气道上皮细胞通过IFN-β依赖机制产生TNF家族的B细胞激活因子¹

气道上皮细胞形成一个复杂的物理屏障，抵御有害物质和微生物病原体。气道上皮细胞还通过产生细胞因子和趋化因子以及与免疫系统细胞的相互作用来调节免疫反应。上皮细胞活化是由上皮细胞直接暴露于有害物质，暴露于病原体相关分子模式(PAMPs)引起的。^3.或暴露于来自组织细胞或浸润白细胞的激活细胞因子(1，2，3.，4，5，6)．上皮细胞的激活可以导致即时的宿主防御反应，因为它们被诱导产生宿主防御分子。此外，长时间或强大的上皮激活可导致促炎细胞因子和趋化因子的释放，吸引炎症细胞。上皮细胞的活化及细胞因子和趋化因子的产生在过敏性疾病如哮喘和过敏性鼻炎(7，8)．它已被广泛研究，因为这些介质影响炎症细胞的活性，如嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和肥大细胞，这些细胞是这些疾病的特征性浸润细胞(7，8)．

已知B细胞产生IgA和IgE在过敏性疾病中至关重要。Diaz-Sanchez等人(9)显示人体上呼吸道局部产生IgE。最近的证据表明，广泛的Ig类开关重组(CSR)和IgE产生发生在过敏性鼻炎患者的鼻黏膜和哮喘患者的支气管黏膜(10，11)．此外，在这些疾病患者的气道黏膜中发现了活化的IgA-和ige表达B细胞。由于IgE在哮喘和鼻炎中的重要性已得到认可，气道内B细胞的局部激活被认为是过敏性气道疾病发病机制中的一个重要事件。

CSR是B细胞从IgM H链C区(Cμ)的表达转移到另一个C区，从而产生新的Ab同型的过程(例如，从IgM切换到IgA或IgE)。Ags通过B细胞上的CD40和TNF配体超家族(TNFSF)成员CD40L(也称为CD154和TNFSF5)之间的相互作用诱导生发中心B细胞的CSR激活CD4⁺T细胞(12，13)．尽管CSR通常被认为高度依赖于CD40，但也有报道称病毒和细菌产物在缺乏T细胞或CD40依赖信号的情况下可以诱导Ig的产生(14，15，16，17)．

增殖诱导配体(APRIL;也称为TNFSF13)和TNF家族的B细胞激活因子(BAFF;也被称为BLyS, TNFSF13B, TALL-1和THANK)最近被确定为TNFSF的成员，在B细胞成熟和功能中发挥重要作用(18，19，20.，21)．BAFF促进B细胞存活和增殖(21，22，23)．BAFF和APRIL还促进cd40独立、T细胞独立的CSR和Ig产生(15，24)．BAFF与三种选择性表达在B细胞上的受体结合，包括跨膜激活剂和CAML相互作用剂(TACI)、B细胞成熟Ag (BCMA)和BAFF受体(BAFF- r) (21，22，23)．APRIL也与TACI和BCMA结合，但不与BAFF- r结合，后者仅与BAFF (21，22，23)．BAFF-R是成熟B细胞存活的有效调节因子(25，26)．相反，TACI被认为可以抑制B细胞的增殖和存活。BCMA似乎对B细胞稳态不重要，但对于浆细胞的最佳生存是必需的。BAFF-R和TACI也能向IgG和IgE转变，但向IgA转变的信号仅由TACI调节(24)．据报道，在自身免疫性患者(如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和干燥综合征患者)的血清中，BAFF含量升高，Abs对BAFF的潜在治疗效果已被研究(22，27，28)．BAFF转基因小鼠血清中总Igs、类风湿因子和循环免疫复合物水平较高，而缺乏BAFF或BAFF- rs的动物或人类B细胞和Ig反应最低(29，30.)．因此，BAFF在正常免疫反应和自身免疫性疾病的发病机制中都起着重要作用。与自身免疫性疾病相比，BAFF和APRIL在气道炎症性疾病中的作用尚不清楚。

功能性TLR家族成员已知在气道上皮细胞上表达(6，31，32，33，34)．在本研究中，我们研究了激活B细胞的TNFSFs、CD40L、APRIL和BAFF的成员是否在气道上皮细胞中被TLR配体表达或诱导。我们发现，气道上皮细胞中，TLR3配体dsRNA强烈而显著地诱导BAFF, BAFF的表达受到TLR3-和IFN-β-依赖信号通路的调控。这些发现提高了气道上皮细胞和B细胞之间的重要相互作用的可能性，并提出了以下假设:上皮细胞产生BAFF可能有助于气道内B细胞的局部积累、激活、CSR和Ig合成。

Zymosan A来自酿酒酵母， LPS来自大肠杆菌，血清型0111:B4，丙酸氟替卡松(FP)购自Sigma-Aldrich。聚(I:C) (dsRNA) (Amersham Biosciences)，肽聚糖(PGN)从金黄色葡萄球菌(Fluka)，鞭毛蛋白从鼠伤寒沙门氏菌菌株14028 (Apotech)和R-848 (InvivoGen)从指定来源购买。CpG寡核苷酸2216 (CpG- a;5 ' - gggggacgatcgtcggggg -3 '，小写字母，磷酸基连接;大写字母，磷酸二酯连接3 '碱基)在Sigma Genosys合成。重组人IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、BAFF以及BAFF- r (BAFF- r:Fc)和TACI (TACI:Fc) IgG1 Fc融合蛋白均购自研发系统。针对STAT1的小干扰rna (siRNAs) (Hs_STAT1_6 HP验证siRNA;SI02662324)、IFN-αβ受体2 (IFNAR2) (Hs_IFNAR2_2 HP siRNA;SI00017500)，从Qiagen获得无效果对照。

腺病毒12 sv40转化人类支气管上皮细胞系BEAS-2B是C. Harris(美国国家癌症研究所，贝塞斯达，MD) (35)，在DMEM/F12 (Invitrogen Life Technologies)中培养，并添加5%热灭活FBS (Invitrogen Life Technologies)， 2 mMl-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素(Invitrogen Life Technologies)。获得人原代支气管上皮细胞(PBEC)，如前所述(36)．PBEC保存在无血清LHC-9培养基中(BioSource International)。PBEC被镀在12孔或24孔的培养板上，涂有胶原蛋白(Vitrogen;胶原蛋白生物材料)。在刺激前，PBEC在不含氢化可的松(BioSource International)的无血清LHC-8培养基中培养至少2天。以PGN (10 μg/ml)、zymosan (100 μg/ml)、dsRNA (25 μg/ml)、LPS (1 μg/ml)、鞭毛蛋白(10 ng/ml)、R-848 (1 μg/ml)、CpG-A (3 μg/ml)刺激气道上皮细胞18 h;或100 ng/ml IL-1β、100 ng/ml IL-4、100 ng/ml IL-6、100 ng/ml IL-10、100 ng/ml IL-12、100 ng/ml IL-15、100 ng/ml TNF-α、1000 U/ml IFN-β、100 ng/ml IFN-γ、100 ng/ml TGF-β、100 ng/ml G-CSF、100 ng/ml GM-CSF作用6 h。

BEAS-2B细胞以低密度(5 × 10⁴细胞/孔)在DMEM/F12中过夜，并添加5%热灭活胎牛血清。按照制造商的说明，在30-50%合流时，使用HiPerFect转染试剂(Qiagen)在5或20 nM处转染siRNA对抗STAT1、IFNAR2或对照RNA。转染细胞培养72 h后，用1000u /ml IFN-β和25 μg/ml dsRNA刺激细胞6 h。

根据制造商说明书，用RNeasy (Qiagen)提取总RNA，用DNase I (Qiagen)消化。用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen Life Technologies)和随机引物合成单链cDNA。实时RT-PCR采用TaqMan方法，采用Applied Biosystems 7500序列检测系统(Applied Biosystems)，反应量为20 μl (2× TaqMan Master mix (Applied Biosystems) 10 μl，每个引物400 nM, 200 nM TaqMan探针+ cDNA)。4个基因BAFF (sense, 5 ' -TCGATGTATTCAAAATATGCCTGAAA-3 ';反义,5“-TGCAATGCCAGCTGAATAGC-3”;MGB-probe, 5 ' -CTACCCAATAATTCC-3 ')， APRIL (sense, 5 ' -AGAGCAGTGCTCACCCAAAAAC-3 ';反义,5“-GCCACATCACCTCTGTCACATC-3”;MGB-probe, 5 ' -CACCTGGTTCCCATTAA-3 ')， CD40L (sense, 5 ' -CTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTT-3 ';反义,5“-GACTTTAGGCAGAGGCTGGCTA-3”;MGB-probe, 5 ' -CGAGTCAAGCTCC-3 ')和GAPDH (sense, 5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 '; antisense, 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′; FAM/TAMRA-labeled probe, 5′-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′) were synthesized at Applied Biosystems. Real-time PCR for IFN-β was performed with a SYBR Green I method, as described previously (37)．为确定准确的靶基因拷贝数，每次实验均将纯化的靶基因PCR片段定量稀释，并作为标准。使用相当于总RNA 10 ng的cDNA等分(IFN-β的PCR为125 ng)进行实时PCR。mRNA的表达水平归一化至管家基因的中位表达(GAPDH)．常规RT-PCR采用铂TaqDNA聚合酶，反应量为50 μl (45 μl Platinum PCR SuperMix (Invitrogen Life Technologies)，每个引物加cDNA 200 nM)。RT-PCR BAFF引物(检测，5 ' -GAAATAAGCGTGCCGTTCAGG-3 ';反义，5 ' -TTAGATGTCCCATGGCGTAGGTC-3 ')在应用生物系统公司合成。

进行基因芯片分析，如前所述(38)．使用GeneChip Human Genome U133 + 2.0探针阵列(Affymetrix)检测基因表达。数据分析使用GeneChip操作软件(Affymetrix)和genspring软件版本7.2 (Agilent)进行。

用Versene (Invitrogen Life Technologies)将BEAS-2B细胞分散到单细胞悬液中孵育15分钟。细胞悬浮在含有1.5% BSA的PBS中，然后用pe偶联的小鼠抗人BAFF单抗(克隆:1D6, IgG1;eBioscience)或pe偶联小鼠对照IgG1 Ab(克隆:MOPC-31C;BD pharingen)在4°C的黑暗中放置30分钟。细胞在含0.1% BSA的PBS中洗涤和重悬，并立即使用BD FACSArray生物分析仪(BD Biosciences)进行分析。流式细胞术数据采用FlowJo软件5.6.1版(Tree Star)进行分析。

采用特异性ELISA试剂盒(R&D Systems)检测无细胞上清液中BAFF蛋白的浓度。本试剂盒检出限为31.25 pg/ml。

从LifeSource blood Services获得人类外周血的淡黄色涂层。人PBMC在ficoll -重甲酸钠密度梯度(d= 1.077 g/ml, Ficoll-Paque +;Amersham Biosciences)，根据制造商的说明，从淡黄色涂层。在红细胞裂解后，使用MACS系统(Miltenyi Biotec)和抗cd19 MicroBeads (Miltenyi Biotec)纯化B细胞。制备的cd20阳性B细胞纯度均为>99%。

为了分析分泌BAFF的生物活性，BEAS-2B细胞在无血清DMEM/F12培养基中培养，然后用1000 U/ml IFN-β刺激72 h，上清液用Centriplus YM-10 (Millipore)和Microcon YM-10 (Millipore)浓缩150-200倍。B细胞以2 × 10的密度培养⁵在RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies)中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的96孔平底微量滴度板中，每孔100 μl。5 ng/ml BAFF、10 ng/ml IL-4、10 μg/ml小鼠抗人CD40单抗(克隆:5C3、IgG1;在5 μg/ml对照IgG1、5 μg/ml BAFF-R:Fc和5 μg/ml TACI:Fc存在或不存在的情况下，eBioscience)、浓缩上清液或上述组合孵育5天。为检测细胞内酶活性，最后4 h加10 μl MTT试剂(American Type Culture Collection)孵育。4 h后，各孔中加入100 μl洗涤试剂(美国型培养集)，室温暗箱孵育过夜。用微量滴定板阅读器测量570 nm处的吸光度。

除非另有说明，所有数据均以均数±标准差表示。组间差异分析使用配对学生t测试和被认为是重要的，如果p< 0.05。

越来越多的证据表明B细胞的增殖和分化发生在粘膜表面。为了测试上皮细胞的可能作用，我们首先开始使用基因芯片和实时PCR来确定未受刺激的支气管上皮细胞中B细胞活化TNF超家族配体(如CD40L、BAFF和APRIL)成员mRNA的自发表达。基因芯片在未刺激的BEAS-2B细胞中均未检测到CD40L (ID: 207892_at)、BAFF (ID: 223501_at和223502_at)和APRIL (ID: 229326_at)(数据未显示)。实时荧光定量PCR检测到BAFF和APRIL的mRNA表达，但在静息状态BEAS-2B细胞和静息状态PBEC细胞中表达均很弱(图2)。1，一个而且B)．CD40L mRNA水平低于实时PCR检测限(数据未显示)。

为了评估TLR配体是否诱导CD40L、BAFF和APRIL的表达，用PGN (TLR2配体)、zymosan (TLR2配体)、dsRNA (TLR3配体)、LPS (TLR4配体)、鞭毛蛋白(TLR5配体)、R-848 (TLR7/8配体)和CpG-A (TLR9配体)处理BEAS-2B细胞和PBEC 18 h。n= 4;p< 0.05)(图1，一个)．LPS诱导BEAS-2B细胞BAFF表达无显著增加(4倍;n= 4;p= 0.068)，而TLR 2、5、7/8和9的配体没有效果。相比之下，在BEAS-2B细胞中测试的任何TLR配体都没有诱导APRIL和CD40L的mRNA，即使在刺激长达72小时后(图2)。1，一个数据未显示)。PBEC的结果相似，除了BAFF不被LPS诱导外，而APRIL仅被dsRNA显著诱导(7倍;n= 4;p< 0.05)(图1，B)．PBEC中BAFF mRNA被dsRNA显著上调(224倍;n= 4;p< 0.05)。我们还研究了TLR配体对人原代鼻上皮细胞BAFF和APRIL诱导的影响。dsRNA在人原代鼻上皮细胞中也显著诱导BAFF和APRIL的mRNA表达，这些影响与在PBEC中观察到的效果相同(数据未显示)。由于BAFF的mRNA绝对水平和dsRNA诱导的相对增加高于APRIL，因此我们将研究重点放在BAFF上。最近，已经确定了ΔBAFF，它已被证明是BAFF的天然负调节剂。ΔBAFF是BAFF的剪接亚型，缺少含有57 bp的外显子3 (39，40)．我们用常规的RT-PCR检测了dsRNA诱导BAFF的形式是活性形式还是非活性δ形式。尽管在dsrna处理的BEAS-2B和PBEC中发现了ΔBAFF亚型的表达，但它只是一个次要亚型(图2)。1，C)．为了进一步研究dsRNA诱导BAFF mRNA的细节，我们测定了BEAS-2B细胞中反应的浓度和时间依赖性。当dsRNA浓度低至0.25 μg/ml时，BAFF mRNA被诱导，时间延迟约3 h(图2)。1，D而且E)．

BAFF是一种II型膜蛋白，也是一种可溶性蛋白，由一种假定的furin家族蛋白酶(20.，21，41)．为了证实BAFF蛋白在上皮细胞中的表达，我们使用流式细胞仪检测了BAFF蛋白的细胞表面表达，并使用特异性ELISA检测了BAFF蛋白在培养上清液中的浓度。只有在用dsRNA刺激BEAS-2B细胞后，才能检测到低水平的膜结合BAFF (mBAFF)。2，一个)．相比之下，dsRNA刺激后上清液中检测到显著水平的可溶性BAFF (sBAFF)。baff在BEAS-2B细胞中以时间依赖的方式出现(培养72 h时最多:对照组，检测不到;dsRNA处理后，228±8 pg/ml;n= 3;无花果。2，B)．在PBEC中，dsRNA也强烈诱导sBAFF (72 h培养:对照，检测不到;dsRNA处理，97±15 pg/ml;n= 3;无花果。2C)．这些结果表明，dsRNA刺激气道上皮细胞可诱导BAFF mRNA和BAFF蛋白的显著表达。为了研究BAFF生产的极性，我们使用了transwell系统。融合后，用25 μg/ml dsRNA刺激BEAS-2B细胞48 h，上清液用Microcon YM-10浓缩至100 μl。结果表明，经dsRNA刺激后，气道上皮细胞在单分子层的根尖和底外侧均产生BAFF蛋白(根尖，401±63 pg/ml;基底外侧，234±17 pg/ml;n= 4)。

已发表的研究表明，BAFF在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、护士样细胞、星形胶质细胞和唾液腺上皮细胞中被几种细胞因子诱导，包括IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和G-CSF (15，41，42，43，44，45)．因此，我们研究了细胞因子是否能够诱导BAFF在气道上皮细胞中的表达。将BEAS-2B细胞和PBEC与IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、TNF-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β、G-CSF和GM-CSF孵卵6 h, TNF-α显著上调BAFF的mRNA(6倍;n= 4;p< 0.05)， IFN-β(485倍;n= 4;p< 0.05)， IFN-γ(26倍;n= 4;p< 0.05)，而在BEAS-2B细胞中测试的其他细胞因子则不受影响(图2)。3.，一个)．在PBEC中也得到了类似的结果，除了TNF-α没有明显诱导BAFF(图。3.，B)．IFN-β诱导BAFF(21倍;n= 4;p< 0.05)和IFN-γ(2倍;n= 4;p< 0.05)。3.B)．

在测试的细胞因子中，IFN-β诱导BAFF表达水平最高。因此，我们进一步研究了IFN-β在BAFF mRNA诱导中可能发挥的潜在作用。将BEAS-2B细胞与不同浓度的IFN-β孵育6小时。IFN-β以剂量依赖的方式强烈诱导BAFF mRNA(图2)。4，一个)．令人惊讶的是，IFN-β浓度低至1 U/ml (~ 1 pg/ml)可诱导BAFF表达(图2)。4，一个)．IFN-β对BAFF mRNA的诱导发生得非常快，最快可在IFN-β刺激后1小时(图2)。4，B)．对IFN-β的反应比对dsRNA的反应更快，后者需要3小时才能显现(图2)。1，E而且4B)．这些结果表明IFN-β在气道上皮细胞中是BAFF表达的有效快速刺激因子。

据报道，病毒感染或dsRNA刺激气道上皮细胞也会强烈诱导IFN-β的表达(46，47)．我们检测了dsRNA对上皮细胞IFN-β表达的影响。dsRNA刺激快速而强烈地诱导IFN-β mRNA(图2)。4，C)．如果BAFF对dsRNA的反应是IFN-β诱导的结果，那么抑制蛋白质合成应该阻止BAFF mRNA的表达，而不是IFN-β。用DMSO(载体对照)或蛋白合成抑制剂环己亚胺处理BEAS-2B细胞1小时，然后用dsRNA刺激3小时。环己亚胺显著抑制BAFF mRNA的上调，且剂量依赖。5，一个)．相反，dsRNA对IFN-β mRNA的诱导不受环己亚胺的抑制(图2)。5，一个)．事实上，环己亚胺增强了IFN-β mRNA的诱导，这表明存在一种短暂的或可诱导的IFN-β诱导抑制剂。虽然这些结果并不能证明BAFF的表达次于IFN-β的表达，但它们确实证明了BAFF在这种反应中不是一个即时早期基因，尽管它是快速诱导的。据报道，JAK抑制剂，被称为JAK抑制剂I (JAKI)，可以通过几种JAK家族激酶，包括JAK1, JAK2, JAK3和酪氨酸激酶2 (Tyk2)抑制STAT蛋白的激活(48，49)．已知IFN-β通过IFNAR1和IFNAR2诱导的信号通路涉及JAK1和Tyk2对STAT1和STAT2的激活。为了确定dsRNA对BAFF的诱导是否由IFN-β的自分泌/旁分泌途径介导，我们用DMSO或JAKI处理BEAS-2B细胞1小时，然后用dsRNA刺激6小时。dsRNA对BAFF mRNA的诱导是剂量依赖的，并且被JAKI显著抑制(图2)。5，B)．最后，为了更仔细地研究dsRNA诱导BAFF的机制，我们敲除了ifn信号分子。用siRNA转染BEAS-2B细胞对抗对照RNA、STAT1或IFNAR2，然后用IFN-β和dsRNA刺激6小时。siRNA对抗STAT1和IFNAR2显著抑制IFN-β和dsRNA诱导BAFF，但对照RNA不受抑制(图2)。5C)．这些结果表明，BAFF是由气道上皮细胞中的dsRNA诱导的，并且该反应是通过涉及IFN-β的自分泌/旁分泌途径产生的。

糖皮质激素是治疗以气道炎症为特征的疾病的主要药物，如哮喘、慢性阻塞性肺病和慢性鼻窦炎(50)．我们研究了糖皮质激素是否能够抑制气道上皮细胞中dsrna依赖性BAFF的产生。用DMSO或强效外用糖皮质激素FP处理BEAS-2B细胞2小时，然后用dsRNA刺激18小时。FP显著且剂量依赖性地抑制了BAFF mRNA的诱导(图。6，一个而且C)．为了在蛋白质水平上证实这一现象，我们测量了sBAFF (72 h培养)和mBAFF (24 h培养)的产量。我们发现，在BEAS-2B细胞中，dsRNA对sBAFF和mBAFF的诱导均被FP强烈抑制(图2)。6，D而且E)．在PBEC中，我们分析BAFF的mRNA得到了类似的结果。在PBEC中，FP显著抑制BAFF mRNA的诱导，但抑制程度低于BEAS-2B细胞(图2)。6B)．

据报道，BAFF通过cd40不依赖和T细胞不依赖的途径直接促进B细胞的增殖、细胞存活、CSR和Ig产生(15，19，20.，21，24)．因此，我们使用MTT法研究了上皮细胞来源的BAFF是否能够诱导B细胞存活。我们使用IFN-β处理细胞的上清液进行基于B细胞增殖的功能测定。纯化的人B细胞在存在或不存在IL-4的情况下，用BAFF或浓缩上清刺激5天。有趣的是，对照上皮细胞上清液显著抑制B细胞增殖。与未刺激上皮细胞的上清液相比，IFN-β处理的上清液增加了B细胞的存活率(图2)。7，一个)．为了确定这种效应是否依赖于上皮细胞来源的BAFF，我们使用BAFF- rs、BAFF- r和TACI的Fc融合蛋白来吸收BAFF。IFN-β处理的上皮细胞上清液对细胞存活的增强作用被BAFF-R:Fc和TACI:Fc显著抑制，而对照组IgG1则不受抑制(图1)。7，B)．相比之下，抗cd40依赖和cpg依赖的B细胞增殖不受BAFF-R:Fc或TACI:Fc的抑制。7B数据未显示)。这些结果表明上皮细胞来源的BAFF具有功能活性。

该研究首次直接证明了气道上皮细胞可以产生B细胞激活TNF家族成员BAFF和APRIL(图2)。1而且2)，虽然最近有研究发现唾液腺上皮细胞产生BAFF (45)．BAFF是B细胞的重要调节因子和激活因子，是单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和类护士细胞等髓系细胞的主要产物。在这些实验中，气道上皮细胞产生BAFF的数量(~ 100-200 pg/10⁶细胞)与髓系细胞产生的细胞具有相同的数量级，据报道髓系细胞产生100-500 pg/10⁶72小时培养的细胞(15，41，42，43)．

TLR在连接先天免疫和适应性免疫方面发挥着重要作用，气道上皮细胞已被证明表达功能性TLR，特别是TLR2-6 (6，33，34)．在我们在本研究中测试的TLR配体中，只有TLR3配体dsRNA(病毒RNA和病毒复制的模拟体)能诱导原代支气管上皮细胞中BAFF的表达。BAFF在beas - 2b -永生化细胞系中也被LPS诱导，但在PBEC中没有(图2)。1)．尽管上皮细胞表达TLR4，我们可能期望对LPS有更强的反应，但先前的研究表明，LPS产生IFN-β受血清LPS结合蛋白(37)．此外，由于气道上皮细胞缺乏膜结合CD14，可溶性CD14是LPS激活上皮细胞所必需的(33，51)．在本实验中，我们使用无血清培养基培养原代支气管上皮细胞，以避免成纤维细胞污染。这可能解释了PBEC在LPS刺激后缺乏IFN-β和BAFF的产生。测试的其他TLR配体诱导BAFF表达的失败可能反映了参与各自反应的低水平受体表达或适配器蛋白。

已知IFN-β是一种即时早期基因，即在不需要蛋白质合成的情况下诱导mRNA表达。IFN-β由细菌和病毒PAMPs直接诱导，如LPS、dsRNA、ssRNA和含有CpG基序的DNA，通过tlr依赖或tlr不依赖的信号传导(37，38，52，53，54)．IFNARs由两个亚基IFNAR1和IFNAR2组成，分别与JAK家族的成员有关，特别是Tyk2和JAK1 (52，55，56)．IFN-β激活与IFNAR相关的JAKs可导致STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化。这导致了STAT1-STAT2-IFN调节因子9复合物的形成，即ifn刺激基因因子3，以及STAT1-STAT1同型二聚体的形成。这些复合物转运到细胞核，结合到IFN刺激的反应元件(在IFN刺激的基因因子3的情况下)和IFN-γ激活位点(在STAT1同型二聚体的情况下)在相关基因的启动子区域，并启动基因转录(52，55，56)．在本研究中，多项证据表明IFN-β在dsRNA诱导BAFF中发挥了关键作用:1)dsRNA诱导IFN-β的表达比诱导BAFF的表达更快(图2)。1，E而且4，C）;2)添加IFN-β诱导BAFF的速度比dsRNA诱导BAFF的速度更快(图2)。4，B）;3)环己亚胺对蛋白质合成的抑制降低了dsRNA对BAFF的诱导，这表明它是间接的(图)。5，一个）;4) JAKI对JAK激酶的抑制抑制了dsRNA对BAFF的诱导。5，B）;5) siRNA敲低STAT1和IFNAR2显著抑制dsRNA诱导BAFF(图。5C)．综上所述，这些结果表明dsRNA诱导IFN-β的表达，进而激活BAFF的表达。虽然这一机制已在其他IFN靶基因中得到证实(52)，尚未发现dsRNA对BAFF的诱导作用。Litinskiy等人(15)研究表明，IFN-α、IFN-γ和LPS刺激后，人树突状细胞和单核细胞上调BAFF和APRIL;然而，他们还没有描述其机理。这表明dsRNA和其他诱导IFN的PAMPs诱导BAFF表达可能是IFN-α或IFN-β表达的次要效应。

据报道，sBAFF是由一种假定的furin家族蛋白酶裂解而形成的膜结合形式，或由同一酶在细胞内进行较长形式的加工而来(20.，21，41，42)．在气道上皮细胞中，dsRNA产生saff是时间依赖性的(图2)。2)．相反，mBAFF的表达在刺激后12-24小时达到峰值。2数据未显示)。dsRNA产生sBAFF完全被一种特定的呋喃转化酶抑制剂癸酰-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-氯甲基酮(42)，在BEAS-2B细胞中(数据未显示)。在我们的GeneChip分析中，在BEAS-2B和原代上皮细胞中检测到Furin mRNA (ID: 201945_at)(数据未显示)。这些结果表明，saff在气道上皮细胞中的产生机制可能与骨髓细胞中的产生机制相似。

BAFF是B细胞生存因子，是B细胞增殖和Ab分泌的共刺激因子。最近，Gavin et al. (39，40)在小鼠和人类中都发现了BAFF的剪接亚型ΔBAFF。人类和小鼠的ΔBAFF转录本分别不含3号和4号外显子。ΔBAFF可能与BAFF的作用相反，因为ΔBAFF转基因小鼠成熟B细胞数量显著减少，而BAFF转基因小鼠成熟B细胞数量增加(40)．ΔBAFF亚型可在人类骨髓细胞中检测到，但它是一种次要亚型(39)．在气道上皮细胞中，ΔBAFF亚型存在并被dsRNA诱导，但它只是一个较小的亚型(图。1C)．未来的研究需要确定上皮细胞是否产生ΔBAFF蛋白。

功能分析表明，IFN-β处理的BEAS-2B细胞浓缩上清通过部分涉及BAFF的机制刺激B细胞增殖和/或存活。尽管未受刺激的BEAS-2B细胞的上清液抑制了B细胞的存活，但仍观察到这种活性(图2)。7，一个)．在IFN-β处理过的上清液中发现的细胞诱导活性可能是由于BAFF抑制了与BAFF- rs特异性融合蛋白(BAFF- r:Fc和TACI:Fc)的反应，而不是对照IgG1(图1)。7，B)．BAFF-R:Fc和TACI:Fc不抑制cd40依赖的增殖和/或细胞存活，建立特异性(图4)。7B)．这些结果表明，由dsRNA-和IFN-β-刺激的气道上皮细胞产生的BAFF具有功能性活性。未受刺激的BEAS-2B上清液中发现的抑制活性的身份值得进一步研究。

我们研究了糖皮质激素是否可以抑制dsrna依赖性BAFF的产生，因为糖皮质激素广泛应用于炎症性气道疾病的治疗管理。人体实验表明，糖皮质激素可抑制过敏个体气道和血清中IgE的季节性增加(57，58)．普遍的观点是糖皮质激素通过抑制诱导CSR的细胞因子如IL-4和IL-13的产生来实现这些作用，因为体外B细胞反应对糖皮质激素具有耐药性。如图所示。6在BEAS-2B细胞中，有效的外用糖皮质激素FP显著抑制了dsRNA对BAFF mRNA和BAFF蛋白的诱导。PBEC中dsRNA诱导的BAFF mRNA表达也被FP抑制(图2)。6B)．糖皮质激素是否能抑制体内BAFF的诱导还有待进一步的临床研究。

局部活化的B细胞增殖，CSR和Ab生产可能是非常重要的呼吸道免疫病原体。在哮喘中，疾病恶化通常由呼吸道靶向病毒感染引发，特别是鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和腺病毒(59，60，61)．局部组织对病毒快速有效的局部Ig反应的能力在限制病毒诱导的组织损伤的程度和严重程度方面很可能是重要的。经证实，在鼻腔接触过敏原或柴油机尾气提取物后，气道黏膜会出现IgE和活化诱导胞苷脱氨酶(CSR的重要调节因子)的种系转录本和切除环的局部表达(9，10，11，62，63)．B细胞簇见于鼻黏膜固有层(11，64)．表达ige的B细胞和浆细胞在固有层中可见，但在上皮中没有(64)．过敏患者的支气管灌洗液和鼻腔灌洗液中也含有IgA和IgE (65，66)．呼吸道和鼻黏膜中的ag特异性IgE水平通常比血清中高得多(65，66，67)．因此，局部CSR和B细胞的激活可能是疾病发病机制和病原体保护的重要事件。我们的数据表明，BAFF蛋白在培养的上皮细胞的顶端和基底外侧都能检测到。我们的结果表明，气道中B细胞的局部激活可能部分依赖于BAFF和APRIL的上皮生成。在炎症性肺部疾病中，激活的气道上皮细胞产生趋化因子，招募许多能够产生I型IFN的细胞类型，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(50，68)．这些被招募的细胞直接产生ifn，当受到PAMPs和细胞因子刺激时，也通过涉及ifn的自分泌途径产生BAFF (15)．在体内，浸润炎性细胞产生IFN可激活上皮细胞产生BAFF。

最近，Sutherland等人(69)的研究表明，BAFF转基因小鼠抑制了ova诱导的过敏性气道反应，包括减少BALF中的嗜酸性粒细胞和气道和肺血管周围的浸润白细胞。Sutherland等人的研究(69)表明，高水平的全身BAFF改变了T细胞归巢到气道，而不是T细胞启动或B细胞反应。针对气道中BAFF产生的研究将是必要的，以确定肺部或上呼吸道中产生的局部BAFF是否对局部B细胞反应有意义。在另一项临床研究中，我们在鼻刮痧上皮细胞中检测到BAFF和APRIL的mRNA，并发现慢性鼻窦炎患者的鼻组织提取物和鼻洗液中BAFF蛋白的表达增加(a . Kato, a . T. Peters, R. Kern, D. Conley, L. C. Grammer和R. P. Schleimer，手稿正在准备中)。

总之，我们在本研究中报道了气道上皮细胞产生B细胞激活因子BAFF和APRIL。我们的研究结果表明，BAFF是由气道上皮细胞中的细胞因子和dsRNA诱导的，而对后者的反应是由ifnar介导的IFN-β的自分泌/旁分泌途径引起的。上皮细胞产生BAFF和APRIL可能有助于气道内B细胞的局部积累、激活、CSR和Ig合成。

我们感谢博士。西北大学范伯格医学院的Marianna Kulka、Ning Zhang和Brian Tancowny为流式细胞仪、实时PCR和PBEC制备提供技术建议。我们感谢Anne Jedlicka和约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院疟疾研究所基因阵列核心设施在基因阵列实验中发挥的作用。

Schleimer博士收到所有吸入糖皮质激素主要制造商的酬金，包括GlaxoSmithKline，丙酸氟替卡松制造商。