抽象的GydF4y2Ba
Y型盒子结合蛋白(YB-1)与存在于许多基因的启动子区中存在的倒CCAAT箱序列结合。我们以前表明YB-1在人体癌细胞系中过表达,该人癌细胞系耐胰蛋白,并且通过转染表达Yb-1反义RNA的载体的Yb-1的耗尽增加了人癌细胞对顺铂的敏感性。确定YB-1是否可以与顺铂改性的DNA结合,我们将YB-1 cDNA融合给谷胱甘肽GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 转移酶(GST)cDNA并纯化得到的GST融合蛋白。当我们用未改性或顺铂改性的寡核苷酸测试融合蛋白时,我们发现GST-YB-1更强烈地结合顺铂改性的寡核苷酸,以及高迁移率组1(HMG1),HMG2和Xeroderma Pigmentosum的GST融合蛋白。组蛋白质。当我们测定激化细胞核抗原(PCNA)与GST融合蛋白相互作用的能力时,我们观察到与YB-1的结合但不是HMG1,HMG2或Xeroderma Pigmentosum A组。随后的实验证明YB-1和PCNA通过YB-1的COOH末端区域直接相互作用。使用免疫化素共沉淀方法,我们观察到YB-1和PCNA的结合GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba.这些结果表明YB-1可以用作顺铂损伤DNA的识别蛋白,并且在DNA修复或指导细胞反应对DNA损伤可能是重要的。GydF4y2Ba
介绍GydF4y2Ba
蛋白质YB-1,GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba首先通过它与y-box的能力来确定(GydF4y2BaIE。GydF4y2Ba,MHC II类启动子的倒CCAAT盒)GydF4y2Ba(1)GydF4y2Ba,已被证明调节基因表达GydF4y2Ba(2)GydF4y2Ba.从那时起,几种另外的真核基因,包括GydF4y2Ba胸苷激酶GydF4y2Ba那GydF4y2Ba细胞周期蛋白依赖性激酶1GydF4y2Ba那GydF4y2BaDNA拓扑异构酶ⅱαGydF4y2Ba,GydF4y2Ba凋亡GydF4y2Ba已发现基因在其启动子区域中含有一个y盒GydF4y2Ba(3)GydF4y2Ba.有趣的是,y箱结合蛋白的家族已被证明含有独特的DNA结合结构域,冷休克域,从原核生物中高度保守GydF4y2Ba(2)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在我们实验室的先前报告中,我们证明了MDR1启动子活动以依赖于倒的CCAAT盒和YB-1的方式响应各种环境压力而增加GydF4y2Ba(4)GydF4y2Ba.我们还表明,在人体组织中普遍表达的YB-1在人类癌细胞系中过表达,这些细胞患者是对顺铂的抗性GydF4y2Ba(5)GydF4y2Ba.此外,我们发现用表达YB-1反义RNA的哺乳动物表达载体转染细胞导致对顺铂的药物敏感性增加GydF4y2Ba(5)GydF4y2Ba.在一起,这些发现表明YB-1可以识别由顺铂改性的DNA区域,并且它可以参与DNA修复过程。GydF4y2Ba
顺铂是一种广泛使用的抗癌剂;据信其治疗效果是由其与DNA的相互作用产生的GydF4y2Ba(6.GydF4y2Ba7)GydF4y2Ba.顺铂已被证明能导致基因组DNA中相邻嘌呤之间链内交联的形成。主要的顺铂DNA交联是链内1,2 -d (GpG)和d (ApG),而次要的交联包括链内1 -d (GpNpG)。GydF4y2Ba(7)GydF4y2Ba.因为通过转蛋白未形成的主要交联,所以关注的无活性异构体,注意力集中在主要的交联和细胞蛋白质上,专门认识到这些交联的细胞蛋白质GydF4y2Ba(6)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
识别这些交联剂的细胞蛋白质和优先与顺铂改性的DNA结合的细胞蛋白质包括HMG1,HMG2GydF4y2Ba(8)GydF4y2Ba和xpa.GydF4y2Ba(9)GydF4y2Ba;已经提出了一些机制的活动GydF4y2Ba(10.GydF4y2Ba11)GydF4y2Ba.HMG1和HMG2都是非组蛋白染色体蛋白中丰富的HMG的成员,并且都被证明含有两个内部重复的HMG盒,介导DNA结合GydF4y2Ba(12)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
两者都涉及各种细胞过程,包括转录和DNA修复GydF4y2Ba(8.GydF4y2Ba,12)GydF4y2Ba.XPA是一种锌指dna结合蛋白,在a组着色性干皮病细胞中发生改变,它已被证明参与了NER过程的损伤识别步骤GydF4y2Ba(11.GydF4y2Ba, 13)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
虽然我们以前的结果是间接提出的,但是YB-1与顺铂抗性有关,但没有直接证明YB-1与顺铂改性的DNA结合。此外,虽然已知HMG1和HMG2都可以作为II类转录因子GydF4y2Ba(8)GydF4y2Ba,尚未显示序列特异性转录因子优先识别顺铂改性DNA的能力。在这里,我们证明YB-1与顺铂改性的DNA结合,并且它与PCNA相互作用,DNA修复中的必需蛋白质。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
抗体。GydF4y2Ba
XPA、PCNA、GST、TRX抗体购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)。YB-1的抗血清如前所述生成GydF4y2Ba(5)GydF4y2Ba.从合成肽KGetkkkkfkdpnap(K Plus氨基酸83-95)产生的抗体1抗体,并从肽KseagkkgpGrptg(K加氨基酸168-180)产生抗体。GydF4y2Ba
顺铂改性寡核苷酸的制备。GydF4y2Ba
用互补链退火二十碱基长的寡核苷酸。双链寡核苷酸用[γGydF4y2Ba−GydF4y2Ba32.GydF4y2BaP] ATP(Amersham)使用多核苷酸激酶(Takara Suzo,京都,日本)和每一半进行分铂(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo; Ref。GydF4y2Ba11GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
融合蛋白的表达。GydF4y2Ba
通过使用以下引物对的逆转录-PCR,通过逆转录PCR从Kb细胞中制备总RNA,对人YB-1,HMG1,HMG2,XPA和PCNA的全长CDNA扩增(引发密码子下划线):YB-1,5'-GydF4y2Ba阿格GydF4y2BaAGCAGCGAGGCCGAGACC-3'(5A)和5'-TTTATCTGGTTGCAAACGG-3'(3A);HMG1,5'-AACGydF4y2Ba阿格GydF4y2Baggcaaaggagatcc-3'和5'-taccaggcaaggttagtggg-3';HMG2,5'-TCAACGydF4y2Ba阿格GydF4y2Baggtaaaggagacccc-3'和5'-acacacacatcatcacacg-3';XPA,5'-ccagagGydF4y2Ba阿格GydF4y2Bagcggcgg-3'和5'-atcacattttttcatgtcagttcatgccac-3';和pcna,5'-ccaccGydF4y2Ba阿格GydF4y2BaTTCGAGGCGCGC-3”和5 ' -GCCTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATCTTGG-3”。GydF4y2Ba
将PCR产物克隆到PGEM-T容易(Promega)中并进行测序。用适当的限制酶(Takara Suzo)或接头连接在凝胶中从凝胶中纯化的cDNA片段被克隆到表达载体中,PGEx-4T(Pharmacia)或PthiOhis(Invitrogen)中。用于Yb-1缺失构建体的寡核苷酸为:5'- acaagaaggtcatcgcaacg-3'(5b),5'-ggtggtgtcagtcaagg-3'(5c)和5'-ccagggacctgtaacattgc-3'(3b)。GydF4y2Ba
通过用合适的引物进行PCR扩增制备不同部分的YB-1 cDNA并克隆到PGEM-T中。用适当的酶消化并克隆到PGEX-4T中后,在消化后凝胶纯化。对于GST-YB-1Δ2的构建,消化了YB-1 cDNA的子旋网GydF4y2Ba生态GydF4y2Bari和GydF4y2Ba萨尔GydF4y2Ba我和克隆到PGEX-4T。在转化后,使用特异于GST或TRX的抗体,通过Western印迹筛选产生融合蛋白的细菌克隆。GydF4y2Ba
电泳迁移率转移测定。GydF4y2Ba
根据制造商的方案(Pharmacia)纯化融合蛋白,并直接用于电泳迁移率转变测定。通过孵育20ml 10米的混合物进行结合反应GydF4y2BamGydF4y2BaTris-HCl(pH 7.9),20米GydF4y2BamGydF4y2BaNaCl,0.5μg聚(DI·DC),0.5μg的BSA和放射性标记寡核苷酸的4ng在室温下30分钟,并在0.5×Tris-Borate EDTA缓冲液中分析4%聚丙烯酰胺凝胶上的产物,然后进行放射造影,如前所述GydF4y2Ba(4)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
下拉测定。GydF4y2Ba
如前所述由Kb细胞制备核提取物GydF4y2Ba(14)GydF4y2Ba并透析缓冲液[20米GydF4y2BamGydF4y2BaTris-HCl(pH8.0),0.5米GydF4y2BamGydF4y2BaEDTA,20%甘油,1米GydF4y2BamGydF4y2Badtt,1米GydF4y2BamGydF4y2Ba苯基甲基磺酰氟],含0.5GydF4y2BamGydF4y2BaKCL。GST和TRX融合蛋白被透析在相同的缓冲液中,还含有1%NP40。通过将GST或GST融合蛋白固定在谷胱甘肽 - 琼脂糖珠4b(药毛刺)上来制备亲和力柱。将Kb核提取物或TRX融合蛋白加载到含有GST融合蛋白的20-μL亲和柱上,并在4℃下孵育1小时。用1mL含100米的缓冲液A洗涤五次后GydF4y2BamGydF4y2BaKCl和0.1%NP40,用含有1的缓冲液A洗脱结合的蛋白质GydF4y2BamGydF4y2BaKCL。柱洗脱液和1%的起始材料进行SDS-PAGE。GydF4y2Ba
Coimmunopectipipipation测定。GydF4y2Ba
在100mm组织培养皿中生长的Kb细胞用冰冷的PBS洗涤并用网凝胶缓冲液裂解[50米GydF4y2BamGydF4y2BaTris-HCl(pH 7.5),150米GydF4y2BamGydF4y2BaNaCl,0.1%NP40,1米GydF4y2BamGydF4y2BaEDTA,0.25%明胶,0.02%叠氮化钠,1米GydF4y2BamGydF4y2Ba苯基甲基磺酰芳基,10μg/ ml Leupeptin和10μg/ mL抑肽蛋白;参考。GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]。提取液经10000 ×离心清除GydF4y2BaGGydF4y2Ba将抗体加入到上清液中并在4℃下孵育1小时。随后加入蛋白A-Sepharose并在4℃下孵育1小时。用净凝胶缓冲液洗涤珠子两次,一次用10米洗涤一次GydF4y2BamGydF4y2BaTris-HCl(pH7.5)-0.1%NP40。将沉淀物和原料溶解在样品缓冲液中,用于随后的电泳和Western印迹分析。GydF4y2Ba
电泳和免疫斑分析。GydF4y2Ba
通过在12-15%凝胶上通过SDS-PAGE分离蛋白质级分,然后使用半印迹装置转移到聚偏二氟乙烯膜中1小时。在室温下与抗体孵育1小时后,将印迹与二抗,并被Western Blot化学发光试剂加(Nen Life Scient Products,Boston,MA)可视化。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
YB-1对顺铂改性DNA的优先结合。GydF4y2Ba
探讨YB-1与顺铂改性DNA相互作用的能力GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba,Yb-1和GST CDNA被融合,融合蛋白在细菌中表达。作为对照,HMG1,HMG2和XPA CDNA与GST融合,因为已知每个蛋白质与具有高亲和力的顺铂改性的DNA结合。通过用各种抗体蛋白质印迹确认每个融合蛋白的同一性。我们的YB-1抗体,以前显示识别GydF4y2BamGydF4y2BaR.GydF4y2Ba43,000 yb-1蛋白GydF4y2Ba(5)GydF4y2Ba,也与之反应GydF4y2BamGydF4y2BaR.GydF4y2Ba68,000个融合蛋白(图1GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.XPA和PCNA的抗体也与内源和GST融合蛋白反应(图1GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.我们使用合成肽作为抗原制备的HMG1和HMG2的抗体也与内源性和融合蛋白反应:HMG1的抗体认可aGydF4y2BamGydF4y2BaR.GydF4y2Ba28,000个核蛋白和aGydF4y2BamGydF4y2BaR.GydF4y2Ba54,000种GST融合蛋白,而HMG2的抗体认可GydF4y2BamGydF4y2BaR.GydF4y2Ba27,000个核蛋白和53,000种GST融合蛋白(图1GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.通过Kb核提取物中的每种蛋白质的结合显示了这些后一种抗体的单次要性。GydF4y2Ba
为了确定GST融合蛋白是否有助于分析DNA结合活性,首先需要对这些蛋白进行纯化。SDS-PAGE和考马斯蓝染色表明,每一种纯化都获得了全长融合蛋白和快速迁移蛋白(图1)GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba,我们经常观察到融合蛋白的纯化制备。这些快速迁移蛋白与抗GST抗体发生免疫反应(数据未显示),在GST的对照制剂中没有污染细菌蛋白。因此,我们得出这些在图1中观察到的额外蛋白质GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba蛋白水解产品。接下来,我们使用这些纯化的融合蛋白来检测四种合成寡核苷酸探针的DNA结合活性(图2)。GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.寡核苷酸Y含有倒的CCAAT盒(MDR1启动子的Y型盒子),当用顺铂改性时,含有多个卵链状交联,而寡核苷酸A,B和C被合成,使得当用顺铂改性时包含单个intrastrand交联(DGPG,DAPG和DGPXPG)。尽管GST本身不能与这些寡核苷酸(未显示的数据)中的任何一种结合,但是GS-YB-1与未改性的寡核苷酸Y吻合良好,甚至更强烈地对顺铂改性的寡核苷酸Y(图3GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.此外,GST-YB-1与顺铂改性的寡核苷酸A,B和C合并,但仅弱到未修饰的寡核苷酸(图3GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.由于HMG1、HMG2和XPA已被证明是哺乳动物细胞中主要的顺铂修饰DNA识别蛋白,我们检测了它们的GST融合蛋白在顺铂修饰前后与这些寡核苷酸结合的能力。HMG1和HMG2不与任何未修饰的寡核苷酸结合,而与顺铂修饰的寡核苷酸结合较弱(图3,GydF4y2BaB.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCGydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba,可以通过该测定中使用的寡核苷酸的相对短的长度(20-MEL)来解释的发现。相反,没有结合未改性的寡核苷酸的GST-XPA与与顺铂改性的寡核苷酸结合的GST-YB1一样有效(图3GydF4y2BaD.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
YB-1与PCNA相互作用。GydF4y2Ba
ner是针对顺铂的细胞毒性作用的细胞防御机制。因为Yb-1的CoOH-末端结构域的序列预测其涉及蛋白质 - 蛋白质相互作用,所以我们测试了YB-1是否与PCNA相互作用,该核素蛋白在DNA修复中。将KB细胞核提取物与固定化的GST融合蛋白一起温育,并通过免疫印迹分析结合的细胞蛋白。PCNA与YB-1相互作用,但不用HMG1,HMG2或XPA(图4GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba,并且PCNA与YB-1的相互作用可再现(图4GydF4y2BaB.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba那GydF4y2Ba剩下GydF4y2Ba).为了确认互易实验中的YB-1-PCNA相互作用,我们合成了GST-PCNA融合蛋白(未示出的数据),并测定核蛋白与GST-PCNA亲和柱结合的能力。在GST-PCNA柱中的高盐洗脱液中检测到YB-1,但不是在GST柱中(图4GydF4y2BaB.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba那GydF4y2Ba对GydF4y2Ba).确定YB-1和PCNA是否相互作用GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba,我们用抗体孵育Kb细胞提取物至Yb-1或PCNA,并确定其他抗体是否可以与所得的免疫复合物反应。YB-1通过抗体对PCNA共施加,但不是预imune血清(图4GydF4y2BaCGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba那GydF4y2Ba剩下GydF4y2Ba),并且通过抗体与Yb-1共沉淀,但不通过预免疫血清(图4GydF4y2BaCGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba那GydF4y2Ba对GydF4y2Ba).为了直接演示YB-1与PCNA的相互作用,我们将PCNA融合到TRX上,并将其与一系列YB-1不同部分融合到GST的固定融合蛋白孵育(图5)。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba和GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.我们发现TRX-PCNA结合固定的GST-YB-1Δ1和GST-YB-1Δ3但不是GST-YB-1Δ2,Δ4和Δ5,表明YB-1蛋白的氨基酸205-317直接相互作用使用pcna(图5GydF4y2BaCGydF4y2Ba)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
顺铂广泛用于治疗各种人类恶性肿瘤。通过各种肺炎机制介导对该试剂的抗性,包括药物积累的降低,细胞内硫醇浓度的增加,以及DNA修复的增加GydF4y2Ba(6.GydF4y2Ba16)GydF4y2Ba.已经研究了顺铂改性DNA与细胞蛋白的相互作用,以阐明这些细胞蛋白质如何负责顺铂的功效GydF4y2Ba(6.GydF4y2Ba,7GydF4y2Ba,10)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
已经表征了几种认可顺铂-DNA加合物的核蛋白质GydF4y2Ba(6.GydF4y2Ba7)GydF4y2Ba.在HMG蛋白家族中,HMG1和HMG2已被证明能特异性结合含有顺铂诱导的链内交联的DNAGydF4y2Ba(16)GydF4y2Ba.然而,没有直接证据表明HMG1和HMG2涉及顺铂敏感性。虽然IXRI是一种含有HMG盒的酵母蛋白,赋予顺铂的敏感性,但尚未证明HMG蛋白的细胞水平与受损DNA的修复之间的相关性GydF4y2Ba(17)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
已显示YB-1优先与孔灭菌DNA或单链DNA结合,但不给紫外线辐照DNA结合,表明该蛋白质可以优先结合在结构上改变的DNAGydF4y2Ba(18)GydF4y2Ba.我们观察到YB-1在顺铂耐药细胞株中过表达,细胞中YB-1的含量与这些细胞对顺铂的敏感性有关GydF4y2Ba(4)GydF4y2Ba,表明YB-1直接涉及顺铂和顺铂抗性的细胞反应。在这里,我们表明该序列特异性转录因子优先结合顺铂改性的DNA。与我们以前发现的顺铂诱导MDR基因表达GydF4y2Ba(4)GydF4y2Ba,我们的结果表明,顺铂可能会激活GydF4y2Ba凋亡GydF4y2Ba通过刺激YB-1对启动子区Y-box的访问来表达GydF4y2Ba凋亡GydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba
我们以前表明,yb-1主要在细胞的细胞质级分中检测,并且当细胞用紫外线照射或抗癌剂处理细胞时,它在细胞核中积聚在细胞核中GydF4y2Ba(19)GydF4y2Ba.当我们将绿色荧光蛋白融合到含有缺失在其CoOH末端的Yb-1时;然而,我们在没有DNA改性剂的情况下,我们发现核中的所有蛋白质GydF4y2Ba(19)GydF4y2Ba.这些发现表明,负责YB-1的细胞质保留的锚蛋白与后者的柯伊 - 末端结构域相互作用,该域具有涉及许多类型的蛋白质 - 蛋白质相互作用的结构域。GydF4y2Ba
在参与DNA修复的蛋白质中,PCNA已被证明在不匹配和NER途径中是必需的,并且与各种蛋白质相互作用,包括DNA连接酶IGydF4y2Ba(20)GydF4y2Ba,CIP I.GydF4y2Ba(21)GydF4y2Ba和DNA甲基转移酶GydF4y2Ba(22)GydF4y2Ba.我们现在展示了YB-1直接与PCNA相互作用GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba和GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba(图4GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba5)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba并且它是YB-1的CoOH-末端结构域,其参与其与PCNA的结合。由于大量PCNA在细胞的细胞质中定位,因此YB-1和PCNA可能在细胞质中彼此锚定。GydF4y2Ba
已发现DNA修复缺乏的细胞对顺铂特别敏感。实际上,DNA修复活性涉及许多细胞系对顺铂的抗性的主要原因。因此,可以通过DNA损伤识别和DNA修复蛋白之间的动态相互作用来确定对顺铂的细胞敏感性。虽然YB-1功能的机制尚不清楚,但我们的研究结果表明YB-1通过其参与转录偶联的修复可能对增强细胞DNA修复可能是重要的。此外,由于在酵母中观察到由转录因子II H,DNA修复蛋白和DNA损伤识别因子组成的高秩序复合物GydF4y2Ba(13)GydF4y2Ba,它可能有意思地确定YB-1是否与转录因子II H相互作用。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
我们感谢Satoko Takazaki和Shigeko Kihara获得编辑的帮助。GydF4y2Ba
脚注GydF4y2Ba
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白GydF4y2Ba广告GydF4y2Ba按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。GydF4y2Ba
↵GydF4y2Ba1GydF4y2Ba该研究得到了教育,科学,体育和文化部的癌症研究的授予援助,以及福冈抗癌研究基金(福冈,日本)。GydF4y2Ba
↵GydF4y2Ba2GydF4y2Ba应如何解决转载请求,在分子生物学系,职业和环境卫生大学,医学院,雅达坦岛,日本北崎市807-8555。电话:81-93-691-7423;传真:81-93-692-2766;电子邮件:GydF4y2Bak-kohno在{}med.uoeh-u.ac.jpGydF4y2Ba
↵GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba使用的缩写是:Yb-1,Y盒结合蛋白1;MDR1,多药电阻1;HMG,高流动性集团;XPA,Xeroderma Pigmentosum A组;ner,核苷酸切除修复;PCNA,增殖细胞核抗原;GST,谷胱甘肽GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 转移酶;trx,thioredoxin。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba1998年10月22日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba1998年12月1日。GydF4y2Ba
- ©1999美国癌症研究协会。GydF4y2Ba