文摘
肺纤维化的特点是过度沉积在肺间质细胞外基质蛋白。新型大环内酯物免疫抑制剂SDZ RAD,雷帕霉素类似物,抑制生长因子依赖于间充质细胞,并可能因此扩散治疗对肺纤维化疾病的治疗。
在这项研究中SDZ RAD的影响对博来霉素lung-collagen积累模型大鼠肺纤维化的研究。SDZ RAD·kg(2.5毫克−1·天−1)或药物载体被每日填喂法的口服药物。成功证实了剂量测量脾重量。总lung-collagen含量的高效液相色谱定量测定羟脯氨酸。
动物给博来霉素和药物载体,肺总胶原蛋白增加了182±11%(平均±sem)与生理盐水相比控制在14天(p < 0.001)。lung-collagen积累的增加降低了75±12% (p < 0.01)在动物SDZ RAD,并伴随着伴随56±6% (p < 0.001)降低肺的重量。
SDZ RAD目前在临床试验中防止器官移植排斥,另一个条件特点是细胞外基质过度生产。作者提出,SDZ RAD认股权证评价作为一种新型治疗代理纤维化肺病。
本研究由英国医学研究理事会(英国),威康信托基金会(项目批准号051154)和米德尔塞克斯医院特殊的受托人。
肺纤维化的结束阶段是一个异质群体的疾病特点是细胞外基质蛋白的过度沉积在肺间质内1。有充分的证据表明,这一过程是由产生的生长因子和细胞因子激活炎症和免疫细胞,诱导成纤维细胞增殖或产生过量的胶原蛋白2。目前治疗指南推荐免疫抑制治疗糖皮质激素,咪唑硫嘌呤和环磷酰胺3,4。不幸的是,这些药物有明显的副作用,可怜的成功率5。因此具有更好的耐受性和迫切需要更有效的治疗方法。
雷帕霉素(RPM)是一个已经大环内酯物对淋巴免疫抑制剂产生强有力的抗增殖作用,nonlymphoid细胞通过抑制细胞因子和生长因子介导的细胞信号6。RPM已经成功地用于四氯化碳肝纤维化模型7,但其有用性作为治疗剂是有限的次优的药代动力学性质。口腔生物利用度是克服问题的发展新的口服RPM模拟,40 o - (2-hydroxyethyl)雷帕霉素SDZ RAD8。这个代理是在实体器官移植预防慢性移植排斥。短期内的安全性和耐受性SDZ RAD移植受者已经建立稳定9,10,研究评估这些患者的疗效和其他固体器官接受者正在进行。最近,SDZ RAD可以减弱引起的肺动脉高血压和血管内膜形成政府的野百合碱pneumonectomized老鼠11。
本研究的目的是评估SDZ RAD作为小说antifibrotic代理通过评估其影响lung-collagen积累在博来霉素的肺纤维化模型。
方法
动物
实验使用男性刘易斯老鼠年龄在6周。内政部和批准的程序都是按照动物科学程序法案1996。
试验协议
老鼠的肌肉注射麻醉0.75 - -1.0毫升·公斤−1Hypnorm(枸橼酸芬太尼(0.315毫升·公斤−1)和fluanisone(10毫升·公斤−1);詹森制药、英国威科姆)。硫酸进行气管切开术和博来霉素(BLM;Lundbeck公司,它是一家英国卢顿)是由一个气管内的(信息技术。)注入(1.5 mg·公斤−1体重在0.3毫升无菌生理盐水)如前所述12。控制动物收到0.3毫升无菌生理盐水(SA)。
SDZ RAD微乳液(2.5 mg·公斤−1·天−1瑞士诺华制药公司)(巴塞尔),用蒸馏水稀释(DW)和由每日填喂法,开始前1天BLM管理。控制动物收到DW日常填喂法。动物被分为四组:实验1)SA信息技术。+ DW口头;2)公司信息技术。+ RAD口头;3)BLM信息技术。+ DW口头;和4)BLM信息技术。+ RAD口头。10组动物,六为组织学分析、生化分析和四个牺牲在第14天使用过量的腹腔内pentobarbitone紧随其后的是横断的主动脉。lung-collagen评估,血管灌注与5毫升包含100 U·毫升生理盐水−1肝素。肺被移除全体删除后的主要可见支气管,涂抹干燥,称重和snap-frozen液氮。组织学研究肺被固定信息技术。25而言不啻滴剂的福尔马林的压力2o .气管是结扎和胸内容删除全体。
胶原蛋白测定
Lung-collagen内容的高效液相色谱(HPLC)定量评估羟脯氨酸(如前所述)13。简单地说,100毫克整除的肺组织粉水解3毫升的6 M盐酸在110°C 16 h。玉米胚芽蛋白酶解物与30毫克活性炭混合,过滤(微孔,类型哒,0.65µm)。150年µL整除的10个稀释过滤使用真空离心浓缩器干了水解。羟脯氨酸是孤立的,用反相高效液相色谱法与7-chloro-4-nitrobenz-2-oxo-1推导后,3-diazole (NBD-Cl;σ,英国普尔)。在每个肺胶原蛋白的总量计算,假设肺胶原蛋白含有12.2% w / w羟脯氨酸14和结果表示为毫克胶原·肺−1。
病理检查
肺组织是嵌入在石蜡,切成段(5µm),与苏木精和伊红染色())。部分被病理学家检查盲目使用光学显微镜(PSH)×100放大。每个连续的字段是单独评估严重性的间质纤维化和主之间的分数使用阿什克罗夫特评分系统15。检查所有字段的平均得分为每个动物的肝纤维化评分。
统计分析
结果提出了均值±sem。统计学意义组之间为正态分布数据使用一个未配对t检验和评估Mann-Whitney紫外线测试非参数数据。一个p < 0.05被认为是显著的。
结果
脾脏重量/评估药物疗效
为了评估RAD的免疫抑制效果,脾脏重量测量后14天的日常填喂法。脾脏重量减少了21±5% (p < 0.01)与动物相比,动物给SA + RAD SA + DW。脾脏重量更大的差异(40±3%;p < 0.01)对动物给BLM + RAD,与动物相比,鉴于BLM + DW,但没有显著差异在脾脏重量为动物SA + DW和BLM + DW(图1⇓)。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/19/6/1124/F1.medium.gif)
影响bleomycin-induced SDZ RAD的肺纤维化。脾湿重,b)肺湿重和c)肺总胶原蛋白。□:蒸馏水;┘:RAD。* *: p≤0.01;* * *:p≤0.001;#:p≤0.0001。
肺的重量
之间没有显著差异在肺湿重的动物给SA + RAD和SA + DW。正如所料,肺湿重增加了170±4%的动物被BLM + DW与SA + DW组(p < 0.01)。在BLM-treated动物,RAD政府明显减弱肺重量的增加56±6% (p < 0.001)(图1 b⇑)。
肺胶原蛋白
的信息技术。滴注法BLM没有药物治疗引起的特点182±11% (p < 0.01)在肺胶原蛋白增加14天(图1 c⇑)。lung-collagen积累的增加降低了75±12%与动物相比,动物给BLM + RAD BLM + SA。RAD独自管理没有影响基底lung-collagen saline-treated动物的水平。显示结果的代表两个不同的实验,在统计上有显著差异的肺总胶原蛋白药物治疗动物和那些给BLM独自和药物载体。
阿什克罗夫特得分
14天肺组织的组织学评估显示,没有证据表明动物的肝纤维化SA + DW或SA + RAD。与此形成鲜明对比的是信息技术。BLM的滴注法与平均Ashcroft-fibrosis得分是2.5对动物给BLM + DW和3.5 BLM + RAD组。Ashcroft-fibrosis得分两个治疗组之间的差异不显著。BLM的纤维化组织松散,焦点和黏液状的,按照其最近的性质。正常肺的焦点也在场。肺损伤是最近有高水平的相关急性慢性炎症与纤维化混。
讨论
本研究的目的是研究大环内酯物免疫抑制的影响,SDZ RAD BLM的肺纤维化模型。它已被证明,第一次,这个代理原因lung-collagen急剧减少(75%)积累在这个模型中没有任何不利影响基底(SA)控制)胶原蛋白水平。减少与获得的报道效果与antifibrotic代理pirfenidone在这个模型中,目前正在进行临床试验16。此外,减少lung-collagen积累SDZ RAD是比这更大的获得与大环内酯物有关,以前的博来霉素研究红霉素17,以及在研究中使用单一anticytokine /生长因子方法,如政府的肿瘤生长因子(TGF) -β可溶性受体或TGFβ-neutralizing抗体18,19。这使得SDZ RAD非常有前途的候选人为进一步的临床评估。
尽管SDZ RAD的前途影响lung-collagen积累在这个模型中,组织学评价未能表现出显著差异仅在动物接收BLM之间Ashcroft-fibrosis分数和那些接受BLM RAD。这是令人失望的,但可以解释道。评估药物效应在这个模型的组织学评估,因为是出了名的困难信息技术。滴注法博来霉素导致纤维化非常不完整的20.对抽样误差,因此敏感。此外,尽管Ashcroft-scoring方法显然是能够区分SA信息技术。和BLM信息技术。组,很难区分地区的急性炎症和肺炎的纤维化。的insensitivity of the Ashcroft score to discriminate between established fibrosis and pneumonitis may explain why there was no difference between the two BLM groups using the Ashcroft score. Furthermore, the authors observed the absence of a close temporal relationship between hydroxyproline change and morphological change estimated by histology, in other experiments. This suggests that histological change postdates changes in hydroxyproline and as a consequence quantifiable histological change was not seen in this experiment. Therefore, it is believed that quantification of fibrosis by biochemical assessment of hydroxyproline is a more reliable and definitive method for examining the effects of antifibrotic agents in this model and the dramatic reduction obtained with SDZ RAD in this study is encouraging.
的机制SDZ RAD变弱lung-collagen积累在这个模型中可能包括其免疫抑制和抗增殖效果。以及RPM, SDZ RAD是强有力的大环的免疫抑制药物仅绑定到immunophilins时生物活性。但是,与其他成员的这类免疫抑制剂(如。他克莫司(吸收FK506)和环孢菌素A), SDZ RAD和RPM不抑制细胞因子基因激活但是施加其影响通过阻断cytokine-dependent细胞增殖。immunophilin-RPM复杂的哺乳动物的目标(mTOR)是一个蛋白激酶磷酸肌醇的3-kinase家庭。RPM绑定mTOR块核糖体的激活p70 S6激酶和细胞循环所需蛋白质的合成进展nonlymphoid和淋巴细胞21。在RAD-treated动物,与动物相比,脾脏重量显著降低药物的载体。因为脾重量反映t细胞质量,这表明该代理在一个剂量免疫抑制。t淋巴球在BLM的角色模型是目前争议和只在老鼠身上被实验进行检查,而不是老鼠。初步研究提供证据表明T-cell-dependent细胞因子的生产可能发挥重要作用在博来霉素lung-collagen积累模型,自“裸色”小鼠肺纤维化,耗尽t淋巴球,显示减少纤维化反应22。然而,最近的研究在SCID小鼠已经挑战了这一观点23。除了对淋巴细胞)的影响,也有充分的证据表明RPM可以抑制生长因子依赖人肺成纤维细胞增殖在体外24,所以fibroproliferative响应的衰减SDZ RAD也可能在这个模型中扮演一个角色。进一步的实验来阐明SDZ RAD的确切作用机制在这个模型应该十分丰富,将是未来研究的重点。
最后,本研究显示,第一次,SDZ RAD戏剧性的抑制性影响lung-collagen积累在博来霉素的肺纤维化模型。这个代理是口头,有利的药代动力学性质和异体移植术的临床试验已经被评估。自当前治疗肺纤维化疾病目前不足,作者提出,SDZ RAD需要评估作为一个小说antifibrotic代理。
确认
作者要感谢诺华制药公司的那种礼物SDZ RAD微乳液,特别是w·舒勒(移植研究,诺华制药公司)有用的建议。
- 收到了2001年9月19日。
- 接受2002年1月11日。
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