文摘gydF4y2Ba
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是进步的气流限制造成的持续气道炎症过程。胆碱能增加音调调节不同的慢性阻塞性肺病的病理生理特征,如支气管狭窄和粘液分泌过多,主要通过激活人类的毒蕈碱的MgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体(嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)亚型。Tiotropium溴化(Spiriva)是一个良好的毒蕈碱的拮抗剂在COPD的药物管理每日一剂量学。持续获得与tiotropium bronchodilation背后的基本原理在于它缓慢从hM离解gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体。在这项研究中,我们进行了全面的临床前的比较与其他长效tiotropium毒蕈碱的拮抗剂(喇嘛)目前在临床开发,即aclidinium溴和胃长宁。特征不同的毒蕈碱的拮抗剂的1)亲和力向不同的人类毒蕈碱的受体亚型表达的中国仓鼠卵巢细胞和受体动力学离解,2)效力agonist-induced激活的抑制毒蕈碱的受体通过测量第二信使,和3)疗效和bronchoprotection时间测试的模型acetylcholine-induced支气管收缩在麻醉狗经过一段24 h。所有的测试喇嘛显示向hM高亲和力和效力gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体(tiotropium pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 10.4;aclidinium pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 9.6;和胃长宁,pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 9.7)。然而,离解的喇嘛hM的半衰期gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体明显不同(tiotropiumgydF4y2BatgydF4y2Ba½gydF4y2Ba= 27 h;aclidinium,gydF4y2BatgydF4y2Ba½gydF4y2Bah = 10.7;和胃长宁,gydF4y2BatgydF4y2Ba½gydF4y2Ba= 6.1 h)。符合hM的动力学特性gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,提供不同级别的测试喇嘛bronchoprotection体内设置后24 h政府(tiotropium = 35%, aclidinium = 21%,和胃长宁在24 h) = 0%时应用于equieffective剂量。gydF4y2Ba
COPD一词描述了临床状况的特点是慢性气道阻塞引起的呼吸系统的异常炎症反应。COPD的发病机制的主要因素是持续吸入香烟烟雾(gydF4y2Ba瑞芭et al ., 2007gydF4y2Ba)。偶尔,涉及其他因素,包括基因诱导酶α的不足gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶或暴露于有毒物质在工作和环境。慢性阻塞性肺病的特征是一个以中性粒细胞为主的炎症气道的墙壁,和气流限制主要是由于粘膜腺体增生、肥大,而且,特别是,支气管平滑肌的收缩的小航空公司(gydF4y2Ba巴恩斯,2000gydF4y2Ba)。慢性阻塞性肺病是与发病率和死亡率的显著水平(gydF4y2Ba瑞芭et al ., 2007gydF4y2Ba)。全球疾病负担研究预计,慢性阻塞性肺病,排名第六的死因,1990年将成为全球第三大死因,2020 (gydF4y2Ba穆雷和洛佩兹,1997gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
国家和国际准则建议COPD患者应该接受支气管扩张剂作为一线维持治疗,因为他们增加呼气流量减少气管平滑肌的语气,从而导致减少肺恶性通货膨胀gydF4y2Ba瑞芭et al ., 2007gydF4y2Ba)。最常规定支气管扩张剂治疗慢性阻塞性肺病毒蕈碱的拮抗剂和βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体激动剂。在慢性阻塞性肺病、支气管狭窄和粘液分泌增加,和航空公司成为一个极度反应器收缩剂。这些变化是主要由副交感神经活动增加引起的(gydF4y2Ba巴恩斯,2004gydF4y2Ba)。乙酰胆碱(ACh),从副交感神经末梢释放,激活postjunctional毒蕈碱的MgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体在气道平滑肌和粘膜下腺体引起支气管收缩和粘液分泌,分别。因此,抗胆碱能支气管扩张药在治疗慢性阻塞性肺病的特定值,因为他们阻止迷走神经胆碱能增加音调的影响。在临床试验中,毒蕈碱的对手已经被证明产生的改善肺功能,锻炼耐力,和健康相关的生活质量显著减少急性加重,在总结,改善慢性阻塞性肺病的临床课程(gydF4y2BaVincken et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaTashkin et al ., 2008gydF4y2Ba)。重要的是,毒蕈碱的对手有利的副作用。得益于现代抗胆碱能类的四级结构,防止大量吸收粘膜表面和穿透血脑屏障,inhalative管理路线,这进一步限制了系统性风险,这些药物临床相关的副作用几乎是免费的,除了偶尔的报道口干(gydF4y2Ba总值2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Tiotropium (Spiriva),介绍了最近治疗慢性阻塞性肺病的,是第一个长效毒蕈碱的拮抗剂(喇嘛):单剂量Tiotropium后,临床相关改善肺功能持续超过24小时,允许每日一次给药(gydF4y2BaVincken et al ., 2002gydF4y2Ba)。其背后的机制长期的行动与目标的离解速率较慢,人类的MgydF4y2Ba3gydF4y2Ba毒蕈碱的受体(gydF4y2BaDisse et al ., 1999gydF4y2Ba)。长时间的行动(最好是24小时)是一个重要的特性的药物用于治疗慢性疾病,使长期疗效(gydF4y2BaTashkin 2005gydF4y2Ba)和一个简单的,每日一次剂量政权,提高病人的依从性(gydF4y2Ba田村和研究员合作,2007年gydF4y2Ba)。其他药物目前正在评估在临床试验的能力每日一次函数与一个潜在的喇嘛管理来看,即。,aclidinium [also known as LAS34273 from Almirall Prodesfarma (Barcelona, Spain), currently in phase IIb trials] and glycopyrrolate [NVA-237, from Novartis (Basel, Switzerland), in phase III trials]. Currently, however, limited preclinical information is published concerning the pharmacological properties of these investigational drugs. Thus, in the present study, we have directly compared the pharmacology of the different LAMAs, namely tiotropium, aclidinium, and glycopyrrolate, in in vitro and in vivo models. To understand the antagonists' behavior at the molecular level, interaction with the different muscarinic receptor subtypes was analyzed in binding and functional assays. Given the rationale behind tiotropium's long duration of action, particular attention was given to the kinetics of dissociation from the muscarinic receptors. Efficacy and duration of bronchoprotection were tested in a pharmacological model of acetylcholine-induced bronchoconstriction in anesthetized dogs over a period of 24 h.
材料和方法gydF4y2Ba
化学药品和试剂。gydF4y2Ba(gydF4y2BaNgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba甲基gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]莨菪碱氯甲烷([gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS,特定的活动,82 Ci /更易)从PerkinElmer获得生命和分析科学(沃尔瑟姆,MA)。MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba氯化氨甲酰胆碱,毒蝇碱、硫酸阿托品pirenzepine,gydF4y2BaNgydF4y2Ba溴化甲基东莨菪碱、EDTA、3-isobutyl-1-methylxanthine,氯化钠,玫瑰从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。Ipratropium溴化、溴化tiotropium aclidinium溴化,和胃长宁溴合成的化学实验室勃林格殷格翰集团(Biberach der里斯期,德国)。tiotropium的氚化是由RC Tritec AG (Teufen、瑞士)。(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] Tiotropium的高效液相色谱纯化在XBridge 8列(德国埃施博恩水域GmbH)导致的放射化学纯度≥98%,和65 Ci /更易与一个特定的活动。细胞培养试剂都从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。gydF4y2Ba
细胞培养技术。gydF4y2Ba中国仓鼠卵巢(CHO)细胞转染与互补编码人类MgydF4y2Ba1gydF4y2BaMgydF4y2Ba5gydF4y2Ba毒蕈碱的乙酰胆碱受体PerkinElmer买来生活和分析的科学。CHO细胞生长在火腿的F-12中补充10%胎牛血清的存在选择代理G418(400μg /毫升)。细胞维持在37°C调湿空气中含有5%的股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
平衡结合实验。gydF4y2Ba膜分离和净化CHO细胞稳定表达人类的MgydF4y2Ba1gydF4y2BaMgydF4y2Ba5gydF4y2Ba如前所述(执行受体gydF4y2BaCasarosa et al ., 2005gydF4y2Ba)。总之,细胞悬浮在缓冲区(Tris-HCl 15毫米,pH值7.5,2毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba0.3毫米EDTA 1毫米EGTA),均质,旋转30分钟48000gydF4y2BaggydF4y2Ba。颗粒在缓冲resuspended B(7.5毫米Tris-HCl, pH值7.5,12.5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba0.3毫米EDTA 1毫米EGTA, 250毫米蔗糖)、整除,直到使用存储在-80°C。蛋白质含量测定用BCA试剂盒(热费希尔科学,罗克福德,IL)。gydF4y2Ba
在所有放射性配体实验中,绑定缓冲由10毫米的玫瑰,MgCl 1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,pH值7.4。指定的潜伏期后,束缚和自由gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS被快速真空过滤分离使用Brandel收割机(马里兰州)GF / B过滤器事先在0.5%与冰冷的表面,并迅速洗了三次绑定缓冲。过滤器磁盘添加到3毫升的闪烁液(天涯黄金从PerkinElmer生活和分析科学)在pony-vials和放射性量化利用液体闪烁谱Tri-Carb 2900 tr液体闪烁分析仪(PerkinElmer生命科学和分析)。在所有的实验中,总绑定从来没有达到10%的补充说,限制free-radioligand并发症损耗的浓度。gydF4y2Ba
饱和结合实验由孵化膜(通常5 - 10μg /样本,根据调整gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba个人的细胞株),一系列浓度的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS(下午4点到8海里)总量的4毫升,避免重要配体在低浓度损耗。样品在室温下2 h孵化温和搅拌后过滤。非特异性结合确定为每个放射性配体浓度通过并行coincubating一组膜与过多的无标号阿托品(10μM)。gydF4y2Ba
获得无标号拮抗剂的亲和力估计,不同的竞争实验对(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS进行平衡。膜被孵化的存在(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS(最终浓度,大约0.1 nM)和不同浓度的无标号拮抗剂在室温下与温和搅拌过滤前18到20 H。竞争位移绑定数据拟合方程所描述的山(gydF4y2Ba1909年gydF4y2Ba),集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba抑制曲线中获取的值被转换为gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba程值利用的方法和Prusoff (gydF4y2Ba1973年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
动力学研究。gydF4y2Ba确定分解动力学参数根据经典的方法,膜表达不同的毒蕈碱的受体亚型首次允许平衡为0.45 nM (gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS或90点gydF4y2Ba3gydF4y2Ba在室温下H] tiotropium至少2 H(300μl /样本)。随后,样本添加到试管已经包含3毫升的绑定缓冲与阿托品10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米(0)开始分离。在不同的时间点,样品被使用Brandel收割机过滤,如上所述。监控潜在的膜降解发生在稍后时间点,添加了一些样品在时刻0管包含3毫升的绑定缓冲与相同浓度的放射性配体(即预培养的步骤。、0.45 nM (gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS或90点gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium),所以离解并不是开始,减少放射性配体结合将反映受体崩溃。分离数据安装在一个单相指数衰减函数,和gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba率获得变成了gydF4y2BatgydF4y2Ba½gydF4y2Ba值(离解半衰期)使用以下方程:gydF4y2BatgydF4y2Ba½gydF4y2Ba= ln 2 /gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
标记配体的解离动力学参数评估使用的方法Motulsky和马汉(gydF4y2Ba1984年gydF4y2Ba)。使用这种方法,通过竞争确定标记配体的动力学与放射性配体([gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS),其动力学参数已经确定给定受体。这种方法涉及到同步的放射性配体和膜无标号的竞争对手,所以在时刻0受体都是空置的。膜被添加0时刻包含0.3纳米管(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS存在与否的三种不同浓度的无标号的竞争对手(大约30 - 100,和300倍gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。在不同的时间点(8小时),[的程度gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS绑定到受体被过滤收集评估,如上所述。离解率计算无标号拮抗剂与棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)使用为竞争结合动力学方程拟合(最小二乘)的数据竞争动力学实验双组分指数曲线,与所有参数固定的除了gydF4y2BakgydF4y2Ba3gydF4y2Ba和gydF4y2BakgydF4y2Ba4gydF4y2Ba。的动力学gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS,独立决定三个独立实验的(平均)和用于这些方程,如下:嗯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba受体:gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba= 3.22×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba= 0.019分钟gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;为hMgydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体:gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba= 6.96×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba= 0.035分钟gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;为hMgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体:gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba= 5.96×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba= 0.013分钟gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
营分析。gydF4y2Ba确定功能对抗效力的不同在hM毒蕈碱的拮抗剂gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体细胞内营水平变化与CHO-hM测定gydF4y2Ba2gydF4y2Ba细胞悬浮细胞(5000 /)使用喷枪技术(PerkinElmer生活和分析科学)和384孔板格式(Optiplate;PerkinElmer生命和分析科学),根据制造商的协议。总之,细胞被刺激受体激动剂的浓度范围(碳酰胆碱或毒蝇碱,从10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba-12年gydF4y2Ba米)汉克斯的缓冲盐溶液与5毫米消息灵通的补充,0.1%的牛血清白蛋白,500毫米3-isobutyl-1-methylxanthine,和1μM forskolin没有或有至少6个不同浓度的拮抗剂(通常从10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba在室温下M)为30分钟。一个下半场预孵化与对手被允许继续添加前的兴奋剂。细胞细胞溶解兰斯试剂的使用,和一个额外的2 h后,盘子上读一个设想板读者(PerkinElmer生活和分析科学)。在样品的浓度标准曲线计算。Gaddum方程被用来适应数据和剂量率的变化是根据席尔德绘制。gydF4y2Ba
磷酸肌醇积累试验。gydF4y2Ba改变细胞内的肌醇磷酸盐在CHO-hM监控水平gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和CHO-hMgydF4y2Ba3gydF4y2Ba细胞利用IPone工具包(Cisbio生物,Bagnolssur-Ceze Cedex,法国)根据制造商的指示。总之,细胞被镀提前1天在384 -白盘子(他一一Bio-One GmbH, Frickenhausen,德国),每口井的20000个细胞密度。当天测定,细胞被刺激受体激动剂的浓度范围(碳酰胆碱或毒蝇碱,从10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba-12年gydF4y2Ba米)在10毫米玫瑰组成的一个缓冲,CaCl 1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,0.5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,4.2毫米氯化钾、氯化钠146毫米,5.5毫米葡萄糖,50 mM氯化锂(最后的pH值7.4)没有或有至少6个不同浓度的拮抗剂(通常从10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba-10年gydF4y2BaM)。下半场预孵化与对手被允许继续之前的兴奋剂。在37°C, 1小时刺激后细胞细胞溶解使用试剂提供的设备,和一个额外的小时后,板块在想象板阅读器阅读。肌醇磷酸盐的浓度的样品标准曲线计算。Gaddum方程被用来适应数据和剂量率的变化是根据席尔德绘制。gydF4y2Ba
体内实验。gydF4y2BaBronchoprotective影响乙酰胆碱的毒蕈碱的拮抗剂研究在模型(ACh)全身麻醉的支气管收缩,通风小猎犬的狗。依照德国所有动物实验动物福利法律和获得伦理委员会批准。男狗10至12公斤被随机分配到4组,每个组成的四个动物。丸的狗麻醉注射异丙酚(10毫克/公斤增长值)随后注入30毫克/公斤每小时输液异丙酚(b·布劳恩Melsungen Melsungen德国)头静脉。狗与交织插管和通风压力与室内空气和氧气的混合物(3:1),西门子呼吸器的速度每分钟15中风。最优通风是保证定期测量血液中的酸碱状态和血氧饱和度。毒蕈碱的对手是溶解在水/乙醇(40:6 0,v / v)和由吸入利用Respimat软雾吸入器(勃林格殷格翰集团制药GmbH是一家现代化、殷格翰集团、德国)连接的气管导管30μl通风狗的体积。被重复诱导气道阻力增加静脉注射乙酰胆碱(Sigma-Aldrich) 10μg /公斤。实验剂量的研究3 h之前研究24 h。3 - h研究设置中,静脉注射乙酰胆碱挑战注入:-45年,-30年,-15年,5、10、30、60、90、120、150和180分钟吸入后测试的化合物。24小时研究设置,ACh管理30前15分钟和5,10,12,30分钟和6日24小时后测试化合物的吸入。 Bronchoprotection was expressed as percentage of inhibition of the ACh-induced increase in airway resistance before the administration of the compound (predrug values).
数据分析。gydF4y2Ba所有实验进行了分析通过线性或非线性回归分析不同试验方法下的方程提到使用Prism 5.1版本(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。数据表示为均值±S.E.M.gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
测定配体亲和人类毒蕈碱的MgydF4y2Ba1gydF4y2BaMgydF4y2Ba5gydF4y2Ba受体。gydF4y2Ba分析药物的行为不同的毒蕈碱的拮抗剂在体外,CHO细胞系选择性地和稳定地表达人类的毒蕈碱的MgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba5gydF4y2Ba受体被用来确保测量在一个受体亚型。对于每个细胞株,gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba向[价值观和亲和力gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS,确定饱和实验报告gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
拮抗剂的亲和力不同受体亚型测定在不同的竞争结合实验对(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS。因为达到平衡所需的时间可以改变明显,根据标记化合物的动力学参数(gydF4y2BaMotulsky马汉,1984gydF4y2Ba),初始实验决定多久孵化应该继续执行。这方面是特别重要的化合物与受体相互作用动力学,tiotropium如图所示(gydF4y2BaDisse et al ., 1993gydF4y2Ba),太短潜伏期会导致低估受体的亲和力。作为一个模型系统,膜表达嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体被使用,和不同的毒蕈碱的拮抗剂,如。、tiotropium ipratropium (hM的快速分离gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,见下一段),aclidinium和胃长宁,被允许平衡的存在(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba不同时期H] NMS (gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。Ipratropium达到平衡2 h后,没有任何进一步的变化表示的ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba随着时间的推移。相比之下,tiotropium需要至少20 h的孵化时间达到伪平衡,显示的图片的转变gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值在短时间点(照片gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值后,2、5、10 h在统计学上获得不同的使用在20 h,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。中间行为观察aclidinium和胃长宁,需要至少5 h达到伪平衡在这个实验设置。因为达到平衡所需的时间与每个寒冷的受体解离动力学测试化合物(gydF4y2BaMotulsky马汉,1984gydF4y2Ba),这些数据表明,在检测的物质中,tiotropium半衰期最长的嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体。基于这些结果,测定培养时间大约20 h用于所有后续实验,因为这提供了一个令人满意的妥协之间达到平衡,同时避免膜退化。gydF4y2Ba
位移曲线分析了根据模型orthosteric[之间的竞争gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS无标号的竞争对手,所以ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值转换为gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba根据Cheng-Prusoff值方程。证明这是正确的解释模型数据,集成电路的转变gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值与增加数量的放射性配体在一个给定的实验监测用于不同的配体:集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba价值观改变线性相关性的提高放射性探针([gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS),作为竞争的假设模型中交互(gydF4y2Ba程和Prusoff, 1973gydF4y2Ba)(数据未显示)。通过这种方法,测试不同毒蕈碱的拮抗剂,pgydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba总结了在这些条件下获得的值gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
解离动力学从人类毒蕈碱的受体。gydF4y2Ba另一个重要的参数在描述发生配体和受体之间的相互作用离解速率常数,gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba,指药物受体复合物解离的速度。它曾被证实为tiotropium其缓慢的从目标受体hM离解gydF4y2Ba3gydF4y2Ba长时间是关键,它允许为每日一次tiotropium管理局(gydF4y2BaDisse et al ., 1999gydF4y2Ba)。化合物的分离率通常直接通过监测评估特定绑定的一种放射性标记的配体的利益。作为替代,Motulsky和马汉(gydF4y2Ba1984年gydF4y2Ba)引入了一个方法,一个活动特征放射性配体同时添加感兴趣的标记配体受体的准备。因为随着时间的推移,放射性配体结合的模式取决于浓度和动力学参数的竞争对手,标记化合物的分离率可以在此设置实验。之前使用这种方法已经成功地从人类评估配体的分离gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体(gydF4y2Ba道林和查尔顿,2006年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
tiotropium分解动力学参数的测定与经典的方法(即。、监控离解的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体;gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)和(即“Motulsky和马汉”方法。,via competition kinetic experiments between unlabeled tiotropium and [3gydF4y2BaH] NMS,解释下gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba;gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。tiotropium的离解半衰期值与两种不同的方法在获得接近协议(gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba0.028±0.003,0.026±0.005 hgydF4y2Ba1gydF4y2Ba分别与古典和替代方法,推导出);因此,动能的其他化合物测定值与竞争动力学实验,不需要特定的放射性配体的制备为每个化合物进行测试。的gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba和离解半衰期值不同的hM毒蕈碱的拮抗剂gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体被发表在gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。每个对手的半衰期比为hM的离解gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体是包含在gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
量化的功能竞争对抗:分析GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba途径。gydF4y2BaMgydF4y2Ba1gydF4y2BaMgydF4y2Ba5gydF4y2Ba受体可分为两个主要的功能类根据他们G-protein-coupling偏好。“奇数”MgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,米gydF4y2Ba5gydF4y2Ba受体选择性几个G的GgydF4y2Ba问gydF4y2Ba/ GgydF4y2Ba11gydF4y2Ba家庭,而“偶数”MgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和MgydF4y2Ba4gydF4y2Ba优先激活受体GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba/ GgydF4y2BaogydF4y2Ba类型g (gydF4y2Ba韦斯et al ., 2007gydF4y2Ba)。鉴于嗯gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba5gydF4y2Ba几乎只在中枢神经系统受体表达,基本上是在肺部主要hM缺席gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表达(gydF4y2Ba李et al ., 2001gydF4y2Ba),毒蕈碱的拮抗剂的功能分析是受限制的嗯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体亚型。gydF4y2Ba
选择的化验监测受体激活包括第二信使(即测量。对G、肌醇磷酸盐gydF4y2Ba问gydF4y2Ba耦合的受体和营地的GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba耦合的受体,分别)。两种不同的受体激动剂属于不同的化学类,即。氯化氨甲酰胆碱和毒蝇碱,测试。都表现为完整的受体激动剂(α= 1)嗯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,毒蝇碱是更强有力的(pgydF4y2BaDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba毒蝇碱和氯化氨甲酰胆碱值:6.7±0.1,6.0±0.1,嗯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba受体;7.3±0.1,6.7±0.1,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,分别;gydF4y2BangydF4y2Ba≥11)。gydF4y2Ba
测量不同抗胆碱能类的对抗,转变受体激动剂引起的响应曲线的存在不同拮抗物浓度根据席尔德(例如,在绘制gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba),pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba测定值。所有毒蕈碱的拮抗剂测试显示竞争力和可战胜的敌对行为(ipratropium的例证gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。大部分的测试(即抗胆碱能药物。,我pratropium, atropine, NMS, and pirenzepine) induced a parallel shift of the agonist concentration-response curve that could be perfectly fitted with the Schild equation, with a slope not significantly different from 1 (e.g., ipratropium,图3,A和BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
不同的剖面观察tiotropium aclidinium,和胃长宁,拟合剂量率在一个大范围的拮抗物浓度(10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米)导致回归斜率不同于1。山坡上是1.29±0.05,1.27±0.07,1.27±0.05 tiotropium, aclidinium,和胃长宁(见虚线gydF4y2Ba图3,罪犯gydF4y2Ba)。斜坡,明显大于1表明缺乏对手的平衡,可以预期与缓慢的受体化合物时分离动力学测试。因为在非平衡条件配体协会受体的速度与它的浓度成正比,分数拮抗剂受体入住率会降低(与之相比,在平衡)低浓度(gydF4y2BaKenakin 1984gydF4y2Ba),这将导致席尔德回归的斜率大于1。为了解决这个问题,这些对手在更高浓度(即进行测试。,从10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米)与half-logarithmic浓度的步骤。这种调整,席尔德回归原来是线性斜率与单位(gydF4y2Ba图3,罪犯gydF4y2Ba),允许p的正确估计gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值也为这些毒蕈碱的拮抗剂(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
正如预测的那样为竞争性拮抗剂受体理论的基础上,pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值获得每个毒蕈碱的拮抗剂对两种不同的受体激动剂非常相似。此外,pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与p值密切协议gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值确定绑定化验(比较表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)如预期竞争(即。,orthosteric, surmountable, and reversible) antagonists.
分析GgydF4y2Ba我/秒gydF4y2Ba通路。gydF4y2Ba泛函分析对手的对hM的效能gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体测定与分析。与英国gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,受体激动剂毒蝇碱和氯化氨甲酰胆碱测试存在的腺苷酸环化酶活化剂forskolin检测GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba产品(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。如预期的刺激GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba耦合的受体,嗯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,两个受体激动剂诱导浓度抑制营形成相同的效能(pgydF4y2BaDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值分别为7.6±0.1毒蝇碱和氯化氨甲酰胆碱)。奇怪的是,通过进一步增加受体激动剂的浓度,观察信号的反演剖面和增加阵营积累检测(pgydF4y2BaDgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值:5.4±0.1,5.6±0.1毒蝇碱和氯化氨甲酰胆碱,分别)。这种行为与M的滥交的耦合是一致的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba即受体不同的G, GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba和GgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba如图所示,Mistry et al。(gydF4y2Ba2005年gydF4y2Ba)。因为相当多的争胜的效能差异的两种不同的途径,GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba分可以在每一个钟形曲线争胜,孤立和pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值可以精确地确定(gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba说明了ipratropium对G的影响gydF4y2Ba我gydF4y2Ba- - - GgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba介导的反应。gydF4y2Ba
hM的分析gydF4y2Ba2gydF4y2Ba耦合到GgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba进一步调查的百日咳毒素(PTX),哪块GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba信号(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。在这种情况下,受体可以一对GgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba子单元,因此,分析受体激动剂和拮抗剂的行为反映了只有对这个途径的影响。PTX预处理后,有效力和略有增加gydF4y2BaEgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba的克gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba调节碳酰胆碱反应(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba删除后,比较B和A)一如预期抑制组件(即。GgydF4y2Ba我gydF4y2Ba耦合)。gydF4y2Ba
因此,对于每一个对手,pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba价值观决定在forskolin (G监测他们的对抗能力gydF4y2Ba我gydF4y2Ba耦合的嗯gydF4y2Ba2gydF4y2Ba受体)或细胞中使用百日咳毒素(监控他们的能力去对抗英国gydF4y2Ba2gydF4y2Ba通过G受体信号gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba——)。有趣的是,对于每一个对手,两个pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值没有显著不同于对方(gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba),这表明受体拮抗剂的亲和力是不会受到其耦合到不同的g。gydF4y2Ba
体内Bronchoprotection。gydF4y2Ba最后,我们调查了bronchoprotective毒蕈碱的拮抗剂的影响在两个功能的体内模型中acetylcholine-induced支气管麻醉狗。静脉注射、重复管理乙酰胆碱导致气道阻力增加,影响主要由活化的毒蕈碱的MgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,可以通过与抗胆碱能类阻止这种受体亚型。gydF4y2Ba
与每个喇嘛剂量范围研究进行麻醉狗3 h (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。在此设置中,由吸入了毒蕈碱的拮抗剂的使用Respimat软雾吸入器连接的气管导管通风狗,药效及其保护动物免受acetylcholine-induced支气管痉挛记录3 h。在这种背景下,剂量诱导bronchoprotection 80%定义为完全有效剂量。gydF4y2Ba
所示gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,tiotropium剂量依赖性保护狗对acetylcholine-induced支气管收缩。完全有效剂量确定3μg /狗。在这个剂量,bronchoprotection 73% 3 h后仍保留。gydF4y2Ba
Aclidinium,测试在吸入剂量的3、10和30μg (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),剂量依赖性抑制ACh-induced broncho-constriction。然而,与tiotropium相比,一个显著高剂量(30μg) bronchoprotection必须达到80%。在这个剂量,aclidinium保留52% bronchoprotection 3 h。此外,胃长宁剂量依赖性抑制胆碱能支气管狭窄(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。12μg,完全有效剂量的49% bronchoprotection 3 h后观察。gydF4y2Ba
下一步,毒蕈碱的拮抗剂研究在充分有效剂量(3μg tiotropium, 30μg aclidinium,和12μg胃长宁)狗模型中的24小时的时间内获得信息的时间行动在临床上更相关的时间计划(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
符合第一系列实验,所有化合物诱导的初始bronchoprotection超过80%。bronchoprotection水平明显不同,24小时后抗胆碱能类:tiotropium 24小时后显示bronchoprotection 35%;相比之下,aclidinium保留减少活动(21%),而胃长宁的活性下降更快。通过12 h胃长宁吸入后,观察bronchoprotection完全丧失。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
胆碱能增加支气管狭窄中的语气是主要的可逆的组件在慢性阻塞性肺病。因此,毒蕈碱的对手是最有效的慢性阻塞性肺病、支气管扩张剂,几项研究表明β的优越性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂(gydF4y2BaSkorodin,总值1984gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雷纳德et al ., 1996gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
病人的依从性是至关重要的成功管理慢性疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘(gydF4y2Ba弯曲机,2002gydF4y2Ba)。复杂或多个治疗方案影响患者依从性;因此,简化给药方案(例如,每天换一次剂量)是一个重要的策略来改善遵从性(gydF4y2Ba田村和研究员合作,2007年gydF4y2Ba)。Tiotropium治疗慢性阻塞性肺病的建立,是市场上唯一的喇嘛,每日一剂量政权提供高病人的依从性(gydF4y2Ba克莱默et al ., 2007gydF4y2Ba)。这种成功的策略是紧随其后的是几家公司,同样,正在开发其他与潜在的每日一次政府毒蕈碱的拮抗剂。gydF4y2Ba
在这里,我们描述一个全面的临床比较毒蕈碱的对手与潜力每日一次政府,即tiotropium和试验性药物aclidinium (LAS34273)和胃长宁(后- 237)。绑定的研究表明,所有测试喇嘛对毒蕈碱的受体有高亲和力在平衡条件下,subnanomolargydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值。平衡结合实验对(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS遵守Cheng-Prusoff方程,表明测试喇嘛的竞争行为。这些数据进一步支持的功能在体外实验中,竞争(即。,orthosteric and reversible) behavior of the LAMAs was indicated by the parallel shift of the agonist curves, without depression in the maximal effect achieved. Importantly, binding affinities and functional potencies are in close agreement, as expected on the basis of receptor theory, with tiotropium being the most potent antagonist at the hM3gydF4y2Ba受体,主要药理bronchodilation目标。gydF4y2Ba
尽管常用参数在讨论在受体拮抗剂行动是它的亲和力,drug-receptor互动的动态过程是更好的捕捉到协会和离解率等参数。速率常数允许我们预测drug-receptor系统响应在时间动态变化,以及它如何表现,因此,更理解药物作用的生命系统相关参数。特别感兴趣的在这种情况下是毒蕈碱的拮抗剂的离解率从他们的目标,嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,其体内相关的时间行动。事实上,实现缓慢分解动力学的目标受体在药物设计代表了一种新颖的方法增加药物的药效学原理是行动和时间在每日一次tiotropium管理在临床实践(gydF4y2BaDisse et al ., 1999gydF4y2Ba)。在这里,我们确认tiotropium在hM的停留时间长gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体与两个独立的方法(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。重要的是,我们的数据表明,hM tiotropium绑定gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体是完全可逆的,当分离允许进行足够长的时间。同样的,gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba值计算aclidinium和胃长宁;与离解hM的半衰期10.7和6.1 hgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,分别,一个不会预测每日一这些化合物在临床实践中,至少当只考虑药效学原理行动的持续时间。然而,药物作用持续时间可以依赖药代动力学因素,包括吸收、组织分布、间隙(gydF4y2Ba罗伯茨,2003gydF4y2Ba)。获得信息功能bronchoprotective属性,考虑药效学和药代动力学性质,不同的喇嘛被测试在一个模型中acetylcholine-induced支气管麻醉狗。因为胆碱能的增加被认为是主要的可逆的语气组件在慢性阻塞性肺病(gydF4y2Ba巴恩斯,2004gydF4y2Ba),这个模型是高的临床相关性。首先,dose-range-finding研究进行3 h,和剂量诱导80% bronchoprotection被定义为完全有效剂量。比较化合物在这些剂量将避免天花板效应bronchoprotection水平接近100%。完全有效,因此最初equieffective剂量的各自对手随后被狗模型用于研究一个24小时的时期。在这个实验设置,我们假设的持续时间的抑制效果不同的抗胆碱能类结果从分离的速度从毒蕈碱的受体和额外的药代动力学因素,如局部保留肺及其化合物的化学和代谢稳定性。所有毒蕈碱的拮抗剂诱导剂量依赖性bronchoprotection ACh挑战,效力范围的tiotropium >胃长宁> aclidinium。令人惊讶的是,aclidinium的能力相对较低,考虑到其高hM的亲和力gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体在体外。初步研究表明,化学不稳定性aclidinium水解决方案可能是负责观察(未发表的数据)。比较行动期间的毒蕈碱的拮抗剂equieffective剂量显示tiotropium诱导bronchoprotection的最高水平(35%)后24小时后跟aclidinium(21%),而胃长宁未能保护航空公司超过12 h。这些数据是在协议与以前的研究测试胃长宁豚鼠支气管收缩模型(gydF4y2BaVilletti et al ., 2006gydF4y2Ba),胃长宁的影响减少到三分之一的最初反应后16 h,而一个均等的剂量tiotropium仍完全有效的在相同的时间间隔(gydF4y2BaVilletti et al ., 2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
最近,据报道,胃长宁能产生持久的bronchoprotection, 30 h,在轻度哮喘病人(gydF4y2Ba汉斯et al ., 2005gydF4y2Ba)。然而,胃长宁的长期效应是实现1 - 2毫克的剂量,即。在至少200倍剂量的有效剂量tiotropium(5μg)。等需要使用高剂量不能完全合理化的基础上胃长宁低亲和力的MgydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体与tiotropium(10倍的区别;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。我们假设高剂量的胃长宁不仅是必要的,以弥补其能力还较低,更重要的是,“积累”这种化合物在肺部,从而实现长时间的操作(gydF4y2BaVilletti et al ., 2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
总之,我们执行一组临床前实验来更好地了解不同的药理学毒蕈碱的拮抗剂和预测,在此基础上,他们的行为在临床设置。与他们的协议gydF4y2BaKgydF4y2Ba从gydF4y2Ba值的嗯gydF4y2Ba3gydF4y2Ba受体,tiotropium仍然诱导狗模型中的大约40% bronchoprotection后24 h,而aclidinium完全未能显示一半的有效和胃长宁bronchoprotective影响后。在此基础上,我们推测,一个假定的胃长宁——或者aclidinium-based治疗慢性阻塞性肺病可能需要超过每日一次政府一样有效的当前与tiotropium治疗使用。另外,超大的有效剂量的使用可能会使研究人员克服他们的行动持续时间较短,可能通过一种机制意味着药物仓库在肺部的一代。这种方法是否会增加不必要的药物反应的风险,与吸入高剂量,因此潜在的系统性风险更高,和/或更高程度的变异在药物吸收不同的患者群体,仍有待观察。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢海尔格镍和安吉拉Ostermann优秀的技术援助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
文章、出版日期和引文信息可以发现gydF4y2Bahttp://jpet.aspetjournals.orggydF4y2Ba。gydF4y2Ba
doi: 10.1124 / jpet.109.152470。gydF4y2Ba
缩写:gydF4y2Ba慢性阻塞性肺病,慢性阻塞性肺疾病;(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] NMS, [gydF4y2BaNgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba甲基gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2BaH]莨菪碱氯甲烷;嗯,人类毒蕈碱的受体;乙酰胆碱,乙酰胆碱;喇嘛,长效毒蕈碱的对手;秋,中国仓鼠卵巢;PTX、百日咳毒素;ipratropium溴化(1gydF4y2BaRgydF4y2Ba3gydF4y2BargydF4y2Ba,5gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,8gydF4y2BargydF4y2Ba)8-isopropyl-3 - [(±) -tropoyloxy] tropanium溴铵一水化物;溴化tiotropium 6β7β-epoxy-3β-hydroxy-8-methyl-1αgydF4y2BaHgydF4y2Ba5αgydF4y2BaHgydF4y2Ba溴化-tropanium di-2-thienylglycolate;LAS34273 aclidinium溴铵(3gydF4y2BaRgydF4y2Ba)3 - {(hydroxydi (thiophen-2-yl)乙酰基)氧}1 - (3-phenoxypropyl) 1λ5-azabicyclo (2.2.2) octan-1-ylium溴化;3 -溴化后- 237,胃长宁(α-cyclopentylmandeloyloxy) 1, 1-dimethylpyrrolidinium溴离子。gydF4y2Ba
-
- 收到了gydF4y2Ba2009年2月16日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2009年5月26日。gydF4y2Ba
- 美国社会的药理学和实验性疗法gydF4y2Ba