TGF-β1诱发进步胸膜疤痕和胸膜下纤维化¹

胸膜纤维化可导致严重的限制性肺疾病。它通常被认为是其他疾病的并发症包括胸腔。肺炎、parapneumonic积液、积脓症、肺结核和石棉胸膜纤维化是最常见的原因(1)。此外,许多药物可以导致胸膜纤维化的发展,最著名的是麦角药物,抑制细胞生长的代理和胸辐照(参考文献。2和3和www.pneumotox.com(“药物引起的肺部疾病”))。其他潜在的原因是全身性结缔组织疾病,血胸,进步postthoracotomy冠状动脉旁路手术后疤痕(4)。根据疾病的严重程度、胸膜纤维化可以影响呼吸功能,显著影响生活质量,并且可以与高发病甚至死亡。没有有效的疗法反向建立胸膜纤维化。

胸膜是一个新陈代谢活跃的膜参与维持一个动态稳态胸腔内的流体。体内平衡是重要的机械性能的胸壁和肺,和崩溃的液体平衡最终会导致胸腔积液和纤维化(5,6)。胸膜纤维化可以被定义为矩阵组件的过度沉积导致的破坏常规胸膜组织架构。疾病可以表现为离散局部病变(胸膜斑)或弥漫性胸膜增厚(5)。大多数相关研究胸膜疤痕肋膜担忧的感应的方法治疗慢性积液与转移癌(7)。动物研究表明,TGF-β肋膜起到了积极的作用以及胸膜液体形成(8,9,10,11,12)。

TGF-β是一种多功能细胞因子极度参与肝纤维化的发病机制通过其强大的影响纤维母细胞分化、细胞外基质形成(13,14),epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)³(15)。腹膜间皮的细胞可能进行间充质转化(16,17),TGF-β1基因转移到腹膜间皮导致腹膜纤维化与mesothelial-to-mesenchymal转变的证据或“mesothelial-fibroblastoid转换”(MFT) (18)。

在这项研究中,我们使用了瞬态转移的活动TGF-β1基因运载体的胸膜腔和间皮。我们证明此方法诱发同质、长期和进步肋膜胸膜纤维化没有,与严重的肺功能障碍有关。这个新模型的胸膜纤维化将使我们能够更好地理解进步纤维发生的机制,并探讨小说在胸膜腔antifibrotic疗法。我们进一步证明胸膜纤维化,通过一个过程涉及建议可以扩展到内脏的肺实质层,但不是成壁的肌肉层,表明一个独特的当地环境需要进步组织纤维化反应。

我们使用AdTGF-β1^223/225的腺病毒构建突变TGF-β1自发转化为生物活性TGF-β1,AdLacZβ-galactosidase(编码),和AdDL(控制向量)没有插入删除E1地区所描述的实验。运载体的建设是其他地方的详细描述(19,20.)。

女性Sprague-Dawley老鼠(查尔斯河实验室)重200 - 225克被安置在特殊无菌条件。啮齿动物实验室能够随意提供食物和水。动物根据治疗指南的Ministè再保险de la矫揉造作的et de la Technologie(法国巴黎)。所有动物程序进行与异氟烷吸入麻醉(TEM)。总共1.3×10⁹空斑形成单位的AdTGF-β1、AdLaCZ或执行卷800μl AdDL氯化钠0.9%,没有任何手术,由右侧胸膜腔内注射(第六空间)20 g针,动物在左侧卧位的位置。为共同实验中,大鼠,800年μl 0.9%氯化钠,1×10⁹空斑形成单位AdLacZ + 1.3×10⁹空斑形成单位AdTGF-β1或1×10⁹空斑形成单位AdLacZ + 1.3×10⁹空斑形成单位AdDL。老鼠安乐死腹部大动脉出血天4、7、14、21日和64年后adenoviral管理。通过隔膜后小切口,2.5毫升的0.9%生理盐水注射在胸腔的空间。胸腔灌洗液(PLF)检索与1 ml针和维护在冰上,直到进一步的处理。一个导管置于气管,肺被全体和支气管肺泡灌洗(BAL)如前所述执行(21)。6毫升0.9%氯化钠慢慢注入气管内的,检索和维护在冰上。肺是通过导管连接到一个列满4%福尔马林的恒压20厘米H₂O 10分钟。福尔马林的总量要求增加肺部被认为是肺总量的估计。肺、隔膜和胸壁放在4%福尔马林24 h。

PLF和平衡液(BALF)离心机在2500 rpm 15分钟。细胞碎片颗粒去除后,上层清液储存在−80°C,直到进一步的使用。丸是resuspended 1毫升0.9%氯化钠。Cytospins(200μl, 300 rpm, 2分钟)进行cytocentrifuge (Cytospin 4;热Shandon)和彩色染色(Sigma-Aldrich)微分细胞计数。

活跃TGF-β1决心从BALF和PLF上层清液使用酶联免疫试剂盒对人类TGF-β1(研发系统),根据制造商的建议执行。这个试验的敏感性是7 pg / ml。

细胞化学的染色为β-galactosidase进行样品从四个动物获得每个时间点AdLacZ胸膜腔内注射后,AdLacZ + AdTGF-β1,或者AdLacZ + AdDL。1 h后固定剂(2%甲醛/ 0.2%戊二醛),新鲜组织样本染色6 h在溶液中含有亚铁氰化物钾,钾铁氰化物,氯化镁,特里同x - 100和5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside(半乳糖苷;Sigma-Aldrich)。样本存储在70%的乙醇,然后paraffin-processed和嵌入。Five-micrometer部分与核快速复染色红如前所述22)。

肺的横向部分石蜡包埋,5-μm分段,沾着他走时,Masson-Trichrome Picrosirius红或加工胶原蛋白和热休克蛋白(HSP) 47免疫组织化学。主要Abs是一个鼠标单克隆(COL-1) colligin-I (Abcam)和一只老鼠anti-HSP47 colligin马伯(Stressgen;TebuBio);分别二级Abs是一只山羊anti-mouse免疫球蛋白生物素共轭(Chemicon国际)和生物素化的山羊anti-mouse /兔子搞笑(DakoCytomation)。后过氧化物酶抑制(PBS + H₂O₂,20分钟),组织部分被孵化与主Ab(1/50稀释为胶原蛋白我和1/500稀释HSP47,一夜之间在湿度室4°C)。组织部分被孵化与二级Ab(1/500稀释collagen-I和1/250稀释HSP47, 1 h)。streptavidin-HRP复杂(DakoCytomation)应用(1/300稀释collagen-I和1/500稀释HSP47)在室温下45分钟。3-Amino-9-ethylcarbazole /过氧化氢作为发色体衬底。幻灯片和苏木精复染色。的目的是尽可能远离的胸膜腔内注射部位,我们总是用左肺组织学和形态学分析。

双重染色与Absα-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)和细胞角蛋白使用荧光标记Abs进行。在沸腾Ag)检索后10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)45分钟,部分是孵化α-SMA Ab (DakoCytomation)其次是次要兔子anti-mouse Ab贴上德克萨斯红(分子探针)。部分被沾FITC-labeled Ab pancytokeratin (Sigma-Aldrich)和安装4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI)核染色(Vectashield;向量的实验室)。负控制immunofluorescent染色进行了使用IgG2a (DakoCytomation)控制Ab代替anti-α-SMA或正常山羊血清代替anti-pancytokeratin。这些部分被认为与徕卡DMR荧光显微镜(徕卡微系统)。

胸膜厚度测量通过histomorphometric测量肺部分沾Masson-Trichrome(200次)。25个随机措施/肺部分得到每个动物使用一个Eclipse E600显微镜(尼康)。视频图像被抓获3 CCD彩色摄像机(索尼/尼康)和分析使用一个图像分析系统(Archimed;维视仪器)。

胶原蛋白量分析在石蜡切片沾Picrosirius红(20次)如前所述(23,24)。简单地说,25个随机领域对于每个动物在偏振传输数字化照明。排放的量化比例(从Histolab形态测量学软件/维视仪器)反映胶原蛋白百分比。胶原蛋白层强度是衡量在一个矩形由一个常数(200μm)长度,宽度根据胸膜厚度。胶原蛋白含量的百分比表示为发射乘以每个矩形的表面。肺实质内胶原蛋白量测量使用圆圈随机处理以恒定的距离胸膜表面(见图。5一个)。每个圆的定径640μm。圈1低于胸膜。圈2更深的薄壁组织,直接下面圈1以垂直方式的胸膜。大型船舶和航空公司被排除在外。圈内胶原蛋白含量的百分比表示为发射。

基质金属蛋白酶(MMP)的水解活动2和MMP-9 PLF BAL被明胶zymography测量。样本10% sds - page分离含0.1%明胶(Sigma-Aldrich)。后电泳,凝胶2.5% Triton x - 100年孵化(Sigma-Aldrich) 30分钟,然后被放置在激活缓冲区(50毫米Tris-HCl (pH值8),CaCl 10毫米₂5μM ZnSO₄,150毫米氯化钠;Sigma-Aldrich),一夜之间在37°C。凝胶是沾0.1%考马斯亮蓝- 250解决方案(Sigma-Aldrich),在30分钟37°C。然后使退色了凝胶40%甲醇和7%醋酸的几个变化。区域的酶活性明显清楚乐队在蓝色背景下。参考标准使用MMP-2和MMP-9 (Chemicon国际)。

对比AdTGF-β1-treated组和对照组(AdDL)被Mann-Whitney执行U测试和对比老鼠相同的组由Wilcoxon测试。

肺是收获后不同时间点全体AdLacZ政府进入右胸膜空间和彩色β-galactosidase活动(图。1,一个)。腺病毒是高效使转染细胞间皮的,证明了在肺胸膜广泛表达β-galactosidase 4和10天(无花果。1,B)。胸壁和隔膜的间皮的细胞转染。转基因蛋白则被严格限制在胸膜间皮的细胞和肺实质内(图中未发现。1,B)或腹腔。基因转移是瞬态,消失在一段时间内的14天。没有发现β-galactosidase活动控制老鼠(图。1)。基因转移是两国由于解剖结构的之间的联系和统一的啮齿动物的左、右胸膜腔。

老鼠接受控制病毒(AdDL)稳步健康和体重增加。相比之下,老鼠接受AdTGF-β1出现生病的折边的皮毛和失去了15%的体重恢复前的前两周。有一些动物被处以安乐死后AdTGF-β1政府由于条件差和缓慢复苏。这些动物证明胸膜纤维化,但并不包括在数据分析,因为他们不确定端点。

宏观上,脏胸膜表面AdTGF-β1-treated肺部出现在任何检查时间点同质的白色。AdTGF-β1-treated肺看起来异常收缩与控制相比,观察进步直到第64天(无花果。2)。有趣的是,在胸壁胸膜壁层看起来并不不同AdTGF-β1 AdDL-treated老鼠。粘连是罕见和钝性剥离顶叶和肺胸膜之间很容易。肺容积评估通过测量体积的福尔马林排水进入肺部后10分钟的恒压20厘米H₂o .成交量减少AdTGF-β1-treated肺与控制白天相比64年的30%(7.45±0.76毫升,10.17±0.17毫升,分别p= 0.034)。

转基因蛋白质测定的浓度为活跃的人类TGF-β1蛋白ELISA PLF和BALF的上层清液。从AdTGF-β1-treated PLF老鼠(图的分析。3)显示显著增加水平的活跃的TGF-β1胸膜空间4和7天(4717±785 pg / ml 2872±594 pg / ml,分别)与AdDL控制老鼠(61±9和48±2 pg / ml,分别)。转基因产品不再是可检测后14天。BALF中,增加一个小发现TGF-β1 AdTGF-β1-treated第七天的老鼠相比,控制(332±103 pg / ml和60±1 pg / ml,分别p= 0.034)。

到了第四天,我们发现大量胸腔积液与高浓度的TGF-β1(3.3±1.1毫升,p= 0.025与控制)。胸腔积液的体积随时间而下降(1.1±0.6毫升7天,p与控制)= 0.025相比,不再是现在白天14。没有观察到胸腔积液控制vector-treated动物在任何时间点。细胞PLF总额增加了4天,7和14与后时间点相比,AdDL之间没有显著差异,AdTGF-β1-treated老鼠(表我)。有优势的微分单核的细胞细胞计数(> 98%)在每个时间点在所有AdDL AdTGF-β1-exposed动物。没有区别在BALF细胞计数观察之间的任何时间点AdDL AdTGF-β1-treated动物。

部分左右肺从同一动物被histomorphometry比较评估肺胸膜厚度后双方胸膜内的AdTGF-β1管理(向右胸腔)。研究结果表明,胸膜纤维化AdTGF-β1的胸膜腔内给药后双边和齐次(数据未显示),由于解剖啮齿动物肺的两个腔之间的连接。因此,我们决定执行所有histomorphometric测量左肺是遥远的从注射和潜在的局部刺激胸膜炎症细胞或出血。我们发现胸膜增厚早在第四天开始,逐步增加通过天21日和64(图。4,一个)。同样,胶原蛋白的量增厚的胸膜内评估picrosirius红染色(胶原蛋白标记特定)逐步增加64天(无花果。4,B)。胸膜正常出现在AdDL-treated老鼠在任何时间点为胶原蛋白积累没有任何迹象。胸膜壁层隔膜显示纤维的变化与统一的胶原蛋白沉积尽管正常视觉检查(图方面。4,C)。没有在腹膜纤维化的隔膜。胸壁胸膜壁层的显示胶原蛋白积累更少(无花果。4C)。

HSP47, collagen-specific监护人与从头合成的胶原蛋白密切相关,存在于纤维组织从64年第四天到天表明积极fibroproliferative过程(无花果。4一个)。

尽管纤维化的变化被严格限制的表面隔膜专门和胸壁胸膜,他们出现在肺胸膜(图明显不同。4,一个)。事实上,肺实质纤维化改变入侵临近胸膜表面(图5,一个和B)。我们测量薄壁组织中的胶原蛋白密度以恒定的距离胸膜表面和证明,胸膜腔内TGF-β1基因转移诱导一个温和但却意义重大的进步在肺实质纤维化反应。胶原蛋白积累开始对胸膜下最强烈的(图。5,C圈1),逐步增加到64天。的薄壁组织的胶原蛋白积累量随距离增加而降低表面(图。5C圆2),但仍然是进步的。

与共同服用AdLacZ和AdTGF-β1在实验中,我们观察到间皮的细胞转染的第0天AdLacZ(蓝染色)逐步迁移到纤维组织TGF-β1过表达(图的时候。6)。间皮的细胞层含有丰富cytokeratin-positive细胞(图。7从第四天到64年,薄的箭头)。AdTGF-β1后的第四天,但不是AdDL,间皮的细胞变得失去细胞间连接(无花果。6和7)。AdTGF-β1 7和14天后,免疫荧光显示的外观dual-labeled细胞角蛋白和α-SMA-positive细胞(图7在纤维组织,厚的箭头)。白天64众多α-SMA-positive细胞中观察到实质在强烈的胸膜纤维化组织。

这些表型变化间皮的细胞中观察到伴随着强劲增加gelatinolytic胸膜液的活动,这是一个关键因素在mesothelial-to-mesenchymal过渡的过程。MMP-2活动显著增加由明胶zymography PLF AdTGF-β1而control-treated老鼠从天4 - 14和MMP-9活动增加了第四天(图。8)。

胸膜纤维化通常被认为是其他疾病的并发症包括胸腔,目前还不清楚为什么只有一些个人发展进步的胸膜疤痕反应损伤。在这项研究中,我们表明,积极TGF-β1管理的大鼠胸膜间皮adenoviral基因转移导致进步肋膜胸膜纤维化没有,但有严重肺容量限制。我们进一步的报告建议,胸膜纤维化的变化与肺实质和进步显著,但不是成邻胸壁或膈肌。

胸膜纤维化可以开发,以应对各种各样的疾病和组织损伤。这些是经常但不仅限于与炎症有关。大多数的胸膜炎症过程解决治疗的根本原因或自发地改善。然而,有时慢性疤痕和纤维化发展尽管明显解决炎症阶段(1)。进步的疤痕也会发生没有炎症,如开胸手术后冠状动脉搭桥(25)。开关的触发一个逐步解决纤维组织反应在胸膜腔尚未确定。几项研究已经证明了生长因子的潜在作用基本成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子,TGF-β1 (26)。TGF-β1广泛纤维化疾病的研究中。这种生长因子以其抗炎作用,趋化现象的是成纤维细胞,促进细胞外基质的积累(27)。瞬态超表达鼠肺的活跃TGF-β1 adenoviral基因转移导致进行性肺纤维化没有炎症,主要表现为广泛的细胞外基质蛋白沉积,如胶原蛋白、纤连蛋白和积累myofibroblasts (20.)。相比之下,adenovector-mediated IL-1β诱发严重的炎症反应的过度肺其次是进行性纤维化,可能介导通过内生老年病TGF-β1 (21,24)。的profibrotic影响TGF-β不仅适用于支气管和肺泡上皮细胞还间皮的细胞(28)。TGF-β刺激导致间皮的细胞合成胶原蛋白和其他基质蛋白在体外(过度28)。在这里的研究报告,我们管理的基因自发地主动TGF-β1成正确的老鼠和胸膜腔产生高水平的活性蛋白质的胸膜液体,高峰在4和7天内表达。这种方法导致了严重的和进步的胸膜纤维化。有一个温和的单核炎症反应AdTGF-β1的腺病毒没有区别和控制vector-treated老鼠。AdTGF-β1-induced纤维化是进步到64天,长在转基因蛋白质从胸水消失了。我们假设这种进步的纤维发生的反应在一定程度上是由TGF-βautoinduction类似于肺纤维化(讨论20.)。它最近表明,胸膜腔内注入TGF-β2刺激间皮的细胞产生胶原蛋白和内生TGF-β,进一步增加生产基质蛋白(10)。人类间皮的细胞不仅能合成TGF-β但也有这种细胞因子受体(11,29日),进一步支持假说的自分泌激活TGF-β胸膜纤维化。

大多数胸膜纤维化研究的重点是与感应粘连和纤维化改变肋膜的临床用途,主要用于治疗恶性或慢性和抗治疗胸腔积液(7)。滑石和四环素滴剂进入胸腔肋膜是最常见的方法(30.)。然而,他们与重要的高烧和疼痛等临床问题。甚至成人呼吸窘迫综合征已经公认的并发症在9%的病人接受肋膜滑石(31日,32)。因此,profibrotic生长因子被认为是潜在的替代治疗和研究动物模型。李等人。8,10显示在兔子和羊模型rTGF-β2政府最初引发标记流体胸膜腔积液,其次是肋膜有效与多个粘连。与这项研究中,我们注意到在我们的老鼠模型只有短暂的胸腔积液在很早的时间点,其次是进步的胸膜纤维化,但粘连几乎缺席(无花果。2和4一个)。这两种模式支持的主要角色TGF-β胸膜纤维化的发展和恶化,尽管TGF-β1和2之间的区别有点意想不到。TGF-β1和2被认为是类似的影响矩阵的形成,但政府的路线可能占差异的形成粘连(TGF-β1通过adenoviral基因转移与重组蛋白TGF-β2研究)(8,9,10)。我们相信这项技术申请胸膜腔内注射可能有最肋膜影响。我们的实验方法不涉及手术和允许避免主要出血和额外的炎症因素从而导致粘连和肋膜(33)。最后,胸膜粘连和胸膜增厚可能由不同的机制。

令人惊讶的是,anti-TGF-β策略的价值治疗胸膜纤维化和粘连还没有被彻底调查。TGF-β是发展的主要目标之一antifibrotic治疗肺纤维化,和大量的动物实验研究强烈支持这种方法(34,35)。在我们的模型中,引起严重的和同质双边肺胸膜纤维化,导致肺容积的重要限制。胸膜纤维化在人类成为临床上重要的限制性肺功能模式时,它涉及到肺胸膜的主要部分。这可能会导致大量的发病率和慢性呼吸衰竭,例如,在石棉肺、胸手术后,或血胸,药物引起的胸膜纤维化(麦角碱药物,先前的癌症化疗,放疗)或家族性特发性胸膜纤维化。没有有效的治疗可用于经常需要这些条件和手术剥外皮,有限的治疗成功(1)。Anti-TGF-β策略是一种很有前途的治疗方法对于预防或治疗这些并发症。一项研究表明,胸膜腔内注入TGF-βAbs可以减少empyema-induced胸膜纤维化在一只兔子模型(11,12)。虽然在其他胸膜纤维化疾病TGF-β的角色不明确证明,我们相信,我们的模型可以非常有用的进一步理解如何停止发展,甚至治疗这种慢性疾病。

胸膜纤维化的模式和分布在我们的模型中不同于预期,提出一些有趣的问题和假设需要进一步探索。肺胸膜纤维化改变是最强的,特点是在64年一天增加胶原蛋白的积累。少,但仍有人看见实质纤维化增厚的胸膜壁层隔膜,只有轻微的胶原蛋白检测在顶叶胸壁胸膜。虽然没有见过纤维化在隔膜和胸壁的肌肉,有趣的是我们发现显著增加肺实质内的胶原蛋白邻近胸膜表面(图5),减少胸膜与更远的距离。拥有一个强大的积极的胸膜下HSP47 64天(无花果。4一个)支持进行fibroproliferative过程在这个时间点(36)。可能扩散到胸膜腔的转基因TGF-β肺泡立即胸膜下导致了这一现象。然而,这只会在一定程度上解释这些变化随着时间的发展转基因蛋白在不到两周内消失。我们建议,胸膜腔内超表达后的肺内的胶原蛋白积累TGF-β1胸膜纤维化的进展也可能造成的肺的肺泡结构。胸膜下间质纤维化可能结果的响应特性间肺,森那美等。20.)建议早些时候当肺内的老鼠的过度活跃TGF-β1导致严重的肺间质纤维化开始集中,最终涉及到内脏,但不是壁胸膜。胸膜下间质纤维化的特点之一是通常的间质性肺炎(37)。成纤维细胞的疫源地主宰在疾病的早期阶段,被一个信号进行纤维化的过程,而蜂窝更代表先进和“烧毁”疾病(38)。它刚刚报道,成纤维细胞的焦点可能比预期的相互沟通更近。酷et al。(39)表明,他们甚至可能形成一个网络,成纤维细胞,成纤维细胞的网“延长从胸膜底层的实质。这组描述的互连成纤维细胞没有单克隆,因此他们可能源于一个反应,而不是肿瘤组织损伤。观察在我们的研究适合这个概念,我们相信,我们的模型将是非常有用的详细调查这一假设。进一步显示了潜在的调制作用的胸膜纤维化肺病是胸膜间皮的细胞的能力转变成myofibroblast-like细胞。EMT是一个中心的多元化机制中的细胞复杂的组织(40)。它参与各种正常的生理和病理过程,如癌症和肾纤维化进展(16,17)。最近的证据显示一个潜在的角色EMT在肺纤维化的发病机制(14,15,41,42,43)。分区是一个类似的过程,被认为是一个主要因素在腹膜纤维化的发展(18)。我们建议明确证据证明发生在AdTGF-β1-induced胸膜纤维化模型,通过这个过程间充质细胞侵入肺实质。在我们的模型中我们并没有发现明显的成纤维细胞的焦点。还需要进一步的研究来调查是否胸膜下肺纤维化的分布格局可能部分胸膜间皮的细胞的过程或参与相关疾病。

总之,我们在这里提出一个新颖的模型研究胸膜纤维化的发病机制使用瞬态adenoviral vector-mediated TGF-β1超表达。纤维化过程是进步的和有趣的是侵入肺实质的胸膜下区。这是与分区,可以推测的是胸膜间皮可能参与肺纤维化的胸膜下分布模式。

我们感谢诉San Giorgio动物和所有团队季度的无价的和专业的帮助。

作者没有财务利益冲突。