文摘
铍中毒是一种肉芽肿性疾病引起的肺部吸入铍的(是)和由CD4 +辅助(Th) 1的积累记忆t细胞增殖反应的下呼吸道。两个基因标记与对铍中毒的易感性有关:1)人类白细胞抗原(HLA) dp基因的等位基因变异,携带谷氨酸在69位置的β-chain (HLA-DPGlu69)绑定可以直接和现在干扰素(IFN) -γ释放Th1从铍中毒患者t细胞克隆;和2)细胞因子基因肿瘤坏死因子(TNF) -α被证明能增加独立于HLA-DPGlu69铍中毒风险。
为了确定TNF-α释放是由Th1引起t细胞激活的上下文中被刺激HLA-DPGlu69分子,BeSO扩散4刺激血液单核细胞和释放IFN-γTNF-α,咆哮(调节激活正常t细胞表达和分泌)、集落刺激因子、白介素(IL) 4, IL - 6,由BeSO引发、IL - 10、IL - 124刺激血液单核细胞在11铍中毒患者使用一个量化anti-HLA-DP抗体作为探针HLA-DP限制t细胞活化。
而扩散和IFN-γ释放完全废除HLA-DP抑制(抑制与anti-HLA-DP单克隆抗体(mAb): 88±16和77±16%,分别;anti-HLA-DR: 29±38和14±10%,分别),释放TNF-α不是(抑制anti-HLA-DP马伯:8.9±7.8%)。没有其他的细胞因子被发现在显著水平。此外,能够诱导TNF-α生产健康对照组不暴露在缺乏t细胞增殖和IFN-γ生产。
总之,这些数据表明,肿瘤坏死factor-α单核细胞的反应是独立于人类白细胞anitgen-DP beryllium-specific限制t细胞的激活,这是符合发现肿瘤坏死factorA2和人类白细胞anitgen-DPGlu69遗传标记是独立互动提高铍中毒的风险。
这项研究由美国能源部门拨款支持(DoE)授予de - fg02 - 93 er61714和从MIUR拨款99060855594,意大利。
铍中毒是一种慢性肉芽肿性疾病引起的肺部吸入铍的(是)粉尘影响暴露个人的1 - 16%1,2。这种疾病的免疫病理反应是由CD4 + CD45RO +辅助的积累(Th) 1记忆t细胞增殖反应的下呼吸道3- - - - - -5。以前,当前作者表明,等位变异的人类白细胞抗原(HLA) dp分子携带的谷氨酸残基在69年位置HLA-DPβ-chain (HLA-DPGlu69)6- - - - - -8发挥核心作用在疾病发病机理通过直接绑定在缺乏抗原的处理9并通过限制响应的Th1 t细胞克隆来自铍中毒患者10。此外,当前作者表明,肿瘤坏死因子(TNF) A2 TNF-α细胞因子基因的等位基因,在夸张的表达水平铍中毒患者的肺和血液单核细胞反应11,12也与对铍中毒的敏感性和积极与HLA-DPGlu69标记增加铍中毒的风险13。
自从Th1细胞因子干扰素(IFN) -γTNF-α,两hyperexpressed铍中毒患者单核细胞作为回应12,肉芽肿反应中发挥核心作用14,人们可能会质疑TNF-α的表达是具体CD4 t细胞活化的结果还是一个相关但独立的事件,随着遗传协会发现可能建议。
要回答这个问题,血液单核细胞从铍中毒患者t细胞和单核吞噬细胞刺激与被使用一个anti-HLA-DP单克隆抗体(mAb)单独的具体应对金属HLA-DPGlu69-restricted Th1从单核吞噬细胞的CD4 + t细胞。
有趣的是,发现TNFA2一致和HLA-DPGlu69遗传标记是独立互动提高铍中毒的风险,数据表明TNF-α响应的单核吞噬细胞是独立于具体的激活HLA-DP限制t细胞。
方法
研究人群
十一铍中毒患者进入研究后给予知情同意:10个男性和一个女性,所有的白种人,平均年龄45±7岁和就业15±6年的平均时间。研究协议批准的克利夫兰诊所IRB(美国克利夫兰,哦)。控制,五个人健康non-Be-exposed登记:四个男性和一个女性,所有白种人和平均年龄32±3年。
淋巴细胞增殖
外周血单核细胞(PBMCs)从铍中毒患者获得隔绝heparinised全血通过聚蔗糖密度离心Hypaque梯度。PBMCs (2×105细胞·好−1)被培养在96 -平底microtitre板块在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640组织培养基补充2毫米谷酰胺,10%胎牛血清,100 U·毫升−1青霉素,100µg·毫升−1硫酸链霉素的铍(BeSO4[4 h2O]) 10、50和100年µM(所有试剂形成σ有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。Phytohaemoagglutinin (PHA;µg·5毫升−1;σ),白色念珠菌(10µg·毫升−1)被用作积极控制。早期增殖是衡量thrytiated deossiribonucleotide胸苷([3H] TdR)合并。文化,5天后细胞脉冲1µCi [3H]热带病研究和培训特别规划(英国Amersham Amersham国际)和收获到玻璃纤维过滤器18 H后。扩散测定(3由液体闪烁光谱学H]热带病研究和培训特别规划整合。结果表示为一式三份的意思是文化。刺激指数计算的比率平均每分钟计数(cpm),在antigen-stimulated井平均cpm控制井。
为了评估可能的污染和细菌内毒素BeSO的产物4作为抗原,BeSO的解决方案4批处理解决方案的研究是测试中使用鲎变形细胞溶解产物测试(CAPE代码Inc .,伍兹霍尔,妈,美国)。BeSO的股票的解决方案4(0.2米)显示,检测水平的内毒素污染(< 0.03 U·毫升−1的大肠杆菌内毒素,类似于endotoxin-free水)。同样,察觉BeSO内毒素水平显示4工作浓度的RPMI完全培养基。
测量的上层清液中细胞因子
IFN-γ的水平、TNF-α咆哮(激活正常t细胞表达和分泌的调节),集落刺激因子(gm - csf)、白介素(IL) 4, IL - 6,引发,IL - 10、IL - 12在被刺激的文化上层清液PBMCs与商用固相进行评估,two-site酶联免疫吸附测定(CytElisa;美国CytImmune科学,圣地亚哥,CA)。细胞上清液收集后3天(咆哮,gm - csf、il - 4和il - 12)和5天(IFN-γTNF-α,il - 6,引发和il - 10) PBMC文化之前(3H]热带病研究和培训特别规划整合,冻结在−80°C到使用。细胞因子浓度进行评估一式三份,结果表示为一式三份的意思是文化。
单克隆抗体抑制淋巴细胞激活
蛋白质a琼脂糖纯化马伯针对HLA-DR (L243)10HLA-DP (B7/21)10hla dq (L2)10HLA-class我(W6/32)10和19 kDa结核分枝杆菌蛋白(HYT6)15用于增加浓度(10、20到50µg·毫升−1)抑制抗原表达、淋巴细胞增殖和细胞因子的生产(如前所述)5。
HLA打字
HLA-DP和TNFA1 / A2打字是如前所述13。
统计分析
所有的数据都表示为平均数±标准差。组间比较用t。比较频率是使用卡方测试耶茨和Bonferroni在必要时修正。
结果
HLA-DP限制beryllium-stimulated淋巴细胞增殖
所有PBMCs从铍中毒患者(n = 11),携带谷氨酸- 69积极HLA-DP等位基因,显示积极的应对PHA和召回抗原白念珠菌(表1⇓)。其中,九BeSO增生性反应4> 3倍意味着如果如果细胞(表1所示⇓)。在所有细胞anti-HLA-DP特定马伯诱导显著抑制刺激增殖(88±16%)显著大于获得针对HLA-DR马伯(±38%)29日,hla dq(2±2%),一级主要histocompatability复杂(MHC;1±2%),结核分枝杆菌19 kDa-specific蛋白质(0±1%;所有与anti-HLA-DP比较p < 0.05;图1⇓)。
最后,从Be-non-exposed PBMCs健康受试者BeSO没有增殖反应4(数据没有显示)。
HLA-DP限制interferon-γberyllium-stimulated释放单核细胞
PBMCs从所有10个病人测试发布IFN-γPHA和白念珠菌(表1⇑)。刺激IFN-γ释放明显高于控制在9个10例(表1⇑)。这种细胞因子的释放强烈被anti-HLA-DP马伯(77±16%),但不是由其他马伯使用(anti-HLA-DR 14±10%;anti-HLA-DQ 1±2%;anti-class-I 1±1%;反结核分枝杆菌19 kDa-specific蛋白质,0±1%;所有与anti-HLA-DP比较p < 0.05;图1⇑)。
最后,没有一个五健康non-Be-exposed IFN-γ回应BeSO控制释放4(数据没有显示)。
缺乏HLA-DP限制肿瘤坏死factor-αberyllium-stimulated释放单核细胞
PBMCs从所有的九个铍中毒患者在PHA和TNF-α发布的测试白念珠菌(750.1±426.6)。PBMCs从7的受试者评估还发布了TNF-α在回应刺激水平显著高于控制(表1⇑)。然而,在IFN-γ相比,释放TNF-α并不被anti-HLA-DP特定马伯(图。1⇑)。类似于铍中毒患者,PBMCs获得四个五non-Be-exposed健康受试者TNF-α回应BeSO发布4(195.3±76.2 pg·毫升−1,p = 0.02对Be-unstimulated PBMCs (91.9±15.8);p = 0.09对PBMCs铍中毒患者与BeSO刺激4),而anti-HLA二类单克隆抗体对细胞因子释放没有影响(数据没有显示)。
没有显著水平的细胞因子il - 4、il - 6引发,il - 10、il - 12, gm - csf和咆哮刺激文化的上层清液中发现了PBMCs从任何的病人测试,尽管所有的细胞因子被释放在PHA刺激(表1⇑)。最后,当TNF-α释放水平进行分析与运输TNFA2等位基因(TNFA2 / TNFA1或TNFA2 / TNFA2)和那些只携带TNFA1等位基因,没有发现差异在响应(TNFA2-negative, n = 5, 281±90 pg·毫升−1;TNFA2-positive, n = 4, 312±108 pg·毫升−1;p > 0.05),或者PHA (TNFA2-negative 1232±778 pg·毫升−1;TNFA2-positive, 1385±761 pg·毫升−1;p > 0.05)白念珠菌(741±469 pg TNFA2-negative·毫升−1;TNFA2-positive, 633±546 pg·毫升−1;p > 0.05)。
讨论
研究先前由这和其他团体6- - - - - -8HLA-DP-β链表明等位基因变体编码谷氨酸残基的位置69是免疫应答相关基因具有约束力的感应Th1淋巴细胞反应正是铍中毒9- - - - - -11,16,17。此外,与观测一致,TNF-α释放以夸张的利率在铍中毒患者的肺18,当前作者表明,TNF-α基因等位变异TNFA2涉及TNF-α发布的规定19也与对铍中毒的易感性有关,积极互动的HLA-DPGlu69标记测定铍中毒的风险13。
肉芽肿性疾病,如肺结核、麻风结节病,IFN-γ-producing Th1 t细胞主导的疾病免疫反应20.- - - - - -23。扩散和IFN-γ释放的观察新鲜血液单核细胞反应是完全废除的anti-HLA-DP具体马伯表明berylliosis-affected个人Th1反应是系统性的。这一事实HLA-DP谷氨酸69 -积极分子能够直接绑定9,可能表明,表示在这个分子的存在可能本身驱动Th1反应,在动物模型被描述Th1、Th2两极分化的免疫反应是由一个特定的MHC /肽组合24。
TNF-αIFN-y一起,占据主导地位的细胞因子产生的反应是由单核细胞从铍中毒患者。因为TNF-α主要是单核吞噬细胞释放的25,我们有理由质疑细胞因子的生产是由,或独立的Th1 t细胞激活和IFN-γ释放。本文提供的抗体阻断实验清楚地表明,刺激血液单核吞噬细胞能够释放TNF-α独立于HLA-DP限制IFN-γ释放。此外,从non-Be-exposed PBMCs健康受试者的能力释放TNF-α在反应强烈支持这一观点。
最后,当前作者无法证明TNF-α水平之间的相关性被刺激文化和TNFA1 / TNFA2基因型。然而,尽管它已经提议TNF-α释放的控制下一个多态序列有两个等位基因(TNFA1和TNFA2),即TNFA2与更高的PHA十四烷酸/佛波醇acetate-stimulated细胞因子释放19,并不是所有的研究已经证实了这一发现26,27。
细胞功能的数据在这个研究进一步支持这一概念,肿瘤坏死factor-α和人类白细胞antigen-DP基因免疫遗传的铍中毒的独立因素,他们可能发展的相互作用引起的肉芽肿反应铍肺。
确认
作者要感谢g·隆巴迪(部门的免疫学、帝国理工学院科学、技术和医学,伦敦,英国)有用的建议;诉Vezzani (Gaiato意大利摩德纳)寻求帮助在研究的开始和K.M. O ' donnell编辑稿件。
- 收到了2001年11月16日。
- 接受2002年6月12日。
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