抗氧化,抗炎和antihyperresponsiveness效果的口服治疗NAC(3更易·公斤体重−1·天−1在挑战前1周)的实验模型建立过敏性哮喘12。
过敏原的挑战外围气道过敏性哮喘患者已被证实,立刻大量的活性氧局部嗜酸性粒细胞等炎症细胞释放1。因此,本研究首先对氧化应激的实验证据使用两个不同的标记,实验模型BALF的脂质氢过氧化物水平和肺谷胱甘肽(GSSG比率。两个小时后抗原的挑战,增加脂质过氧化水平,减少谷胱甘肽(GSSG比率,证实氧化应激的存在。谷胱甘肽(GSSG下降率在本研究发现是由于一个显著增加大约1/2 GSSG浓度伴随着倾向于谷胱甘肽水平较低。GSSG的增加和减少谷胱甘肽水平上皮衬里流体早期抗原后挑战哮喘病患者的最近报道19。口服NAC治疗有效地衰减增强脂质过氧化和GSSG水平,扭转谷胱甘肽(GSSG比率下降,证实其抗氧化特性的动物模型。
自氧化应激的存在证明了这个模型的过敏性哮喘、激活大量的炎性元素oxidant-sensitive报道,包括转录因子NFκB20.和肿瘤坏死因子等细胞因子α6,像伊诺基因的表达7,ICAM 18和MUC5AC9被寻求。此外,一种抗氧化剂治疗应该减弱这些激活因素以及有益对实验性哮喘等气道高反应性的典型特征,嗜酸性粒细胞和分泌。
NFκB应承担的慢性炎性疾病被认为是一个关键的转录因子和氧化剂以及其他刺激非常敏感20.。增强激活已经证明了NFκB应承担的哮喘病人的气管和炎症细胞21以及实验性哮喘22,23。NFκB应承担的DNA检测的早期增加绑定活动报道肺核提取物敏感大鼠的挑战22确认这观察扩展表明抗氧化剂NAC抑制NFκB激活哮喘模型。这一发现与先前的报道是一致的在活的有机体内抑制活性的南汽在鼠肺lipopolysaccharide-induced NFκB应承担的激活5和其他实验模型8。南汽的抗氧化特性的本研究的发现可能有助于其对NFκB应承担的激活抑制性影响。或者,NFκB应承担的激活可能导致肿瘤坏死因子α应承担的释放,导致活性氧的生成24和已经发现升高大鼠BALF中敏感早在1 h抗原后的挑战25。
肿瘤坏死因子α应承担的促炎症细胞因子,参与哮喘的发病机制,被认为是一个潜在的治疗目标。在目前的研究中,证实抗原暴露增加肿瘤坏死因子α水平应承担BALF 2 h抗原后的挑战,然后他们拒绝向prechallenge值25。增加肿瘤坏死因子α水平应承担的减毒进入NAC治疗动物,发现谷胱甘肽的一致建议状态调节肿瘤坏死因子α生产在活的有机体内和南汽的抑制增长的肿瘤坏死因子α应承担的各种研究中观察到6,8。
增强伊诺水平检测4 h抗原后挑战敏感大鼠和过敏原接触对基线值24小时后返回。证明NF检测κB绑定显著增加2 h后应承担的挑战,伊诺mRNA前增加22(本研究)和蛋白质表达,支持NFκB应承担的参与在这个过程中,符合NF的存在κB小鼠伊诺结合位点的基因。NAC治疗抑制这个增广进气阀打开表达式在目前的研究中,这一发现与南汽的实际能力是一致的抑制伊诺在其他模型8。
地理地理ICAM 1基因含有NFκB oxidant-sensitive结合位点及其表达式26。气道和内皮细胞ICAM 1的表达增强,肿瘤坏死因子α和其他炎性细胞因子27。因此,各种元素可能有助于增强表达发现在目前的研究中,和南汽的抑制发现与先前的报道是一致的8。
粘液生产过剩往往是观察在哮喘气道炎症,导致气道阻塞。最近的研究表明,氧化应激刺激在气道粘蛋白合成,尤其是MUC5AC的合成9。早期MUC5AC表达增加,之前的嗜酸性粒细胞浸润,证明有过敏性哮喘豚鼠模型28。符合这些结果,增强MUC5AC表达2 h,在没有增加BALF中嗜酸性粒细胞数量还可以,和进一步提高后4 h抗原被发现的挑战。NAC治疗阻塞早期MUC5AC的表达。这些结果证实氧化应激出现重要在气道粘蛋白的过度生产,和抗氧化剂是有效抑制增强粘蛋白基因的表达在实验性哮喘。
间接这些抑制性影响转录因子的抗氧化治疗,炎症细胞因子和基因,应该有实验证据的有利影响NAC过敏性哮喘的特征。南汽未能减少增加Rl在目前的研究抗原后立即产生挑战10。自从antigen-induced支气管收缩主要是带来通过从肥大细胞释放介质的航空公司,这一结果表明,南京不是有效地抑制这一过程,确认的结果在体外研究29日。这也会同意一个重要贡献的氧化剂物种立即支气管收缩的反应抗原。事实上,即使是相对高浓度的过氧化氢生产只有轻微和短暂收缩的孤立的航空公司30.。
相比之下,似乎氧自由基参与血浆外渗引起抗原挑战老鼠,和南汽废除了气道外渗后抗原挑衅。这个结果与最近的报告显示协议能NAC的属性和其他抗氧化剂10,13。
气道高反应性和嗜酸性粒细胞作为后期反应敏感的动物后24 h抗原挑战是建立在文学12,13。NAC是有效降低气道高反应性都5 HT和高架BALF嗜酸性粒细胞数量在目前的研究10。一些证据显示,氧自由基的产生是与气道对过敏原的反应。因此,antigen-induced高反应性被发现关联显著增加氧自由基释放与支气管肺泡灌洗细胞敏感狗30.。oxidant-sensitive转录因子NFκB应承担的出现与嗜酸性粒细胞在过敏性哮喘23。同时,细胞贩运到炎症网站取决于细胞粘附分子的表达顺序由氧化剂调制物种;特别是,ICAM 1对诱导的气道高反应性是重要的在活的有机体内以及嗜酸性粒细胞迁移到肺部发炎27。因此,降低气道高反应性和嗜酸性粒细胞产生的NAC也可能与其抗氧化作用有关。根据这些结果,据报道,抗氧化剂被赋予antihyperresponsiveness肺部炎症和抗炎作用实验模型8,13。
总之,口服N检测乙酰半胱氨酸在积极敏感大鼠抗原暴露之前,哮喘的一种广泛使用的实验模型,导致:1)衰减antigen-induced脂质过氧化反应增强,改变了谷胱甘肽的地位;2)抑制核转录因子检测κB激活,提高肿瘤坏死因子α水平和提高诱导一氧化氮合酶,细胞间粘附分子1和粘蛋白MUC5AC表达遵循过敏原接触;3)显著降低气道高反应性,支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞数量和分泌抗原后的挑战。这些结果证实,氧化应激可能导致哮喘的发病机制。抗氧化剂包括的潜在治疗价值N乙酰半胱氨酸等待控制临床试验的支持。
- 收到了2002年5月14日。
- 接受2002年10月8日。
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