摘要
toll样受体2 (TLR2)是toll样受体家族的一员,在识别分枝杆菌和随后的免疫反应激活中起着重要作用。TLR2的遗传多态性(残基753处精氨酸替换为谷氨酰胺(Arg753Gln))与TLR2功能的负面影响有关,这可能反过来决定宿主对分枝杆菌的先天反应。本研究的目的是研究结核病(TB)患者与健康对照组相比TLR2基因Arg753Gln单核苷酸多态性。
进行回顾性病例/对照研究。研究了151名结核病患者与116名种族和年龄相匹配的健康对照组患者TLR2基因Arg753Gln多态性。
TLR2多态性(腺嘌呤(A)等位基因)分别在17.9%和7.7%的结核病患者和对照组中观察到。当比较两组间三种基因型的比例时,AA基因型与结核病的相关性更显著。鸟嘌呤(G)和A的等位基因频率在对照组分别为0.95和0.05,在结核病患者组分别为0.86和0.14。AA和GA基因型携带者患结核病的风险分别增加6.04倍和1.60倍。
综上所述,目前的数据表明,在toll样受体2基因753残基多态性上,精氨酸对谷氨酰胺的取代影响了发生结核病的风险。
本研究由土耳其安塔利亚阿克德尼兹大学阿克德尼兹大学研究基金会资助(2002.01.0103.008)。
结核病(TB)仍然是世界范围内的主要死亡原因,据报道,自20世纪80年代初以来,该病的发病率有所增加。世界上几乎三分之一的人口感染了疟疾结核分枝杆菌而只有5-15%的感染者在其一生中患上临床结核病1,2.确切的原因为什么只有部分个体接触到结核分枝杆菌发展不受控制的疾病,其他人根除或限制疾病仍然未知。有证据表明,遗传因素可能是增加进行性疾病发展易感性的重要决定因素3.- - - - - -7.该病的免疫发病机制涉及免疫系统的几个组成部分,特别是包括巨噬细胞、T淋巴细胞、肿瘤坏死因子- α (TNF - α)和干扰素γ,它们在对抗这种微生物的防御机制中发挥主要作用。分枝杆菌的多种成分刺激巨噬细胞,导致TNF‐α的产生增加,进而进一步激活巨噬细胞,导致肉芽肿的形成8.最近的数据表明,分枝杆菌的多种成分也激活巨噬细胞,主要是通过toll样受体(TLR) 2 (TLR2)。8- - - - - -15.
TLRs包括一个哺乳动物细胞表面蛋白家族,刺激促炎细胞因子基因转录,以响应各种微生物配体。TLRs介导细胞对微生物的反应,但不是吞噬作用所必需的。哺乳动物TLR家族的成员被各种化学上不同的细菌产物牵连到巨噬细胞的激活9,16.TLR2参与多种细菌脂蛋白的识别,如从包柔氏螺旋体,支原体而且密螺旋体属,以及结核分枝杆菌13,17.阻断这种受体会使巨噬细胞丧失对分枝杆菌肽的感知和反应能力。巨噬细胞通过激活TLR2(一线防御)感知分枝杆菌的存在,触发进一步的免疫反应(TNF - α,白细胞介素- 1的产生,抗原处理,T淋巴细胞的激活,干扰素γ的产生,等。)在后来的事件中。在体外研究表明TLR2的激活直接导致细胞内杀伤结核分枝杆菌通过肺泡巨噬细胞18.
单核苷酸多态性(SNPs)是当基因组序列中的单个核苷酸(腺嘌呤(a),胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G))被改变时发生的脱氧核糖核酸(DNA)序列变异。许多SNPs对细胞功能没有影响,但一些SNPs,特别是如果它们影响基因功能,可能会使人容易患病或影响他们对药物的反应19.洛伦兹et al。17报道了一种新的TLR2基因多态性(arginine to glutamine replacement at残基753 (Arg753Gln)),导致巨噬细胞对细菌肽的反应降低,导致宿主的免疫反应减弱。
本研究的目的是研究与健康对照相比,TB患者TLR2基因Arg753Gln多态性的发生情况。
材料和方法
研究对象
研究人群包括2002年3月至2003年3月期间在Akdeniz大学医学院胸科和国家结核病控制中心(土耳其安塔利亚)接受结核病治疗的151名新诊断结核病患者。
结核病的诊断标准定义为至少有以下一项:1)临床和放射学表现与结核病一致,且至少两次痰涂片抗酸杆菌阳性;2)痰液、支气管灌洗液和/或胸膜液培养阳性,以及肺以外器官系统样本(尿液、精液、脑脊液、等。)结核分枝杆菌;3)活检材料(淋巴结、肺、等。)
没有提供确凿证据诊断结核病或患有其他疾病如获得性免疫缺陷综合征、营养不良和/或糖尿病的患者以及来自不同种族背景的患者被排除在研究之外。
对照组由来自胸科门诊的116名无关受试者和来自移植中心(阿克德尼兹大学医学院)的肾移植捐赠者组成,他们经过调查并被发现是健康的。对照组的入选标准为无急性或慢性肺部疾病和结核病阴性病史。所有的对照组都来自相同的种族和地理来源,与结核病病例生活在同一个城市。
记录人口统计学数据,包括性别和年龄,以及临床数据,包括结核病定位、结核病诊断方法、痰检查结果以及如果有的话,复发结核病诊断。
该研究得到了阿克德尼兹大学医学院当地伦理委员会的批准,并获得了所有患者和对照受试者的书面知情同意。
阿克德尼兹大学医学院中央研究实验室在结核病患者和对照组中研究了TLR2的Arg753Gln多态性。
toll样受体2残基753位点精氨酸向谷氨酰胺取代的基因分型
使用基因组DNA纯化试剂盒(MBI Fermentas, St Leon-Rot Germany)从外周血中分离基因组DNA。引物设计自TLR2编码序列(GenBank登录号88878),在开放阅读框的2258位采用扩增难解突变系统聚合酶链反应(PCR)进行TLR2多态性检测20..这种多态性导致精氨酸(CGG)向谷氨酰胺(CAG)的替代,因此产生的基因型为精氨酸/精氨酸(GG)、谷氨酰胺/谷氨酰胺(AA)和精氨酸/谷氨酰胺(AG)。
本研究所用引物核苷酸序列如表1所示⇓.提取120 ng DNA进行PCR, 1 UTaqDNA聚合酶(MBI Fermentas), 8 mM脱氧核糖核苷三磷酸(MBI Fermentas)和每个引物20 pmol。常见等位基因(G)与TLR2‐F、TLR2‐R和TLR2‐G的反应,以及罕见等位基因(A)与TLR2‐F、TLR2‐R和TLR2‐A的反应(TIB MOLBIOL,柏林,德国),在以下条件下在50 μ L的最终体积中进行:在94℃初始变性4分钟,随后在94℃变性1分钟,在62℃退火1分钟,在72℃延伸1分钟,退火温度不同。在72℃下进行终伸4 min。扩增在Genius PCR系统(Techne, Cambridge, UK)中进行。
PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,并用溴化乙锭染色。470 -碱基对(bp) PCR产物用TLR2 - F和TLR2 - R扩增,328 - bp PCR产物用TLR2 - A和TLR2 - F或TLR2 - G和TLR2 - F扩增。
p‐值<0.05被认为是显著的。卡方检验用于比较研究组的等位基因和基因型分布。Hardy-Weinberg平衡是用Haldane的精确检验来评估的21.
结果
151例研究患者中,女性52例(34.4%),男性99例(65.6%)。平均±sd年龄为35.4±13.5岁。所有患者和对照组均为土耳其裔,居住在安塔利亚市及其省份。在前3个月,从国家结核病控制中心采集了121例(80.1%)病例样本,其余患者样本在整个研究期间从阿克德尼兹大学医学院胸科医学系采集。
肺结核129例(85.4%),肺结核淋巴结炎8例(5.3%),胸膜结核10例(6.6%)。一名患者(0.7%)患有骨结核感染,另一名患者(0.7%)患有肾结核。2例患者(1.3%)同时患有肺结核和肺结核淋巴结炎(表2)⇓).
痰液或支气管灌洗涂片阳性20例(13.2%),痰液、支气管灌洗或胸膜液培养阳性111例(73.5%),活检病理检查阳性22例(14.5%)。经痰培养阳性及活检确诊为肺结核及淋巴结炎2例。7例(4.6%)诊断为复发结核病。
对照组男性53例(45.7%),女性63例(54.3%),平均年龄(sd)为35.9±14.8岁。25名(21.5%)对照受试者来自胸科门诊,其余为来自移植中心的健康器官捐赠者。每个家庭的血液样本不超过一人。
结核病患者组的基因型分布见表2⇑.TLR2 Arg753Gln多态性A等位基因出现在151例结核病患者中的27例(17.9%)(图1)⇓),而A/A等位基因多态性纯合携带者占14例(9.3%)。TLR2 Arg753Gln A等位基因出现在9例(7.7%)对照组受试者中,而2例(1.7%)为该多态性的纯合携带者。研究组和对照组均未达到Hardy-Weinberg平衡。研究组和对照组的Hardy-Weinberg精确检验p值分别为0.000和0.017。对照组的偏差可能与多纳入一个AA受试者有关,因为如果只有一个而不是两个该基因型受试者,就不会有偏差,即。偏差最小。采用卡方检验评价两组间三种基因型比例的差异,AA基因型与TB的相关性高于GA和GG基因型(p=0.022)(表3)⇓).G和A的等位基因频率在对照组分别为0.95和0.05,在患者组分别为0.86和0.14。AA和GA基因型易患结核病的优势比分别为6.04(95%可信区间(CI) 2.01-20.08)和1.60(1.01-2.55)。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/23/2/219/F1.medium.gif)
典型扩增难溶突变系统聚合酶链反应(PCR)分析结果为:a) GA(多态性杂合载体);b) AA(多态性纯合载体);c) GG(正常)基因型。上面的条带代表470个碱基对的内控PCR片段,下面的条带代表G(通道1)和A(通道2)等位基因。
TLR2多态性与结核病定位无显著相关性(p>0.05)。然而,两例肺结核合并淋巴结炎中的一例是罕见变异的纯合子携带者(表2)⇑).此外,在7例复发结核病患者中,有4例是TLR2多态性的纯合携带者,3例是杂合携带者。
由于每种类型的结核病也可能被认为是不同的表型,因此仅对肺结核患者进行了进一步的分析。肺结核组男性88例(68.2%),女性41例(31.8%),平均年龄35.6±13.6岁。A的等位基因频率为17.8 (n=23)。与11例肺结核患者(8.5%)和2例健康对照组(1.7%)检测到纯合(AA)基因型。用卡方检验评估两组三种基因型比例的差异时,AA基因型与TB的相关性高于GA和GG基因型(p=0.019)(表3)⇑).肺结核组G和A的等位基因频率分别为0.87和0.13,对照组为0.95和0.05。肺结核组AA和GA基因型易患结核病的优势比分别为5.55 (95% CI 1.68-18.34)和1.73(1.07-2.80)。
讨论
在本报告中,结核病患者与健康对照之间TLR2 Arg753Gln多态性基因型和等位基因分布均存在显著差异。此外,在土耳其健康对照组中,TLR2 Arg753Gln多态性基因(A等位基因)的等位频率为4.7%(1.7%纯合和6%杂合)。洛伦兹et al。17在3%的人群中发现了这种突变。需要进一步的数据来确定多态TLR2基因是否显示出种族差异的分布。
目前的数据清楚地表明,在患者组中,纯合子AA基因型的频率明显高于健康对照组,即使只考虑肺结核患者,这种差异仍然显著(表3)⇑).目前的数据还表明,TLR2多态性的AA和GA基因型受试者患结核病的风险分别比GG基因型携带者高6.04倍和1.60倍。据作者所知,这是第一个显示TLR2基因多态性与结核病发生之间关联的报告。
先前已经证明,TLR2多态性导致巨噬细胞对几种细菌肽的反应能力下降17.姜、蔡22研究了一种不同的,精氨酸到typtophan取代残基677,在麻风病患者中TLR2基因多态性,发现多态性与麻风病而非结核性麻风病的发生有很强的相关性。这一发现表明TLR2基因及其多态性在疾病易感性中的作用,可能是通过受损的第一线防御机制。
Bochudet al。23显示TLR2基因多态性导致巨噬细胞对巨噬细胞的反应严重受损麻风杆菌和结核杆菌.研究还表明,小鼠TLR2中的突变(TLR2‐P681H)是TLR2信号的主要负性抑制剂,该突变在RAW细胞系中的表达抑制了肿瘤坏死因子的诱导,以响应毒性和无毒结核分枝杆菌22.Reilinget al。10研究了对空气传播感染的抵抗力结核分枝杆菌在TLR2、TLR4和CD14敲除小鼠组和对照组中,发现TLR2敲除小鼠在高剂量暴露下对TB的抵抗力下降,但在自然低剂量空气传播感染条件下,两组之间没有观察到差异。这些数据表明携带有缺陷的TLR2基因可能是增加进行性结核病易感性的一个致病因素。然而,没有直接证据表明这种多态性会导致免疫反应的降低结核分枝杆菌.尽管TLR2多态性在结核病患者和健康对照组之间具有重要意义,但仅在一小部分结核病患者(17.9%)中存在。因此,TLR2基因多态性可能是影响疾病易感性的因素之一,而免疫反应不同步骤中的其他因素或缺陷(甚至TLR2或其他TLRs的其他多态性)也可能是无法防止结核病感染向疾病发展的原因。已有研究表明,干扰素γ受体、IL‐12或IL‐12受体缺乏或信号换能器和转录激活因子1突变的个体对分枝杆菌感染的易感性增加7,24- - - - - -26.其他研究的数据表明,天然耐药相关巨噬细胞蛋白1(溶质载体家族11,成员1)和维生素D受体基因的snp有助于人类对结核病的易感性27- - - - - -29.
在本研究中,包括所有连续的结核病病例,但大多数是肺结核患者。不可能证明所涉及的系统与TLR2多态性之间存在关联。然而,肺外结核病例的缺乏限制了对这些数据进行统计分析,以确定器官偏好与宿主TLR2等位基因之间的可能联系(表2)⇑).值得注意的是,7例复发病例中有4例存在GA(3例)和AA(1例)基因型,而在1例肺结核和淋巴结炎患者中检测到纯合子AA基因型。因此,本文作者认为,需要更大的序列来检测TLR2基因多态性与器官偏好之间的可能联系,以及疾病的临床严重程度。
土耳其是一个结核病发病率中等的国家,1999年达到每10万人33.7人,2000年达到每10万人26.3人30.,31.在这种情况下,土耳其所有儿童在出生后不久就常规接种Calmette-Guérin(卡介苗)疫苗。到1998年为止,卡介苗接种政策由4期(2个月、5岁、12岁和17岁)改为3期(2个月、5岁和12岁)。因此,结核菌素皮肤试验(TST)在土耳其的阳性率很高,TST阳性并不能决定性地区分由于接触暴露或卡介苗接种。在土耳其人群中,获得TST阴性对照组的机会几乎是不可能的,因此,对照组没有进行TST以排除结核病。
病例组中哈迪-温伯格平衡的偏离可能是由真正的遗传关联引起的。考虑到对照组出现Hardy-Weinberg平衡偏差的可能原因,由于患者和对照组的基因分型是由同一实验室的同一实验室技术人员同时进行的,因此认为基因分型错误率是最小的。在组建研究组过程中,为避免将近亲属纳入,每个家庭只纳入一名受试者。然而,这是不可能评估发生的家庭内婚姻的受试者。近亲婚姻在土耳其仍然很普遍,1989年安塔利亚的农村和城市地区的近亲结婚总比率分别为35.2%、39.6%和28.3%32.因此,近亲繁殖可能导致在对照种群中观察到的哈迪-温伯格平衡的轻微偏离。由于对照人群和病例人群都是从同一来源人群中选择的,因此有人认为,观察到的SNP与结核病的关联可能与这种多态性或与另一种功能变体的连锁不平衡的直接功能影响有关。
总之,toll样受体2基因753残基上精氨酸与谷氨酰胺的取代多态性是另一个可能影响结核病发展易感性和严重程度的候选基因,需要进一步更大规模的研究来阐明这一问题。
致谢
作者要感谢H. Gulkesen的统计分析和F.Gunseren的建设性批评。作者还感谢N. Meric、G. Bilginer、E. Yegin、Z. savcic和G. Taner(土耳其安塔利亚国家结核病控制中心)为结核病患者提供服务,并感谢E. Toprak提供技术援助。
- 收到了2003年6月2日
- 接受2003年8月28日。
- ©ERS期刊有限公司