文摘gydF4y2Ba
目前尚不清楚炎症肺囊性纤维化(CF)主要涉及细菌感染,或发生突变的直接后果囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道的蛋白质。gydF4y2Ba
白介素8 (IL) CF和non-CF细胞株,分泌物和CF和non-CF人类原发性鼻腔上皮细胞孵化有或没有gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba测量。激活核factor-κB (NF-κB)如果CF和non-CF鼻上皮细胞,细胞和小鼠组织被gel-shift分析测量。gydF4y2Ba
无显著差异在基底之间引发生产或观察NF-κB激活CF和non-CF主鼻细胞。然而,CF细胞表现出显著(p < 0.01)后引发的分泌增加gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba刺激。均衡的增加gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba坚持CF中观察到细胞,non-CF水平,导致可比引发分泌。此外,引发生产没有差别CFTR突变导致要么正确定位检测或部分/全部定位错觉这种蛋白质。被观察到了类似NF-κB激活水平在许多器官的野生型小鼠和CF。最后,引发分泌和NF-κB活动没有持续增加CF细胞系。Cos-7细胞转染质粒表达ΔF508或G551D CFTR突变检测蛋白导致的激活增加p50-containing NF-κB复杂,但引发分泌类似于野生型细胞。gydF4y2Ba
作者得出结论,产生的刺激gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在他们的模型是主要的炎症触发。gydF4y2Ba
法国Lutte协会的这项研究得到了靠la Mucoviscidose法国de Pneumologie de法语语言欧洲呼吸学会,北大西洋公约组织,囊性纤维化研究信任和威康信托基金会高级临床奖学金。188bet官网地址gydF4y2Ba
在过去的二十年里,囊性纤维化患者的预期寿命(CF)已显著改善,让生存中值达到三十年。CF基因的克隆和随后的基因产物的分子生理调查导致了疾病的更好的理解。CF基因编码囊性纤维化跨膜电导调节蛋白(雌性生殖道)氯通道局部上皮细胞膜表面的顶端。超过800的CF突变分为五组根据雌性生殖道的作用是破坏的机理。广泛,其中包括那些没有蛋白质的产生(一级),蛋白质不达到正确的位置(二类),和那些少量或少功能的蛋白质正确本地化(类III-V)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。删除氨基酸苯丙氨酸的位置508 CFTR(ΔF508)检测蛋白质占> 70%的白种人和CF等位基因是一个二类突变。gydF4y2Ba
CF死亡的最常见原因是导致呼吸衰竭慢性肺部感染和炎症gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。然而,目前尚不清楚是否感染炎症是一个简单的二次反应,还是雌性生殖道更直接相关的主要缺陷的生成这种炎症过程。大量的证据联系CFTR突变检测增加对感染的易感性。大多数研究表明CF主题显示黏膜纤毛的间隙减少,可能相关的主要缺陷。反过来,这将使感染由多种生物gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。本地主机抗菌防御,如βdefensinsgydF4y2Ba3gydF4y2Ba、可能显示功能受损的结果改变气道表面液体电解质(ASF),尽管它目前不清楚CF ASF确实是异常对钠和氯化物含量gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。一个有争议的假设表明,摄入有缺陷gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba通过呼吸道上皮细胞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,可能会促进感染。最后,受体gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,asialoglycolipid asialo-GM1,显著增加的顶端细胞膜CF呼吸道上皮细胞,因此,促进感染增加依从性gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。因此,一些研究支持的假设CFTR突变检测可以导致细菌殖民化和合成炎症。gydF4y2Ba
主要的假设(内生)炎症首先基于前可检测感染炎症的临床观察CF新生儿和儿童。因此,支气管肺泡灌洗液中性粒细胞浸润,增加白介素8 (IL)的水平gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和蛋白酶/ antiprotease失衡,而是为细菌培养阴性gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。最近的一项研究的内生炎症的概念gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。人类胎儿早期炎症检查气道异种移植在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。从明显增加IL 8分泌应承担的CF近端气管移植感染之前,相比non-CF移植。中性粒细胞招募表面上皮的基底膜和运动也是显而易见的。这是在non-CF近端航空慢和不明显。在远端气道异种移植,中性粒细胞迁移再次观察到CF航空公司,但未见的non-CF组织。内源性炎症的一个可能的解释是突变的CFTR (mistrafficked)检测蛋白可以直接增加激活转录因子核factor-κB (NFκB应承担的)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。NFκB应承担的,尤其是p50 / p65异质二聚体,参与了大量的促炎介质的调节gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。此外,“保护”等细胞因子IL 10应承担的服务终止炎症,和也的控制下NFκB,已被证明在CF显著降低gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
引发一个强大的化学引诱物,由NF-κB转录调控。引发参与招募中性粒细胞在肺gydF4y2Ba13gydF4y2Ba鼻粘膜gydF4y2Ba14gydF4y2Ba和是一个中央气道的炎症反应的因素gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。这项研究检查是否有证据表明基底IL 8生产和增加NF-κB激活支持假设直接连接CFTR突变检测炎症。评估炎症感染后的备择假设,研究无论是在CF,刺激gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba导致夸大生产引发,这反过来与典型增加这些生物体的依从性水平。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
患者人群gydF4y2Ba
该研究使用29成人CF患者(男性)21日平均29.2岁(范围)(17-44)岁。没有使用经鼻吸入、口服或静脉注射类固醇和没有病人在急性恶化进行了研究。每个主题的基因型是包含在结果部分。十八岁不吸烟的健康志愿者(男性)11日平均年龄为32.7(23-50)年担任控制。批准的协议是皇家主管布朗普顿医院伦理委员会和地铁站所有受试者知情同意。gydF4y2Ba
鼻上皮细胞收获gydF4y2Ba
鼻腔的粘膜上皮细胞是通过刷下鼻甲的两个鼻孔3毫米细胞学刷(英国Thirsk Diagmed)。恢复细胞悬浮在火腿的F12培养基(Gibco BRL,佩斯利,英国),洗一次,颗粒状的脉冲离心(13000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在磷酸盐(PBS)和resuspended火腿的F12。细胞数量被显微镜检查量化标准的血球计计数室(σ,普尔,英国),用台盼蓝排斥试验可行性评估。随后,评估的样本分为两组IL 8分泌物和细菌粘附。24小时后生存能力再次量化。gydF4y2Ba
菌株gydF4y2Ba
一个实验室参考的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba(国际抗原输入计划(iat)血清型0:1(国家集合类型文化的11440年,美国类型文化收藏3348),nonmucoid, piliated和gentamycin-sensitive)使用gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。细菌生长在血琼脂平板连续四天前一夜之间文化胰蛋白胨大豆肉汤(英国贝辛斯托克Unipath有限公司),以确保毛发生成。透射电子显微镜法证实了毛发生成状态。简单地说,细菌是悬浮在蒸馏水,放入formvar涂层网格(琼脂科学有限公司、斯坦斯特德、英国)和消极沾0.65%磷钨酸钠。随后,细菌被离心160×颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层清液被和颗粒resuspended 1毫升的磷酸缓冲盐(PBS)。细菌浓度量化了分光光度法,光学密度在620纳米,0.1∼对应2.5×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba细菌,如前所述gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。细菌在PBS稀释了。gydF4y2Ba
假单胞菌刺激试验gydF4y2Ba
鼻上皮细胞被分成两个400 -µl整除。gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在最后一个∼5.2×10的浓度gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细菌·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba被添加到一个整除,而第二个整除是用来确定基底引发分泌缺乏刺激。整除都孵化在37°C和5%的二氧化碳。1 h后,50µL上层清液从每个样本,并立即被储存在−20°C随后引发的分析。庆大霉素(500µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)被添加到每个样本和孵化继续在同样的条件下。24小时后,50µL上层清液从每个整除和存储在−20°C。IL 8应承担的量化进行了使用标准酶联免疫吸附试验(ELISA);Genzyme, Billinghurst,英国),结果表示为引发生产·10gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba活细胞出席的开始孵化。gydF4y2Ba
评估细菌粘附的扫描电子显微镜gydF4y2Ba
坚持由先前描述的技术评估gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。短暂,孵化后37°C 1 h,鼻刷旋转通过50% Percoll梯度(Pharmacia-Biotech,圣奥尔本斯,英国)在13000×4°CgydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟,区分不依从细菌和细菌附着于上皮细胞。不依从的细菌颗粒状管的底部,而细菌附着于上皮细胞仍在percoll / PBS接口。这个分数被和cytospun 20×gydF4y2BaggydF4y2Ba到一个thermanox盖玻片(Emitech,阿什福德、肯特、英国)。细胞被固定在一夜之间cacodylate-buffered 2.5%戊二醛,洗甲次砷酸盐缓冲钠和脱水系列浓度的乙醇和hexamethyldisilazane (TAAB实验室、奥尔德马斯顿、英国)。盖玻片被安装到铝存根,涂上一层黄金机会,分析通过场发射扫描电镜(日立S4000,日星Sangyo,东京,日本)。样本编码和检查孵化条件与盲法。细菌绑定,定义为直接接触的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba纤毛细胞表面,是评估的均值±sem 41±3细胞/样品。坚持数据表示为均值±sem每10细胞附着的细菌。gydF4y2Ba
均衡的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性gydF4y2Ba
增加IL 8应承担的分泌水平由CF细胞可能仅仅反映了受体数量增加,作者试图平衡细菌粘附在CF和non-CF细胞。减少稀释的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba标准文化应用于CF细胞,直到类似的依从性水平出现在CF和non-CF细胞。gydF4y2Ba
电泳迁移率改变分析gydF4y2Ba
在冰冷的细胞球洗两次PBS(σ,普尔,英国)和细胞溶解在70年µL Pahl提取缓冲(如前所述)gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。作者化验细胞总蛋白,因为不管细胞内定位,只有激活NF必经κB可以形成脱氧核糖核酸(DNA) /蛋白复合物,从而使用electrophonetic流动可视化试验(EMSA)的转变。短暂,细胞在提取resuspended缓冲区(20毫米N - [2-hydroxyethyl] piperazine-N”——(2-ethanesulfonic酸)(玫瑰),pH值7.9,350毫米氯化钠,20%甘油、1%诺乃清洁剂(NP40), 0.5毫米的乙二胺四乙酸(EDTA), 1毫米ethyleneglycol-bis -(βaminoethylether应承担)- N, N, N′, N′-tetraacetic酸(EGTA), 0.5毫米二硫苏糖醇(DTT)加蛋白酶抑制剂单位(蒂乌)胰蛋白酶抑制剂(0.2毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(抑肽酶,500µM 4) - 2-aminoethyl benzinesulphonyl氟化物(AEBSF),原钒酸钠1毫米,10毫米氟化钠)和孵化冰上30分钟。通过离心细胞碎片被(14000×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟)和蛋白质浓度由修改Folin-Lowry方法决定gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。从Promega凝胶转变分析系统(南安普顿,英国)使用和EMSA根据制造商的建议进行。一个包含κ的寡核苷酸探针轻链增强共识序列结合位点NFκB应承担(5′agt TGA GGG广汽TTT CCC gg颈- 3′)与放射性标记end-labelled三磷酸腺苷(gydF4y2Ba32gydF4y2BaP-ATP) (Amersham生命科学有限公司小都,英国)。使用的每个反应10µg细胞蛋白质。反应产品解决nondenaturing 5%聚丙烯酰胺凝胶(Anachem、卢顿、英国)10马3 h 20°C。凝胶被干2 h在80°C和暴露于柯达以下电影女士−80°C。识别的特异性NFκB应承担的绑定,竞争研究的大约50倍超额未标记的寡核苷酸进行了NFκB应承担的共识。supershift分析2µg anti-p50, anti-p52, anti-cRel anti-RelB或anti-p65抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司、钙、美国)添加标记寡核苷酸和反应是孵化后在室温下进一步45分钟。量化的NFκB应承担的复合物是由微使用LabScan和ImageMaster 1 d软件(Amersham法玛西亚生物技术,圣奥尔本斯,英国)。gydF4y2Ba
老鼠gydF4y2Ba
肺、气管、肝脏、脾脏和肾脏被从ΔF508纯合子CF老鼠(雌性生殖道gydF4y2Batm2CamgydF4y2Ba)gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba和non-CF同窝出生的(年龄6 - 12周)。确定地理NFκB活动组织在1毫升的机械均质提取缓冲和处理EMSA如上所述。使用的每个反应20µg总蛋白质。gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
人类CF细胞系使用气管上皮(ΣCFTE29o,ΔF508 /ΔF508),粘膜上皮(CFSMEo——ΔF508 /未知)和鼻息肉(CF-NPE9o,不明/未知)。人类non-CF细胞系使用支气管上皮细胞(hbe14o 16日-),气管上皮细胞(9 hteo)和tracheo-bronchial上皮(TBEo)。Dieter Gruenert提供的所有细胞系(美国加州大学,旧金山,CA)。CFSMEoΣCFTE29o CFNP9o——————和16 hbe14o——在基本培养基培养细胞(MEM);9 hteo TBEo,细胞生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)。媒体都是补充10%胎牛血清(FCS)和1% penicillin-streptomycin解决方案和细胞生长在5%的股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的气氛。所有媒体,FCS和抗生素解决方案获得σ(英国普尔)。文化化验了支原体污染使用ELISA测定(英国勃林格曼海姆,刘易斯,英国)和被证明是免费的感染。IL 8应承担的分泌在24小时孵化决心semiconfluent层使用一个标准的ELISA测定。确定地理NFκB激活细胞融合增长到70%,刮到周围介质和颗粒状160×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在室温和蛋白溶解产物是如上所述。永生化细胞培养细胞融合的程度可能影响激活NFκB应承担的蛋白质。因此,被小心地确保所有化验在70%融合细胞培养。因为列车7细胞(由写明ATCC)在DMEM培养在例行程序补充10% FCS和1%链霉素/青霉素。gydF4y2Ba
转染gydF4y2Ba
6.2 kb野生型,ΔF508 G551D雌性生殖道互补脱氧核糖酸(互补)被克隆到真核表达载体的不是我网站pCMVβ(英国贝辛斯托克Clontech实验室英国有限公司),β牛乳糖应承担的报告基因通过不是我被消化。DNA制备使用试剂盒列(试剂盒有限公司,西萨塞克斯郡,英国),根据制造商的建议。瞬时转染semiconfluent Cos 7应承担的细胞进行了使用质粒阳离子脂质DC-Cholesterol / dioleylphosphatidylethanolamine复合体(涂料)的比例1:3(44.8µg质粒:134.4µg脂质/ 80厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba瓶)Optimem(σ)。与正常生长培养基中取代了转染后24小时。IL 8决心48 h后应承担的转染和NFκB活动决心如上所述。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
Mann-Whitney U的测试是用来比较意味着和Wilcoxon等级测试和评估从背景水平变化的意义。零假设被拒绝在p < 0.05。数据提出了均值±sem为了方便。数字人体或老鼠是由n个数字,表示在适当的地方。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
Interleukin-8鼻上皮细胞分泌gydF4y2Ba
在缺乏补充道gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在24小时,IL 8分泌从刚获得CF (n = 19)和non-CF (n = 16)主要鼻上皮细胞没有明显不同(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。孵化与gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba导致显著(p < 0.05)提高引发分泌物从CF 24 h后,但不是从non-CF鼻细胞。因此,在存在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba从CF, IL 8分泌细胞大约是3倍高于从non-CF细胞(p < 0.01)。评估细胞的生存能力通过台盼蓝排斥和纤毛跳动的证据证明没有显著差异在活细胞的数量后24 h刺激(CF: 1.8±0.6×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,n = 11;non-CF: 1.7±0.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,n = 8)。gydF4y2Ba
均衡的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性水平在囊性纤维化和non-cystic纤维化细胞gydF4y2Ba
它曾被证实使用这些方法gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba坚持CF细胞是non-CF∼3 - 4倍gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。因为这可能是引发的刺激生产,作者试图平衡CF和non-CF细胞附着细菌数量。作者首先评估的最高浓度gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba可应用于non-CF细胞而不影响其生存能力,所评估的台盼蓝排斥和纤毛跳动的证据。1:4稀释的标准gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba文化,对应1.6×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba细菌·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的最大允许浓度导致4.5±0.6gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba坚持每10细胞(n = 7)。gydF4y2Ba
接下来,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba应用于CF细胞浓度降低生产类似的水平的绑定在non-CF细胞(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。这种级别的绑定了CF与细胞gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba解决方案集中大约6倍低于non-CF,对应2.5×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细菌·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。可行性的评估,在24 h,使用这两个浓度gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaCF和non-CF细胞没有不同。gydF4y2Ba
Interleukin-8分泌的条件下相似gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性gydF4y2Ba
当水平的gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性是大致相等,IL 8生产应承担的CF (n = 13)和non-CF细胞(n = 7)在24小时内没有差别(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。这种比较注意,IL 8应承担的值被规范化为附着细菌的数量证明每个主题,试图确保更大的准确性。因为这个校正、价值观不同大小与图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba。不同浓度的细菌被应用于CF和non-CF细胞,坚持基底外侧膜也检查排除任何可能影响IL 8分泌。基底无显著差异程度的依从性之间观察到CF和non-CF细胞(CF: 3.0±0.5·10细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;non-CF: 2.0±0.4·10细胞gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
基因型的影响gydF4y2Ba
确定CF基因型的影响gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Bainduced-IL高8分泌在患者分为三组。第1组(n = 13)与mistrafficking两等位基因突变(ΔF508该和ΔF508 / I507复合杂合子),组2 (n = 6)只有一个mistrafficking突变(ΔF508复合杂合的,第二个突变被R553X×2, 1717 - 1 - G→a, 621 + 1 G→T, G551D×2), 3组(n = 3)没有mistrafficking突变(基因型被G542X / 3849 + 10κb G→T, G542X / R533X, 1717 - 1 - G→a / G551D)。没有发现差异在三组之间的地理IL 8分泌(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
核因子量κB活动主要鼻上皮细胞和囊性纤维化小鼠组织gydF4y2Ba
EMSA化验使用NFκB应承担的共识寡核苷酸导致三个特定DNA /蛋白复合物的出现在所有的系统研究。一个典型的例子如果9 hteo -细胞溶解产物如图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。只有DNA /蛋白质复合体I和II后增加肿瘤坏死因子α应承担(肿瘤坏死因子α应承担)和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba刺激在细胞系和老鼠(未发表的数据)。复合体I和II,因此,结合量化在后续实验中激活NFκB应承担的标志。Supershifts表明复杂二世包含p50蛋白质,但成分复杂的我不能确定(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。消除任何变化复杂I和II带密度由于个人凝胶实验程序,乐队感兴趣的是标准化的特异性的乐队的乐队密度在每一个车道。NFκB应承担的活动类似于刚获得初级鼻上皮细胞来源于CF (n = 4)和non-CF科目(n = 5)(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
这些观察结果扩展到CF和non-CF小鼠器官的比较。也没有显著差异在NFκB应承担的激活肺、气管、脾脏、肾脏和肝脏的ΔF508 CF (n = 6)和野生型小鼠的同胞(n = 6)(图5所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。因为技术原因不可能评估肠道。gydF4y2Ba
核因子κB活动和白介素8分泌永生化细胞系gydF4y2Ba
CFNP9o——细胞表现出一个显著降低激活NFκB (n = 6, p < 0.001),没有区别IL 8分泌与三的均值相比non-CF细胞系(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。CFSMEo -细胞NFκB应承担的活动增加(n = 6, p < 0.01),但IL 8分泌不应承担的不同(n = 6)。ΣCFTE29o -细胞显示增加激活NFκB (n = 6, p < 0.001)和IL 8分泌(n = 6, p < 0.001)。增加CFSMEo NFκB应承担的活动和ΣCFTE29o细胞在很大程度上是由于增加复杂的二世。gydF4y2Ba
转染的影响与野生型,ΔF508 G551D囊性纤维化跨膜电导调节核factor-κB活动和白介素8分泌gydF4y2Ba
因为7细胞转染与ΔF508或CFTR G551D检测质粒,表现出显著增加p50-containing复杂二世与野生型相比,转染子(n = 10, p < 0.01)(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。没有观察到显著增加复杂的我。地理IL 8分泌没有明显的不同在任何转染子(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。成功转染确认通过plasmid-specific逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr;数据未显示)。与β-galactosidase记者基因转染后11±3% (n = 6)的细胞为阳性X加免疫组织化学分析。然而,这种分析低估了总体转染效率gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在目前的研究中,使用刚获得人类鼻腔上皮细胞,它已经被证明了升高IL 8分泌产生的CF在存在gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba是增加的直接后果细菌绑定。没有增加基底NFκB应承担的活动可以检测到主CF鼻上皮细胞或CF老鼠。NFκB活动和引发分泌变化大大CF细胞系之间,也不断增加,他们也没有相互关联。超表达ΔF508和G551D CFTR突变检测p50活动增加在Cos 7应承担的细胞相比,野生雌性生殖道的超表达;然而,这并没有增加一个增加IL 8分泌。这些研究有其局限性,但总的来说目前的研究结果支持这样的观点,炎症在CF主要涉及这些患者的细菌在航空公司负担。gydF4y2Ba
有大量的临床数据支持微生物的主要发起者的角色CF炎症gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。许多病原体感染与支气管CF包括gydF4y2BaHaemophilius流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba和呼吸道合胞病毒(RSV)。每一个细菌,特别是gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,结合asialo-GM1受体gydF4y2Ba通过gydF4y2Bapili诱导后续IL 8应承担的生产;没有使用unpiliated IL 8 upregulation应承担的观察gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba。因此,这些发现符合作者的建议特点CF炎症的增加有关gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性。asialo-GM1 CF受体细胞数量的增加可能的直接结果CF mutation-related sialylation缺陷gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。因此,减少gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba坚持鼻上皮细胞已被证明后转染野生型雌性生殖道gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
同时gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba依从性明显诱因CF炎症,临床研究表明,炎症可能会先于其他细菌殖民化。这是基于检测支气管肺泡灌洗的炎症细胞,引发缺乏明显的微生物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。这些发现的另一个解释是,炎症反应已经成功地消除了最初的生物诱导gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。实验室的一些研究也建议CFTR突变检测直接诱导炎症反应的作用gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。符合临床研究显示正常地理IL 8水平分辨率的感染后,没有证据表明地理升高IL 8在初选如果CF鼻上皮细胞可以被发现。鼻拭子从12的CF受试者评估细菌殖民化,一个是积极的gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,而其余11显示,没有证据表明细菌生长。此外,在CF NF-κB激活并没有增加,人类鼻腔上皮细胞或组织获得ΔF508 CF老鼠能被检测出来。显然,整个肺EMSA分析的一个限制是nonepithelial的稀释效应细胞不太可能CFTR表达检测。然而,相似的发现在人类上皮细胞支持这些数据。与DiMango公布的数据一致gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。gydF4y2Ba10gydF4y2BaNFκB应承担的活动增加和IL 8分泌ΣCFTE29o相比,细胞也发现三个野生型细胞系。然而,另外两个测量CF细胞系(CFSMEo、CFNPE9o)显示,增加NF-κB和IL 8不一致的特点,这样不灭的CF细胞系。实际上,所有的组合升高或者降低NFκB激活和IL 8应承担的变化可以证明。而ΔF508纯合线(ΣCFTE29o)产生更高水平的IL 8比其他应承担的CF细胞系,最近的一篇论文已经表现出相似的变化,包括两个ΔF508纯合子的细胞系gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
BaeuerlegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba表明,内质网(ER)保留蛋白质如CFTR突变检测可能导致激活NF-κB因此促炎细胞因子的表达。冷却ΔF508 CF细胞已经被证明可以促进贩卖ΔF508雌性生殖道的顶端膜。最近的一份报告表明,这样一个减少温度也降低了NFκB活动和IL 8分泌gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。然而,冷却可能会影响许多细胞过程,和目前的研究接着促进雌性生殖道贩卖使用氧化三甲胺N量(TMAO),从而增加ΔF508贩卖的顶端膜ΣCFTE29o -细胞。TMAO可能恢复环腺苷酸(营)端依赖氯流出,但并未改变NFκB应承担的活动和IL 8分泌细胞(数据未显示),符合目前的数据,显示缺乏效果不同的雌性生殖道突变。然而,很明显,这些结果可能被视为TMAO诱导低水平的人口贩运氯化足以恢复功能,但离开绝大多数的CFTR突变检测mistrafficked。gydF4y2Ba
为了进一步确定ER过载的影响,本研究瞬变过表达野生型,ΔF508或者CFTR G551D检测蛋白质在Cos 7细胞。这些都是为他们的选择相对较高的转染效率,也因为这些细胞有能力应对炎症刺激,如肿瘤坏死因子α应承担的,增加IL 8分泌(数据未显示)。显著增加p50含蛋白质/ DNA复杂(复杂II)后发现ΔF508或G551D超表达相比,超表达的野生型蛋白。然而,p50活动增加并不是伴随着IL 8应承担的分泌增加。目前尚不确定在多大程度上p50 homo -或者有助于形成IL 8的监管。朱gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba已经证明,p65/65为负责监管IL 8在人类鼻腔上皮细胞分泌。然而,其他研究表明,IL 8分泌应承担监管通过p50 / p65形成gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba和很可能监管细胞类型之间的差异。gydF4y2Ba
目前发现符合认为增加细菌粘附明显有助于炎症反应在囊性纤维化航空公司。主机在囊性纤维化炎症反应可能被认为是在疾病进展的两个阶段。第一阶段的特点是增加了细菌粘附和消灭病原体的保留能力,增强与炎症标记物作为目击证人最近的感染。然而,慢性炎症反应的影响,和仍然存在的细菌(可能与增加依从性有关,过多的粘液和许多其他因素,导致炎症过程的第二阶段不再是足够有效生产细菌清除率。目前的数据不能排除炎症突变蛋白的直接贡献,但认为这可能是一个不重要的因素。如果这些观点是正确的,新颖的治疗方法旨在减少细菌粘附将扮演重要的角色在生命早期的囊性纤维化患者。减少炎症可能是有害的,这个时候通过减少适当的宿主反应增加负担。这种治疗方法的影响,在以后的生活中显然将取决于之间的平衡“有用”和“不合适”的炎症。很可能只有试验的抗炎治疗可以区分这些可能性。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者感谢志愿者提供了鼻样本,和皇家主管布朗普顿医院囊性纤维化诊所地铁站的工作人员对我的帮助。此外,作者感谢t·皮特提供gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba菌株,d . Gruenert细胞系,l .黄DC-Cholesterol / dioleylphosphatidylethanolamine(涂料)和j . Rommens囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)质粒。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2000年4月3日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2000年7月31日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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