保护链球菌引起的肺炎感染c反应蛋白和天然抗体需要补充而不是Fcγ受体¹

老鼠缺乏个人Fcγ受体的发展提供了一个关键的工具理解这些受体的角色在炎症、自身免疫和宿主防御(1)。老鼠缺乏货代γ-chain缺乏FcγRI FcγRIII以及FcεRI (2)。γ-chain-deficient老鼠和老鼠缺乏FcγRIII免疫复合物减少间隙,减少炎症反应,免疫复合物和保护Ab-mediated自身免疫性疾病(1,3)。相比之下,FcγRIIb-deficient老鼠通常有增强Ab反应和对自身免疫性疾病的易感性增加(1,4,5,6)。FcγR防止感染的作用研究在有限程度上与不同的结果取决于病原体。被动保护老鼠IgG1 Ab对新型隐球菌减少在γ-chain-deficient老鼠(7),而被动防范疟疾显然FcγR-independent (8)。相反,FcγR需要在皮肤利什曼病的小鼠模型,建立感染FcγR提供手段入侵的寄生虫(巨噬细胞的9)。

链球菌引起的肺炎是一个重要的病原体的罪魁祸首是人类和社区获得性肺炎(10,11)。这种疾病的临床重要性增加了抗生素耐药菌株的进化(12)。很年轻,很老的人最容易全身感染,尽管保护anti-capsular Ab可产生免疫接种后,先天免疫反应显然是重要的在控制感染多发地主机。先天抵抗系统性感染肺炎链球菌在老鼠身上也已经有了很广泛的研究。天然的Abs T15个体基因型,将胆碱磷酸(PC)³一半的肺炎球菌细胞壁C-polysaccharide (PnC),保护(13)。这些自然生产Abs正常肠道菌群和来自一个生殖系V_H基因(V_H1)(14)。老鼠缺乏这些保护anti-PC Abs的结果xid突变(13),新生儿抑制anti-T15治疗(13,15),或有针对性的基因删除的V_H1基因(16)都有易感性增加肺炎链球菌感染。IgM T15-idiotype-positive马伯,IgG2a, IgG2b, IgG3同形像可以被动保护小鼠免受感染(17,18)。所有的防护Abs激活补体18,19)。然而,免疫球蛋白Abs 10倍的保护比IgM Abs暗示作用FcγR (20.)。

c反应蛋白(CRP)是一种急性期反应物以其经历与PnC calcium-dependent交互的能力。被动CRP保护小鼠免受管理的示范美国肺炎感染了c反应蛋白在宿主防御的作用15,21)。最近,小鼠转基因对人类c反应蛋白被发现从肺炎球菌感染以及保护沙门氏菌血清感染(22,23)。c反应蛋白激活补体经典(24)和补充的重要性CRP-mediated宿主防御研究(19,25,26)。这些研究的结果表明,在肺炎球菌感染涉及补体依赖和complement-independent CRP保护机制。拟议中的CRP保护机制肺炎链球菌感染是调理素作用的细菌通过c反应蛋白和补充吞噬作用和杀戮。识别FcγR作为c反应蛋白的受体在白细胞可以检查c反应蛋白的相对直接交互的角色FcγR和c反应蛋白激活补充预防肺炎球菌感染(27,28)。本研究的目的是检验在防范系统性FcγR和补充的作用肺炎链球菌感染c反应蛋白和anti-PC Ab。

人类CRP被亲和纯化从胸膜液体,凝胶过滤,离子交换色谱法(如前所述)(29日)。CRP准备的纯度由12.5% sds - page对重载和正常样本。凝胶是沾染了一个敏感的银染色。没有乐队除了主要25 kDa CRP乐队。具体地说,没有见过污染由免疫球蛋白。PC-BSA是根据Chesebro和Metzger的方法(30.)。摩尔耦合比PC BSA是15:1。

FcγRIIb-deficient (4和货代γ-chain-deficient老鼠2)在退伍军人事务部的统计,动物饲养设施(阿尔伯克基海里)从增殖对购买杰克逊实验室(巴尔港,我)。γ-chain缺陷小鼠不表达FcγRI FcγRIII或FcεRI。FcγRIIb和FcγRIII-deficient (3)小鼠缺乏个人只受体表达。FcγRIII-deficient老鼠和控制老鼠(B6×129 f₂和C57BL / 6)年龄和sex-matched缺乏的老鼠从杰克逊实验室购买。B6×129 f₂小鼠作为控制γ-chain FcγRIIb-deficient老鼠。C57BL / 6小鼠作为控制FcγRIII-deficient老鼠。C3 - (31日)和C4-deficient (32)老鼠繁殖杂合的增殖对购自杰克逊实验室。老鼠的基因通过使用提供的引物序列PCR杰克逊实验室和homozygous-deficient和纯合子的野生型老鼠相同的殖民地。老鼠之间使用7和12周的年龄。雄性和雌性老鼠使用。男性和女性的数量控制和缺陷小鼠匹配在每个实验中,男性和女性在每个实验治疗组之间平均分配。没有明显的性别对结果的影响的实验。所有实验过程涉及动物的机构审查委员会批准的退伍军人事务医学中心(阿尔伯克基纳米)。

肺炎链球菌3 (Pn3)血清型2型和R36A (nonencapsulated变体肺炎链球菌)从美国购买类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。Pn3通过小鼠毒性和存储保持在通道−80°C。一个或两个殖民地在一夜之间从一个血琼脂板被接种到Todd-Hewitt汤含有0.5%的酵母提取物和成长记录的阶段。Pn3估计浓度的吸光度在600海里。Pn3稀释的盐水和输液注入retro-orbital丛的老鼠在0.1毫升。板计数剂被用来确定CFU注射。表明,c反应蛋白是通过侧注射输液retro-orbital丛Pn3前15分钟。死亡率是衡量7天无一例死亡发生在感染后4天。

小鼠腹腔注射接种的5×10⁷heat-killed R36A描述(33),7天后的挑战。老鼠枯竭的补充治疗眼镜蛇毒因子(CVF (眼镜蛇眼镜蛇kaouthia);圣地亚哥Quidel CA)如前所述(34)。补损耗是由三个ip注射4 U CVF每隔12 h开始研究前36小时。

小白鼠注射在左retro-orbital丛∼5×10⁴CFU Pn3于0.2毫升的生理盐水。收集血液样本(50μl)从右边retro-orbital丛在毛细管吸量管1分钟,1 h,和4 h,镀在PBS稀释血琼脂平板上。CFU /鼠标恢复计算从血液计数和体重。

Anti-PC和anti-DNP Ab水平从控制和缺陷小鼠血清ELISA测定。Immulon II微量滴定板(弗吉尼亚州亚历山德里亚Dynatech实验室)被涂上一层5μg /毫升PC-BSA(共轭在我们实验室)或DNP-BSA (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)、洗涤、封锁,和孵化的1/50稀释血清进行测试。盘子是用生物素化的isotype-specific Abs老鼠免疫球蛋白,IgA,和IgM (Caltag实验室、伯林盖姆、CA), HRP-conjugated链霉亲和素,和衬底(3、3′,5、5′tetramethylbenzidine;BD生物科学,圣地亚哥,CA)。吸光度是阅读在450海里。

图形和统计分析使用GraphPad棱镜软件(CA)圣地亚哥。生存曲线绘制了卡普兰和迈耶的方法和比较的生存率较(Mantel-Haenszel测试)。这种分析考虑死亡的时间以及老鼠生存的绝对数量。在结果,“保护”一词表明显著提高生存。

c反应蛋白结合FcγRI和FcγRIIb鼠标白细胞(27)。CRP的调理素的活动需要FcγRI,不在从γ-chain-deficient小鼠吞噬细胞(35)。因此,γ-chain-deficient老鼠用于确定CRP与吞噬FcγR交互作用的保护肺炎链球菌感染。B6×129控制老鼠和γ-chain-deficient老鼠注射0,100,或200μg CRP和Pn3和生存的测量(图7天。1)。CRP在野生型老鼠提供了防止杀伤力,增加生存从没有c反应蛋白的20% > 85%小鼠注射200μg CRP。CRP在γ-chain-deficient提供部分保护小鼠,增加生存缺乏CRP的0%到50%小鼠注射200μg CRP。

确定CRP-mediated保护需要补充,野生型和γ-chain-deficient老鼠CVF挑战(图。2天前处理1),然后200μg CRP和Pn3。所有的complement-depleted老鼠死于感染,尽管注入CRP。这些结果表明,在该模型中,CRP-mediated保护需要补充提供的补充,可以独自在FcγR的缺失。

肺炎链球菌激活补体旁路在c反应蛋白的缺失,但主要经典激活途径的c反应蛋白(36,37)。CVF-treated老鼠缺乏的主要补充调理素(C3b和iC3b)生成的所有通路的激活。CRP未能防止Pn3 CVF-treated老鼠可能是由于要么要求c反应蛋白的激活经典途径或组合的替代途径激活细菌和c反应蛋白的直接调理素作用。C3 - C4-deficient老鼠被用来区分这些可能性。C3-deficient老鼠是类似于老鼠缺乏CVF-treated C3b iC3b。C4-deficient只老鼠缺乏经典的途径。两株小鼠非常容易感染Pn3和没有保护到100年μg CRP(无花果。2)。这些结果表明,CRP-mediated保护Pn3需要经典的途径。先天免疫Pn3也减少了在C3 -和C4-deficient老鼠如图所示的缺陷小鼠的死亡率比野生型老鼠在c反应蛋白的缺失。没有额外的替代途径的作用是明显的生存曲线没有区别在C3 -和C4-deficient老鼠在c反应蛋白的存在与否。

需要γ-chain表达和信号通过FcγRI FcγRIII,这两种调解吞噬作用(2)。绑定和功能研究表明,c反应蛋白结合FcγRI FcγRIIb。FcγRIIb是nonphagocytic受体淋巴细胞和吞噬细胞上发现的。老鼠缺乏FcγRIII或FcγRIIb被用来确定这些受体的角色CRP-mediated保护。为FcγRIII FcγRIIb-deficient老鼠,c反应蛋白提供了几乎完整的保护从感染(无花果。3,一个)。生存曲线FcγRIII之间没有显著差异,FcγRIIb-deficient老鼠和控制老鼠注射CRP。此外,无论是FcγRIII——还是FcγRIIb-deficient老鼠Pn3感染的易感性增加的γ-chain-deficient老鼠(图。3,B)。不同野生型菌株(C57BL6)是用作控制应变FcγRIII-deficient老鼠。C57BL / 6小鼠生存没有不同于B6×129只老鼠没有CRP(无花果。3B)。C57BL / 6小鼠生存后CRP治疗和Pn3感染没有明显不同于B6×129只老鼠的生存以同样的方式对待(没有显示)。

在上述实验中,很明显,γ-chain——complement-deficient老鼠比野生型老鼠更容易受到感染。这是明显的生存时间和百分比生存(无花果。1和2)。的生存曲线FcγRIII-deficient FcγRIIb-deficient, B6×129和C57BL6小鼠注射700 CFU没有显著不同(图。3,B)。Complement-deficient老鼠已报告更容易感染(31日),但据我们所知γ-chain-deficient老鼠没有(1)。进一步比较野生型之间的对感染的易感性和γ-chain-deficient老鼠,减少剂量的Pn3注入。近40%的野生型小鼠存活挑战70 CFU和50%幸存下来的挑战7 CFU Pn3(无花果。4)。没有γ-chain-deficient老鼠甚至Pn3的最低剂量存活了下来,虽然存活时间延长(20.5 - h平均生存17.5和7 CFU - h平均存活小鼠感染70 CFU)。的野生型小鼠平均存活时间为72.5 h小鼠感染70 CFU。在每个剂量的细菌,野生型老鼠之间的生存曲线的差异和γ-chain-deficient老鼠是重要的p< 0.0001的水平。

γ-chain-deficient小鼠肺炎球菌感染易感性的增加表明角色先天免疫的免疫球蛋白。自然Abs电脑已被证明提供保护肺炎链球菌(13)。因此,anti-PC Abs控制的水平和γ-chain-deficient老鼠测量。令人惊讶的是,γ-chain-deficient小鼠IgM anti-PC Abs水平显著低于野生型小鼠(无花果。5,一个;p= 0.032)。这不是自然的普遍缺陷Abs, IgM水平和免疫球蛋白Ab DNP在γ-chain-deficient正常老鼠(图。5B)。非常低水平的免疫球蛋白g anti-PC Abs被发现在野生型和γ-chain-deficient老鼠,和IgA anti-PC在血清中无法从压力。IgM anti-PC Ab C57BL / 6小鼠水平和FcγRIIb-deficient老鼠类似IgM anti-PC Ab B6×129只老鼠和水平高于γ-chain-deficient老鼠(没有显示)。所有的菌株的老鼠被安置在同一个房间和FcγRIIb-deficient小鼠饲养设施一样γ-chain-deficient老鼠。

确定γ-chain-deficient老鼠缺乏电脑的反应能力,与单个注入小鼠免疫heat-killed nonencapsulated肺炎链球菌,R36A。免疫与R36A导致anti-PC Abs峰值出现在7天(33)。IgMγ-chain-deficient老鼠产生高水平和低水平的免疫球蛋白g anti-PC Abs免疫接种后(图。6)。这些Ab水平相当于免疫B6×129只老鼠。此外,免疫γ-chain-deficient老鼠70 CFU免受感染肺炎链球菌(无花果。7,一个)。免疫介导了Ab和补充,因为损耗的补充CVF之前感染废除保护(无花果。7一个)。

保护系统肺炎链球菌感染与间隙的细菌从血液里由肝脏和脾脏(18,26)。确定Ab和补充的作用清除细菌,γ-chain-deficient老鼠注射Pn3和可行的测量血液中的细菌在未来4 h(无花果。7B)。Pn3多发地γ-chain-deficient老鼠并不清楚。γ-chain-deficient小鼠免疫清除的细菌开始1 h,这是消除老鼠CVF耗尽的补充治疗。这些结果表明,γ-chain-deficient老鼠可以免受感染Pn3 anti-PC Ab和CRP和调理素,也需要补充。γ-chain-deficient老鼠的易感性增加肺炎链球菌来自缺乏自然Abs电脑,而不是从FcγR-mediated间隙函数在感染的失败。

结果提出了以下有助于我们理解先天免疫肺炎链球菌。第一,天生的调理素、CRP和自然anti-PC Ab,都需要补充有效保护小鼠免受致命的肺炎球菌菌血症。第二,c反应蛋白和anti-PC Ab要求FcγR保护小鼠免受感染。第三,γ-chain-deficient老鼠死于非常敏感肺炎链球菌感染。增加易感性明显的失败结果γ-chain-deficient老鼠产生保护性PC-specific Abs自然肠道免疫原的反应。

c反应蛋白的保护作用已经描述肺炎球菌菌血症(15,21,23)。在以前的研究中,补充消耗减少,但并没有消除c反应蛋白的保护作用(19,25),建议直接调理素作用CRP可能扮演一个角色。CRP的白细胞受体最近被我们实验室FcγR (27,28,38,39)。c反应蛋白结合FcγRI和FcγRII人类和小鼠白细胞。在鼠标,FcγRII nonphagocytic受体,c反应蛋白的直接调理素的活动需要γ-chain-associated受体FcγRI (35)。因此,γ-chain-deficient老鼠缺乏吞噬受体c反应蛋白,可以用来测试的角色直接调理素作用的c反应蛋白免受感染。CRP在γ-chain-deficient保护小鼠,这表明c反应蛋白绑定FcγRI不需要保护。需要补充。以前的研究(19,25)观察CRP complement-depleted小鼠的保护作用。然而,这种效应并没有观察到在当下研究使用高毒性Pn3。因此角色FcγR CRP在肺炎链球菌感染的保护作用在缺乏补充无法评估。本文在回顾时,据报道,c反应蛋白表达的转基因菌血症降低货代γ-chain-deficient后小鼠肺炎球菌感染(40)。这些发现与本研究中给出的数据一致。然而,这些研究没有评估生存。

一些感兴趣的是,老鼠c反应蛋白表达在低水平在老鼠和略有增加的急性期反应水平∼2 - 3μg /毫升。但是目前尚不清楚这些攻击是否低水平的CRP有助于自然保护肺炎链球菌感染。然而,这些老鼠比老鼠更抗感染给人类CRP表明小鼠CRP是次要的。主要急性期反应物的鼠标,血清淀粉样蛋白P组件,未能防止老鼠肺炎链球菌感染(21)。

相对需求替代和古典的补体激活途径CRP-mediated保护检查。Complement-deficient老鼠特别容易感染,没有保护的c反应蛋白。通过比较C3-deficient老鼠,缺乏调理素作用通过所有通道,和C4-deficient老鼠,只缺少经典途径,这些研究表明,经典途径激活的CRP需要保护。CRP只有通过经典途径激活补体,增加C3b和iC3b的数量肺炎链球菌(37,41)。C4 CRP-mediated保护的要求表明,补体激活了CRP是至关重要的,而不是合作CRP和补体沉积在细菌通过另一种途径。C4的要求也表明,c反应蛋白调节补体激活的招聘因子H不是最重要的,因为这个函数的c反应蛋白不需要经典的途径(36)。

γ-chain-deficient老鼠的抵抗力降低肺炎链球菌是意想不到的。尽管FcγR在炎症反应的重要性,这些受体缺陷,与补充不足,没有通常伴随着增加对感染的易感性多发地主机(1)。一个之前报道的宿主防御缺陷在这些老鼠是一个被动的腹肌无力保护小鼠免受新型隐球菌感染(7)。另一项研究表明自然没有缺陷对流感病毒感染的敏感性却发现免疫γ-chain-deficient老鼠不受感染,尽管正常Ab反应(42)。

有几个可能的机制,增加对感染的易感性γ-chain-deficient老鼠。似乎可能的老鼠可能缺乏间隙的细菌由于缺少FcγRI或FcγRIII。FcγRIII-deficient老鼠没有显示增加对感染的易感性。这建议假设抗感染通常由自然免疫球蛋白Abs,针对细菌Ags与FcγRI交互。这也符合先前的调查结果,被动管理免疫球蛋白anti-PC Abs在剂量低于保护IgM anti-PC Absxid老鼠(18)。

令人惊讶的是,这个缺陷在γ-chain-deficient老鼠PC-specific IgM的水平降低有关。水平的免疫球蛋白和IgA anti-PC Abs控制和γ-chain-deficient老鼠非常低。没有水平的差异anti-DNP Abs菌株表明减少之间并不是一个普遍缺乏自然Abs。减少IgM anti-PC也与繁殖条件,因为FcγRIIb-deficient老鼠相同的设施Ab正常水平。Ab降低个人电脑并不是由于无法应对PnC, IgMγ-chain-deficient老鼠产生实质性的水平和免疫球蛋白anti-PC Abs与R36A免疫反应。γ-chain-deficient小鼠免疫保护肺炎链球菌感染9 10 70 CFU Pn3老鼠生存挑战。因此,γ-chain-deficient老鼠能够产生PC-specific防护Abs,和FcγR并不需要这种Abs是有效的。保护免疫γ-chain-deficient老鼠被补体依赖,因为它消除了CVF前处理的挑战。

小说,还不完全理解的发现是“自然”的下降水平Abs, PCγ-chain-deficient老鼠。众所周知,这些Abs的发展依赖于演讲的Ags肠道菌群的细菌不出现在无菌的老鼠(14)。缺乏自然Absγ-chain-deficient老鼠显示一个缺陷在表示这些Ags免疫系统。唯一γ-chain-associated受体被卷入FcγRI Ag)表示。针对Ag)这个受体增强演示Ag-specific T细胞(通过100 - 1000倍43)。缺陷小鼠的研究表明,FcγRI,但不是FcγRIII或FcεRI,要求加强对免疫复合物的反应(44)。尽管多糖Ags没有要求演示T淋巴细胞,它最近表明,树突细胞脉冲R36A诱导T cell-dependent anti-PC响应(45)。因此,一个可能的解释为减少自然Ab水平是降低目前的Ags的能力。这些老鼠显然是能够对电脑所展示的免疫反应引起的反应R36A免疫研究中所示。然而,在次优的Ag) FcγRI可能重要的角色。直接FcγRI的重要性,而不是其他γ-chain-associated受体,将在将来的研究中得到解决使用老鼠特别缺乏FcγRI。

总之,这些发现支持了核心作用的补充保护小鼠免受肺炎球菌菌血症。补充的作用是清除细菌通过opsonophagocytosis (46)。尽管Ab和CRP可以与Fcγ受体相互作用,在保护他们的角色从这个病原体可能是次要的。

我们感谢Clifford博士Qualls(新墨西哥大学)统计分析的建议。我们还要感谢迈克尔·卡罗尔博士(哈佛大学、波士顿,MA)建议在C3 - pcr和C4-deficient老鼠。