摘要
丙酸氟替卡松(FP)和糠酸莫米松(MF)是一种强效合成皮质激素,广泛用于抗炎治疗呼吸系统疾病。作为评估与它们使用相关的潜在副作用的一部分,它们的活动,不仅在糖皮质激素受体(GR),而且在类固醇核受体家族的其他成员,都进行了比较。
建立了基于细胞的功能系统来测量GR功能的不同方面,以及所有其他类固醇核受体的活性。
MF和FP对GR的影响是强有力的,难以区分的。皮质类固醇在雌激素受体上都没有表现出任何活性,而两者都是雄激素受体的弱拮抗剂。FP是一种相对较弱的孕酮受体激动剂,而MF是一种非常强效的孕酮受体激动剂,其活性浓度与刺激GR(浓度产生50%最大效果(EC))的药物相似50.) = 50点)。此外,FP是矿皮质激素受体的弱拮抗剂(产生50%最大抑制作用的浓度=80 nM), MF表现出强效的部分激动剂活性(EC50.= 3 nM, 30%)。
糠酸莫米松对糖皮质激素受体的特异性比丙酸氟替卡松低得多,显示出对其他核类固醇受体的显著活性。
近几十年来,局部应用合成皮质类固醇药物已成为许多人控制哮喘和变应性鼻炎等慢性炎症的首选药物1.虽然诸如预先建立的药剂如药物和塞洛塞酮的临床疗效,但是许多副作用与长期使用高剂量吸入皮质类固醇有关。这些包括减少骨密度2,增长放缓3.,出现皮肤瘀伤4,白内障的发展5和血糖控制机制的失调6尽管局部给药尽管局部给药,因此来自皮质类固醇的系统性暴露。试图最小化这种副作用的潜力导致开发新一代皮质类固醇药物,这些药物不仅可以增加效力,而且从系统循环中的清除率更快。这种新一代皮质类固醇中的最前沿是氟替辛(FP)7糠酸莫米松(MF)8,9,这些药剂现在被广泛促进用于鼻内和吸入配方以治疗呼吸道的许多炎症障碍10.,11..
皮质类固醇通过糖皮质激素受体(GR)发挥作用12.它属于核类固醇受体家族的一员,该家族包括孕酮受体、雌激素受体、矿皮质激素受体和雄激素受体13..这些受体在结构上密切相关,许多合成配体可以与多个受体结合。在静息条件下,GR存在于含有伴侣蛋白热休克蛋白(hsp)90的胞质复合物中14..配体结合后,受体从hsp90复合体中释放出来,并迅速易位到细胞核中,像其他核受体一样,它通过结合基因启动子内不同的脱氧核糖核酸(DNA)元件来调节基因表达。这些糖皮质激素反应元件(GREs)以不完全回文的形式与受体结合,作为同源二聚体并作为转录因子。然而,近年来研究表明,GR也可以通过与核因子(NF)-κB等其他转录因子的直接相互作用,调控缺乏GRE的启动子的基因表达15.,激活蛋白(AP)-116.STAT家族的信号传感器和转录激活因子17.,18..许多受NF-κB和AP-1调控的基因与炎症反应密切相关,而抑制这些转录因子的活性被认为是皮质激素抗炎功效的主要机制19.,20..
对FP和MF的细胞活性进行比较的尝试始终未能区分出分子11.,21.,22..因此,对这些重要的皮质类固醇的药理学进行了一些基于细胞的功能分析,这些功能分析不仅用于测量GR功能,还用于测量其他相关核类固醇受体的活性。
材料和方法
细胞系
所有亲本细胞系均取自欧洲细胞培养物集。COS-1细胞(猴肾成纤维细胞)和T47D细胞(人乳腺癌)在添加10%胎牛血清(FCS) 0.1 U·mL的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)中培养−1青霉素,0.1μg·ml−1链霉素、2mm谷氨酰胺和非必需氨基酸(1×)。石川细胞(人子宫内膜腺癌)在上述添加的无酚红DMEM中生长。A549(人肺上皮癌)来源的报告细胞系常规维持在上述补充的DMEM中,含0.5 mg·mL−1抗生素G418(基因素)来维持选择压力。
报告基因细胞系的构建
报告基因的结构
小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV-LTR)的长末端重复驱动尼郎荧光素酶报告构建体由PRL-Null veort的HindIII / Bamhi片段(Promega Corp.,Madison,Wi,USA)的三元连接产生含有雷尼霉素荧光素酶基因,最小启动子和衍生自SV40病毒的3'非翻译区,MMTV-LTR的MUNI / HindIII片段含有类固醇响应元素和PCDNA3载体的BamHI / Muni片段(Invitrogen,Groningen,The荷兰)含有新霉素和氨苄青霉素选择标志物,但不是强大的细胞病毒(CMV)启动子元素。
利用NdeI和StyI限制性内切酶从pNF-κB- luc质粒(Stratagene, La Jolla, CA, USA)中获得了含有5个NF-κB共识序列(GGGGACTTTCC)的启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因。然后将其亚克隆到pcDNA3载体上,利用NdeI和XbaI酶切缺失CMV启动子,构建p5NF-κB-firefly-neo。
MMTV分泌的胎盘碱性磷酸酶(SPAP)构建体在整个MMTV-LTR的控制下含有分泌的胎盘碱性磷酸酶基因,是来自D. Wallace(Glaxosmithkline,Stevenage,UK)的善意的礼物。
生成报告细胞系
通过电穿孔(NF-κB报道,25μgDNA,1×10转染A549细胞7每个细胞转染960µF和250 V)或lipofectamine 2000 (MMTV报道;Life Technologies,佩斯利,英国)。通过添加1 mg·mL的抗生素获得稳定转染的细胞−1G418到培养基中,分离得到的克隆,通过环克隆,筛选活性。为每个记者选择并维护一个克隆。
糖皮质激素受体介导的基因转式激活
A549-MMTV-LTR报告细胞以4×10的密度接种到一个白色的96孔板中4每孔培养细胞,并在37°C过夜。类固醇溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,并添加到细胞中,最终DMSO浓度为0.7%。37℃孵育16小时后,取出培养基,将细胞洗入含1mm CaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中2和1 mm mgcl2.根据制造商的协议,使用Firelite Kit(Packard,Pangbourne)检测到雷尼霉菌荧光素酶活性。
糖皮质激素受体介导的核因子-κB活性的转抑制
将A549-NF-κB报告细胞以4×10的密度接种于白色96孔板中4每孔培养细胞,并在37°C过夜。类固醇溶解在DMSO中,并添加到细胞中,最终DMSO浓度为0.7%。1小时后,用0.5 ng·mL刺激细胞−1肿瘤坏死因子-α (R&D Systems, Abingdon, UK)37℃孵育16小时后,去除培养基,将细胞洗入含1mm CaCl的PBS中2和1 mm mgcl2.根据制造商的方案,使用Luclite试剂盒(Packard)检测萤火虫荧光素酶活性。
孕激素受体介导的基因反式激活
据报道,人乳腺癌细胞系T47D在黄体酮反应中上调内源性碱性磷酸酶23..T47D细胞以1×10的密度接种到96孔板中5每孔培养细胞,并在37°C过夜。类固醇溶解于DMSO中,加入细胞(最终DMSO浓度0.7%),37℃孵育24小时。然后用PBS洗涤细胞,用RIPA缓冲液(1% Igepal, 0.5%脱氧胆酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠)裂解细胞。用对硝基苯磷酸盐(1.5 mg·mL)分光光度法(405 nm)测定碱性磷酸酶活性−1)作为底物,溶于1M二乙醇胺,0.28m NaCl和0.5mM氯化镁。
雌激素受体介导的基因转移
据报道,人子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa上调内源性碱性磷酸酶响应雌激素24..该方法与孕酮受体测定的方法相同,不同之处在于将细胞以4×10的密度接种4在没有FCS的情况下用类固醇治疗。为了研究类固醇的抗雌激素作用,在添加5pm雌二醇(该浓度可引起对雌二醇最大反应的80%)前15分钟将皮质类固醇添加到细胞中,并按上述方法进行测定。
矿皮质激素和雄激素受体介导的基因转位激活
根据制造商的协议,用含有含有液体的Repap的报告粒细胞与含有Lipofectamine 2000的人类雄性皮质激素受体或人雄激素受体的表达的质粒,将COS-1细胞的烧瓶。转染后二十四小时,将细胞接种到96孔板中,并在37℃下温育6小时。将类固醇溶解在DMSO中并加入细胞中,得到最终DMSO浓度为0.7%。在37℃温育后,收获培养基,在65℃下热灭活15分钟,并使用对硝基苯基磷酸(1.5mg·mL)测定Spap活性(405nm)−1)作为基材,溶于1M二乙醇胺,0.28m NaCl,0.5mM MgCl2.探讨antimineralocorticoid或长达类固醇的影响,皮质类固醇是添加到细胞的前15分钟1醛固酮或6 nM睾酮(浓度引起80%的最大响应在每种情况下)和试验进行如上所述。
结果
MMTV-LTR包含许多可能被所有类固醇受体刺激的类固醇反应元件。在稳定转染的A549肺上皮细胞中,地塞米松刺激MMTV-LTR报告基因表达增加5.1±0.7倍,浓度产生50%的最大效应(EC50.)(图1a⇓).然而,针对所有其他甾体核受体的甾体配体未能刺激报告基因表达(即。孕酮、雌二醇、醛固酮和睾酮;数据未显示),表明这些细胞中唯一活跃的类固醇受体是GR。新一代皮质类固醇FP和MF,都比地塞米松强两个数量级以上,给EC50.值分别为25和20时(图1a)⇓).尽管MF达到与地塞米松相同的最大响应,但高浓度的FP始终刺激了中等程度的报告基因表达(144±14%,P <0.01)。
接下来,使用稳定转染NF-κB依赖报告基因的A549细胞系,检测皮质激素对促炎转录因子NF-κB活性的抑制能力。刺激0.5 ng·mL−1TNF-α诱导荧光素酶表达增加3.8倍(数据未显示)。这三种皮质激素均能以剂量依赖的方式抑制TNF-α驱动的NF-κB活化,浓度值产生50%的最大抑制作用(IC)50.)的4pm (FP), 10pm (MF)和0.2 nM(地塞米松)。同样,在这些细胞中,其他类固醇受体配体无法抑制NF-κB报告基因的表达(数据未显示)。
评估FP和MF的FP和MF的特异性。为了测量孕酮受体的活性,使用T47D细胞,一种自然过表达孕酮受体的乳腺癌细胞,并随着碱性磷酸酶的细胞表达增加而响应孕激素23..FP刺激T47D细胞中的碱性磷酸酶表达,达到与EC的孕酮的最大反应的80±5%(P <0.01)50.(图2a⇓).MF明显是一种完全激动剂,比FP强一个数量级以上50.50 pm(图2a⇓).相比之下,地塞米松只能刺激碱性磷酸酶的表达浓度为>1µM,而雌二醇、醛固酮和睾酮则无活性(数据未显示)。用孕酮受体/GR拮抗剂RU486预处理细胞,可以逆转孕酮、FP和MF的作用,证明所见的作用是由受体介导的(图2b)⇓).因此,FP和MF都不是纯皮质类固醇,但在孕酮受体有显著的活性。
Ishikawa细胞,子宫内膜癌细胞系,组成型过表达雌激素受体,并随着碱性磷酸酶细胞表达的增加而响应雌激素,而其他类固醇受体(包括地塞米松)的配体是无活性的24..FP和MF不能刺激Ishikawa细胞中的碱性磷酸酶表达(图3A⇓),两种皮质类固醇均不能拮抗雌二醇的作用(图3b)⇓),表明FP和MF都没有与Ishikawa细胞中的雌激素受体具有任何交叉反应性。
COS-1细胞是一种猿成纤维细胞系,当转染含有mmtv - ltr驱动的报告基因的质粒时,对核受体的任何甾体配体均无反应(数据未显示)。然而,如果将表达人GR的质粒和MMTV报告基因一起转染,地塞米松可以用EC刺激报告基因的表达50.与A549细胞(2 nM;数据未显示)。这表明COS-1细胞不含有高水平的11-β羟类固醇脱氢酶活性,而11-β羟类固醇脱氢酶活性可保护矿皮质激素目标组织免受糖皮质激素的激活25..MR激动剂醛固酮能够通过转染GR刺激反应,但只有在高浓度(EC50.400海里;数据未显示)。
在COS-1细胞中,用允许人雄激素受体的表达以及MMTV报告者,雄激素受体配体,睾酮,睾酮,睾酮,睾酮,睾酮,睾酮的细胞瞬时转染。能够用EC刺激报告基因表达50.(图4a⇓).用雄激素受体拮抗剂环丙孕酮预处理细胞可以阻止这种激活(数据未显示)。FP和MF在雄激素受体上表现出很少的激动剂活性,对睾酮的最大反应>均达18%(图4a)⇓).相反,这两种化合物都作为雄激素受体的拮抗剂,尽管这一作用的浓度比它们对GR的影响高出3个数量级(FP和MF分别为1.7µM和70 nM;图4 b⇓).地塞米松在雄激素受体浓度达到1µM时无活性(数据未显示)。
用允许人矿质激素受体和MMTV报告的质粒瞬时转染COS-1细胞。在这些细胞中,矿物质激素受体配体,醛固酮,有效地刺激了EC的报告基因活性增加50.50点。相比之下,FP在浓度高达1µM时无法刺激反应(图5a)⇓).然而,MF诱导矿物质激素受体的部分激活,产生30%的醛固酮与EC的最大反应50.图5a⇓).地塞米松是一种完全激动剂(EC50.而醛固酮、地塞米松和MF的作用均可通过特异性MR拮抗剂螺内酯的预处理而被阻断(数据未显示)。在高浓度时,FP在这些细胞中作为醛固酮拮抗剂,具有IC50.80nm,而MF以与其诱导的MR活性(60%抑制,IC)的浓度(60%抑制,IC)部分阻断醛固酮刺激的反应(60%50.3 nm;无花果。 5b⇓).这表明FP是一种较弱的矿皮质激素受体拮抗剂,而MF是一种相对强效的矿皮质激素受体部分激动剂。
讨论
在这项研究中,作者清楚地证明了MF和FP在基因反转录激活和反转录抑制方面对GR的影响本质上是不可区分的22.,25.- - - - - -27..然而,他们进一步表明MF对GR的特异性明显低于FP。首先,MF作为孕激素受体激动剂的作用比FP强一个数量级以上,使其成为观察到的最有效的孕激素之一。其次,MF是一种相对有效的矿皮质激素受体部分激动剂,而FP是一种效力较低的纯拮抗剂。
据报道与吸入糖皮质激素相关的副作用是由于全身暴露于类固醇,尽管局部给药。FP和MF的药代动力学特征(肺滞留、快速代谢)应能将这些影响降到最低,但尽管药物开发工作广泛开展,仍有证据表明其全身暴露2,28.,29..皮质类固醇在雌激素受体中没有任何活性,虽然既是雄激素受体的拮抗剂一样,但观察到这种效果的浓度均高于生理相关的浓度。FP和MF都是孕酮受体的激动剂。然而,FP的效果相对较弱,使得在给予MMTV报告器(100nm)的90%活化的浓度下,FP显示出可忽略的孕酮样活性(5%)。相反,MF比孕酮受体的FP更多的数量级,使得MF对GR和孕酮受体重叠的影响的浓度响应曲线。因此,在GR处提供与100nm FP相同的响应的100nm MF也显示出在孕酮受体(最大值70%;图4A)的相当大的活性。4A⇑).因此,如果全身暴露足以产生通过GR (例如抑制下丘脑 - 垂体肾上腺轴30.),很有可能MF的孕酮受体也被激活,而FP则不会。孕激素受体的不适当激活可能导致发情周期失调和/或经前紧张症状的恶化。这些影响在有既往病史的妇女中可能更明显或更严重。显然,孕酮受体的过度激活最终会产生避孕效果。MF和FP在GR中具有相同的活性,但在孕激素受体的活性上有非常显著的差异,这应该允许临床研究的设计来确定这些在体外观察结果具有临床意义。
类似的论点可以对矿物皮质激素受体的影响,其中FP用作低效力(80nm)的拮抗剂,而MF表现为矿物质皮质激素受体效力的经典部分激动剂> 10倍高于FP(3 nm)。虽然这些浓度略高于刺激GR的那些,但甚至对矿物质激素受体的小效果也可能导致稳态机制调节电解质平衡的障碍,这可能导致长期皮质类固醇使用或在皮质类固醇戒断之后导致临床表现。
当考虑到新一代吸入皮质激素的潜在副作用时,本研究中提出的数据提出了重要的新问题。显然,如果糖皮质激素受体的活动可以观察到全身效应,那么糠酸莫米松与丙酸氟替卡松相比,使用糠酸莫米松时也更有可能观察到与孕酮和矿皮质激素受体相关的效应。不同的个体或群体可能或多或少地对这些重要的激素系统的变化敏感,而且在长期使用期间,这种影响可能会变得更加显著。为了确定这些发现的重要性,需要进行前瞻性和回顾性临床研究,但在未来,这些考虑可能会影响在任何情况下使用哪种皮质类固醇的决定,以实现对患者最好的可能的安全性。
- 收到了2001年12月5日。
- 接受2002年7月25日。
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