文摘
过敏症铍(是)在1 - 16%的暴露工人接受免疫疾病筛查铍使用铍淋巴细胞增殖试验(BeLPT)。然而,只有∼50%的BeLPT-positive工人表现为肺肉芽肿(即。铍中毒)。铍中毒是与人类白细胞抗原(HLA) dp supratypic DPGlu69标志,作者问这个标记是不同的与疾病相关的演讲。
639人口的工人从铍工厂接受BeLPT筛查评估在一个嵌套病例对照研究HLA-DPGlu69的患病率,HLA-DPB1, hla dq和biallelic HLA-DR等位基因和肿瘤坏死因子(TNF); TNF -α多态性;α-;308年23个人呈现“敏感”(即。BeLPT-positive没有肺肉芽肿),在22个“病”(即。BeLPT-positive肺活检的肉芽肿)。
HLA-DPGlu69标记与“疾病”(比值比(或)3.7,p = 0.016, 95%可信区间(CI) 1.4 - -10.0),而高TNF -;α光源TNF -;α-;308 * 2标记与积极BeLPT(或7.8,p < 0.0001, 95% CI 3.2纠正-19.1)没有“敏感”和“疾病”的区别。此外,HLA-DRArg74标记是与“敏感”没有相关疾病(或3.96,p = 0.005, 95% CI 1.5 - -10.1)。
数据显示,肿瘤坏死因子-;α、人类白细胞antigen-DR和人类白细胞antigen-DP标记铍敏化中起着不同的作用和肉芽肿形成beryllium-exposed工人。
这项工作是de - fg02赠款支持93 - er61714和er61714 - 1004058 0000196从美国的能源部门,从MURST拨款99060855594,意大利。
过敏症铍(是)工人暴露于粉尘和烟雾是导致一系列的反应从铍中毒急性肺炎,慢性肉芽肿性疾病主要影响肺部1。
后观察到血液T -;铍中毒患者的细胞增殖反应在体外beryllium-stimulated血液淋巴细胞增殖试验(BeLPT)已经确定是过敏的工人2。筛查项目包括BeLPT和肺transbronchial活检(TBB)显示noncaseating肉芽肿诊断铍中毒,已经有效的早期识别受影响的个人,随着“筛选”识别铍中毒病例显示比确定在温和的疾病临床投诉或胸片发现异常的发现3。在受试者表现出积极的血液BeLPT,只有40 - 60%出现肉芽肿的TBB积极(即。铍中毒)。然而待定的那些负面TBB最终可能发展肺肉芽肿4。
铍中毒风险一直伴随着supratypic的表达人类白细胞抗原(HLA) -DPB1Glu69 (DPGlu69)标记,标记发现被表达在84 - 97%的疾病情况下的三个独立的研究5- - - - - -7,已被证明函数的限制因素是表示具体T -;细胞克隆HLA-DPGlu69-positive铍中毒患者即。作为具体的免疫反应基因T -;细胞铍中毒的反应)8。
疾病表示已与主要组织相容性复合体(MHC)基因位点标记在结节病,类似于铍中毒的肉芽肿性疾病,自发地解决门的腺病与HLA-DR3有关和慢性fibrosing HLA-DR5肺部疾病9。在这种情况下,假设DPGlu69,以及其他MHC标记,可能与疾病相关的演示的是工人。因此,病例对照研究设计包括所有BeLPT-positive受试者识别过程中筛选的铍制造工厂。这个敏感组进一步细分为:1)血液BeLPT-positive, TBB-negative主题或“敏感”小组,2)BeLPT-positive TBB-positive主题或“疾病”子群。
方法
研究人口和病例定义
人口639人从铍制造工厂在美国中西部是入学知情同意后对铍中毒的易感性的基因研究,结合入学为铍疾病监测项目由工厂的医疗部门,其中包括血液BeLPT协议公布后在两个实验室进行4。这个人口被克瑞斯前面描述的等。10。本研究的目的,个人有两个异常BeLPTs两个单独的血液样本被定义为BeLPT-positive或“敏感”、提供医疗评估。铍中毒的诊断是建立在fibreoptic支气管镜的TBB noncaseating肉芽肿。个人用一个异常BeLPT和“敏感”的人拒绝医疗评估并不包括在这项研究。23 BeLPT-positive TBB-negative人识别和定义为“敏感”;他们包括21个男性和两名女性,意味着±sd年龄42±9岁,平均就业14±9年,所有白种人。22 BeLPT-positive TBB-positive人识别和定义为“疾病病例”;他们包括21个男性和一个女性,意味着±sd年龄41±8岁,平均就业15±6年,20白种人和两个非裔美国人。九十三年公开BeLPT-negative个体随机选择从整个Be-LPT-negative工人一个嵌套病例对照研究设计的基础上,因此评估控制;他们包括78名男性和15个女性,意味着±sd年龄44±9岁,平均就业16±11年,88年白种人,两名拉美裔、两个非裔美国人,一个亚洲人。 The sample of the control population was selected on a 1:2 ratio and on the basis of previously published HLA-DP gene association data, in order to assure a sufficient statistical power to the study. The “sensitized” individuals and the “disease cases” were not statistically different from the control group for sex, age, time on the job and race.
基因研究
研究人口评估频率的两个肿瘤坏死因子(TNF);α等位基因(308−biallelic多态性),TNF -;α-;308 * 1和TNF -;α-;308 * 2和HLA二类(HLA-DPB1、HLA-DQB1 HLA-DRB1和HLA-DRB3/4/5)等位基因。
肿瘤坏死因子-α基因多态性分析
biallelic多态性分析(G)启动子的位置308−TNF -;α基因是由聚合酶链反应(PCR)扩增500 ng基因组脱氧核糖核酸(DNA)使用底漆TNF -;α-;308;(CAAACACAGGCCTCAGGACT)和肿瘤坏死因子-;α-;308;B (AGGGAGCGTCTGCTGGCTG)后PCR循环(GeneAmp 9600年,珀金埃尔默公司罗氏分子系统,Branchburg, CT,美国):一个变性周期(95°C 1分钟的暂停在80°C热起动技术),30放大周期(94°C 30年代,55°C 30年代,30年代72°C),一个扩展周期7分钟(72°C)。放大产品的预期的分子量为545碱基对(bp)。十μL PCR产品进行2%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。二十µL探讨了PCR产品使用寡核苷酸探针TNF -; 1 (Biotin-AGGGGCATGGGGACGGG)和肿瘤坏死因子-;2 (Biotin-AGGGGCATGAGGACGGG) nonradiometric DNA杂交酶免疫分析法(DEIA)方法(基于Gen-ETI——; K DEIA,索林,Saluggia,切意大利)。DEIA实验条件如下:PCR产品:20µL PCR产品;每口井的探针浓度:5 ng探测器;杂交条件:1 h在50°C。杂交结果作为光密度值在酶联免疫吸附试验(ELISA)快速读者(基于Sorin)。为了证实杂交结果,TNF - 20 DNA样本测序;α-;308基因分型。短暂,250 ng基因组DNA引物的PCR扩增TNF308AM13 (TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGACCACAGACCTG)和TNF308BB (Biotin-CTTCTGTCTCGGTTTCTTC)使用一个变性周期1分钟(95°C), 35放大周期(1分钟94°C, 54°C 20年代,20年代72°C),一个扩展周期(7分钟72°C)来生成一个250个基点片段。 The PCR product was directly cycle-sequenced with the fluorescein-labelled M13 universal sequencing primer (GTAAAACGACGGCCAGT), (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) (3 pmol) using the Thermo Sequenase fluorescent-labelled primer cycle sequencing kit (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, UK) for 20 PCR cycles (98°C for 30 s, 60°C for 30 s, 72°C for 30 s) in conjunction with the AutoLoad Solid Phase Sequencing Kit (Pharmacia Biotech), following the manufacturer's instructions and analysed on an automated laser fluorescence (ALF) DNA sequencer (Pharmacia Biotech).
人类白细胞antigen-DRB1打字,-DRB3/4/5 -DQB1等位基因
高分辨率输入HLA-DRB1, -DRB3/4/5 -DQB1,要么与sequence-specific引物PCR (PCR-SSP)或基于输入(SBT)使用。首先,进行低分辨率输入的类属特异性的扩增外显子2使用5′和3′特定引物结合通用底漆。根据等位基因群体被识别,高分辨率的输入是由后续PCR-SSP使用额外的引物混合,或基于打字11,12。HLA-DPB1的高分辨率的输入序列类型是用于所有实例13。高分辨率DRB1/3/4/5打字,DQB1和DPB1对所有个体进行研究,除了九高分辨率情况下DRB3/4/5和/或DQB1是不可能由于缺少材料。因为没有亚型差异都位于外显子2 DQB1 * 02只有低分辨率的输入。
HLA二类等位基因的序列输入方法如前所述11- - - - - -13。SBT的二类基因,PCR产品是由外显子2的放大,如果需要,外显子3使用扩增和测序引物的5′和3′末端位于外显子内含子中2或1和2。放大了在最后一卷60µL组成的600 ng DNA, PCR缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值8.3;50 mM氯化钾;1.5毫米MgCl2),5%甘油6µg甲酚红,200µM脱氧核苷三磷酸(核苷酸),20 pmol生物素化的底漆,40 pmol未标记的引物和2.0 U AmpliTaqDNA聚合酶(优秀的公司)。放大DQB1, 1%二甲亚砜(DMSO)添加到PCR反应混合物。进行PCR扩增的基因Amp PCR系统9600(优秀的公司)。PCR概要文件由一个初始变性在94°C(2分钟),10周期10 s在94°C, 1分钟在65°C和最后20周期(DRB1/3/4/5和DQB1)或30个周期(DPB1) 10分钟在94°C, 50年代在61°C和30年代在72°C,紧随其后的是10分钟在72°C。测序反应是基于固相方法使用生物素化的PCR产物的附件streptavidin-coated珠子。测序反应都使用了Autoread测序工具包(Amersham淀粉微球),根据供应商协议。法玛西亚的测序分析了反应混合物ALFexpress DNA测序仪(法玛西亚生物技术)使用6%聚丙烯酰胺/ 7 M尿素凝胶。这种凝胶是运行在1500 V, 60马和25 W在5°C 6 h。手工处理数据的评估后,确定HLA亚型进行HLA-Sequityper软件的使用(法玛西亚生物技术)。
分析人类白细胞antigen-DPB Glu69标记
除了SBT,基因组DNA样本筛查HLA-DPB1 *亚美大陆煤层气有限公司→呕吐多态编码赖氨酸谷氨酸69氨基酸残基设计使用一个简单的杂交试验的敏感性和特异性每个测试可以验证了判别分析已经描述6。
统计分析
HLA在berylliosis-affected二类等位基因和表型分布,直观暴露和健康对照组比较通过单变量分析使用优势比(或)和95%可信区间(CI);概率值与确切概率法计算。为了评估不同MHC的相对强弱对疾病和致敏状态,并确定可能的链接之间失衡HLA-DP HLA-DR标记和TNF -;α基因,Svejgaard描述的统计方法和赖德14是应用。
该方法是基于2乘2测试各种组件的一个小的表。短暂,表型的频率组合的两个遗传因素(DPGlu69, DRArg74和TNF -;α-;308 * 2标记)的病人和控制计算(“基本”表)。这些“基本”数据进行的各种测试,即。2乘2表(“测试”表);为每个测试或计算使用适当的修改的“零”条目的统计学意义或价值确切概率法建立的。因为这种分析涉及多个比较,p -;值修正;特别是,由于协会DPGlu69标记是在本研究之前,没有为这个标记做了修正。相反,p -;值DRArg74和TNF -;α-;308 * 2标记已经纠正了多态性和团体的数量分析。因为没有联系TNF -数据;α-;308多态性之间的连锁不平衡和铍中毒,没有结论性的示范HLA-DP和TNF -;α被发现存在,其他比较更正为6或9,因此建议由Svejgaard和赖德14。
在“测试”表,一系列2乘2比较代表不同层次的遗传标记的数据测试(在)依赖对疾病易感性的贡献(表1⇓独立协会),“交互”的因素,不同的关联(表1所示⇓,一个协会,B A和B协会协会和区别),这两个因素的共同作用的价值(表1所示⇓结合协会)和连锁不平衡的遗传因素在敏化/病人和控制(表1⇓A和B之间的联系),测试执行的目的是验证各种假设和价值观的基础上给出了一个解释意义。根据Svejgaard和赖德140.01 - -0.05,p -值应当被视为“可能显著”,只有p -;值< 0.01应该视为“重大”。事实上,HLA-association的回顾性分析研究表明,只有这些后者p -;值已在多个独立的研究14。然而,一些当局HLA-disease领域14强烈推荐使用表型的等位基因频率(或supratypic)标记而不是具体的原因:1)为了避免偏差的统计能力增强由人工固有的人口规模翻番的等位基因频率分析(从N病人2×N基因);2)表型分析似乎更合适,因为通常基因产物而不是基因本身负责疾病易感性或保护14。因此,等位变异分析数据提出了如上表型数据和可能“重要”和“重要”的定义使用整个手稿。
结果
人类白细胞antigen-DR、dq和dp标记频率
HLA-DRB1 * 0301的频率,HLA-DRB3 * 0101, HLA-DQB1 * 02和HLA-DPB1 * 0501等位基因是“敏感”的子群,而HLA-DRB3 * 0301高和HLA-DRB4 * 0103“疾病”子群较低(表2 - 5⇓⇓⇓⇓)。修正后的差异没有统计学意义的等位基因测试。
检查多态氨基酸残基的sensitization-associated等位基因HLA-DRB1 * 0301和HLA-DRB3 * 0101显示82%的同源性,表明共享多态残留事实上可能与致敏。所表达的比较多态残留的等位基因,与疾病或敏感相关积极的还是消极的,表明残留DRTyr26 DRArg74 sensitization-associated特有等位基因。
引人注目的是,DRArg74标志的频率明显高于“敏感”子群的控制(或3.96,p = 0.005, 95% CI 1.5 - -10.1)。相比之下,在“疾病”子群类似于控件(无意义的或0.89,95% CI 0.31 - -2.6;图1⇓)。DRArg74标记频率也在“敏感”组显著高于“疾病”子群(χ2测试中,p = 0.044)。
与以前的研究结果一致,DPGlu69标志的频率明显高于“疾病”子群的控制(或3.7,p = 0.016, 95% CI 1.4 - -10.0;图1⇑)。相比之下,在“敏感”的频率子群不是控制不同的(无意义的或0.89,95%可信区间0.30 - -2.22)。不出所料,几个的频率DPGlu69-positive HLA-DPB1等位基因也增加了“疾病”子群:HLA-DPB1 * 0201(控制:17.2%),27.3% * 0601 2.3%(控制:1.1%)* 0901(控制:0%),2.3% * 1001 6.8%(控制:2.7%)* 1601(控制:0%),2.3% * 1701(控制:0%),4.6% * 1901 2.3%(控制:0.5%)。同样,的频率DPGlu69-positive HLA-DPB1等位基因表型也增加了“疾病”子群(表6所示⇓)。这些差异,可能是由于小尺寸的研究小组,在统计学上显著的表型频率相比,对照组。
肿瘤坏死因子-α-;308多态性分析
TNF -的频率;α- 308 * 2等位基因在整个BeLPT-positive组相比显著增加BeLPT-negative控件(BeLPT-positive 51.1%与BeLPT-negative 16.1%,或7.8,纠正p < 0.0001, 95% CI 3.2 - -19.1)。当“敏感”和“疾病”子组分别比较控制,TNF -频率;α-;308 * 2明显高于在两个子组(图。1⇑),类似于“敏感”和“疾病”子群(χ2测试= 1.8,无意义的;图1⇑)。
分析基因的相互作用
DPGlu69之间的交互的评价,DRArg74和TNF -;α-;308 * 2标记,使用多个HLA与疾病关联的分析描述Svejgaard和赖德14显示,TNF -之间的良性互动,α-;308 * 2和DRArg74协会的“敏感”组(表1⇑结合协会)在缺乏连锁不平衡(表1所示⇑,A和B之间的联系),但是没有交互与“疾病”组(表1所示⇑结合协会)。相反,虽然没有肿瘤坏死因子之间的相互作用——;α-;308 * 2和TNF -协会DPGlu69;α-;308 * 2标记的子组(表1“敏感”⇑,结合协会协会有一个良性互动的“疾病”组(表1所示⇑结合协会),在缺乏连锁不平衡(表1所示⇑A和B之间的联系)。此外,有一个协会的DPGlu69 DRArg74-negative对象(表1“敏感”⇑B协会−+与−−),但是没有这两个标记之间的良性互动的“敏感”或“疾病”子组(表1⇑协会+ +与−+)。
讨论
当前概念的铍中毒的发病机理是肉芽肿反应吸入将开发,一个变量潜伏期后,在大多数,但不是全部,人开发一个T -;细胞反应4。之前的研究表明,个人的肉芽肿反应,反应是由活化的CD4 +类型-维护;1 T -;细胞,这种细胞能够识别被二类MHC分子了1。从作者的研究实验室和从别人已经表明,对铍中毒有关HLA-DP标记,HLA-DPBGlu69 supratypic标志5- - - - - -7王,虽然等。7声称对铍病的易感性与少HLA-DPB1Glu69-positive等位基因通过尚未定义的机制。这项研究表明,supratypic标记DPGlu69与表示“疾病”(即。缤纷的肺肉芽肿足以TBB检测病理改变),但它不是与表示“敏感”(即。肺肉芽肿察觉),相反,似乎与其他MHC II级标记有关,可能supratypic DRArg74标志。最后,“敏感”和“疾病”与MHC轨迹密切相关细胞因子基因TNF -;α,TNF -;α-;308 * 2标记。
不同HLA与疾病标志物的协会演讲让人想起许多免疫遗传的观察。MT1麻风病,MB1和DC1麻风结节的麻风病15,当DR3和氨基酸残基DRB1Arg13, 70年和71年与结核样的麻风病16。在结节病,DR3与演讲有关自发解决I期疾病,而DR4和DR5与表现进步的III期疾病相关联9。在日本血吸虫病、Dw19 DRw13和DQw1与肝纤维化的存在有关,和Dw12 DR2 DQw1, DPA1 * 0301和DPB1 * 020117,18。
当前HLA疾病相关的概念,氨基酸残基参与肽绑定HLA-DR分子表示T -;细胞抗原受体19也与一些免疫疾病易感性因素有关14。在最近的研究中,王等。7发现稀有等位基因的频率大幅提高HLA-DPB1 * 1701 * 0901 * 1001,以及减少常见的等位基因HLA-DPB1 * 0201在美国铍疾病患者和建议,这些人口,而不是supratypic标记,他们共享的,代表了疾病的标志。在目前的研究中,频率的增加Glu69 HLA-DPB1等位基因,包括HLA-DPB1 * 0201,还发现在“敏感”和“疾病”组。然而,Lombardi的示范等。8的Glu69残渣HLA-DPβ链直接参与的是T -;细胞与铍中毒HLA-DPBGlu69科目,与观测一致,HLA-DPGlu69残留在自身免疫和alloreactivity是很重要的20.的发现寡克隆beryllium-reactive T -;细胞21,强烈表明HLA-DPB1序列编码的氨基酸残基Glu69不仅是supratypic标记但铍中毒的免疫反应基因。有趣的是,HLA-DPGlu69与磁化率的观察硬金属肺病,直接与钴HLA-DPB1Glu69分子22表明这个HLA-DP分子具有与某些金属阳离子相互作用的能力,可能通过直接绑定。
DRArg74残渣,参与肽被HLA-DR分子绑定19,也可以在免疫反应中发挥直接作用。然而,目前还没有证据表明HLA-DRB3分子的作用是表示。另一方面,上下文的干扰素γ(IFN -γ)肉芽肿形成中起着举足轻重的作用,是反应过度在体外23,明显的“保护性”DRArg74对疾病发病机理的影响可能是由于协会HLA-DR3等位基因(即。DRArg74)干扰素生产较低的-,γ24。因为作者只评估与TNF - DRArg74协会;α-;308 * 2,DPGlu69 DRArg74干扰素-较低的联系;γ-;刺激生产的可能性不能排除。
关于肿瘤坏死因子-α-;308 * 2标记,众所周知,TNF - 308 * 2是与高TNF -密切相关;受试者携带HLA-A1α生产−B8和−DR3单体型。概念,目前市面上高架TNF -;α生产与−308多态性可能改变免疫反应,从而增加疾病发展的风险25。这个标志已经与对结节病的易感性有关26和矽肺病27。可以推测,TNF -;α起着启动的作用是敏感因为众所周知,TNF -;α信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达增加是刺激H36.12j老鼠巨噬细胞细胞系28,这一过程类似于实验nickel-contact皮炎,nickel-upregulated角化细胞肿瘤坏死因子-;α生产在皮肤敏化过程中发挥作用29日。
总之,目前的研究证实,人类白细胞antigen-DPGlu69标记与铍病和识别另一个基因标记,肿瘤坏死因子-;α-;308 * 2,也与疾病风险相关。此外,它表明一个以上的主要组织相容性复合体基因可能参与疾病易感性的决心,在疾病发病机理不同甚至截然相反的角色。在遗传筛查疾病风险可能是划算的30.,疾病相关基因的描述可能导致疾病风险的识别可靠的标记物铍中毒的预防。
确认
作者感谢k·克瑞斯(国家职业安全与健康研究所,位于西弗吉尼亚州,美国)和b甄(美国响应肿瘤、孟菲斯、TN)在项目的开始他们的帮助。作者还要感谢K.M. O ' donnell编辑稿件。
- 收到了2000年12月12日。
- 接受2001年6月10日。
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