摘要
半乳糖凝集素-1和-3调节上皮细胞增殖/凋亡和中性粒细胞激活,并与肺癌和哮喘有关。半乳糖凝集素在以上皮细胞改变和中性粒细胞浸润为特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用尚不清楚。
在本研究中,我们通过免疫组织学检测了8例重度COPD患者肺标本中半乳糖凝集素-1和-3的表达,并与9例非吸烟者和6例非吸烟者进行了比较。这些结果与上皮细胞增殖(Ki-67)、组织炎症和肺功能有关。
上皮半乳糖凝集素3免疫染色时非吸烟者和吸烟者相比,COPD患者小气道有增无减。与此相反,半乳凝素1只显著在组吸烟者的小气道增加。Ki-67的+上皮细胞和中性粒细胞在与吸烟者相比COPD患者的小气道增加。此外,上皮内嗜中性粒细胞在小气道相关与Ki-67 +上皮细胞和与在一秒钟内/用力肺活量比的用力呼气量。然而,利用半乳凝素表达没有观察到相关性。
本研究支持以下假设:远端气道是检测慢性阻塞性肺疾病改变的重要部位。在重症患者中,小气道上皮中半乳糖凝集素-3表达增加和中性粒细胞聚集,与上皮细胞增殖和气道阻塞相关。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见疾病,其主要特征是易感吸烟者发生的不可逆气道阻塞1.< 1 ?显示=[]吗?在疾病过程中,COPD气道通过上调细胞间粘附分子-1或CXC趋化因子受体3等粘附分子,被中性粒细胞、巨噬细胞和t细胞(特别是CD8+)浸润2,3..然而,参与招募的白细胞,特别是中性粒细胞在COPD患者支气管中持续存在的途径仍有待确定。此外,COPD气道中存在的白细胞表型与疾病严重程度和支气管组织内的微定位有关4.
除炎症变化外,COPD气道还经历了结构重塑5.这包括:1)粘膜下腺的粘膜腺泡数量和大小增加;2)大、小气道表面分泌粘液的杯状细胞分别增生和化生;3)鳞状化生5.导致上述变化的机制尚不清楚。另外,支气管上皮功能在COPD患者的影响,用细胞因子/趋化因子的上调表达6如白细胞介素(IL)-8或巨噬细胞炎症蛋白-1α和-1β,以及蛋白的下调,如聚合免疫球蛋白(Ig)受体7,可能是在中性粒细胞酶降解之后8.
半乳糖是半乳糖结合蛋白,参与肺生理学9- - - - - -12.通过将Labinin族在细胞外基质中的结合蛋白受体竞争,Galectin-3可以通过限制与基底膜的粘合来增强呼吸上皮细胞的增殖。13.半乳凝素-1和-3也参与凋亡调控通过结合细胞表面或细胞质配体,如纤维连接蛋白受体的聚糖,CD7或细胞内蛋白,如b细胞白血病/淋巴瘤2基因产物10,14.半乳糖凝集素-3的核和/或胞质表达模式可能在恶性转化中发挥作用,正如在乳腺癌中所提示的那样15.此外,半乳凝素3是已知的:1)触发氧代谢物和中性粒细胞和巨噬细胞弹性蛋白酶的释放;2)增强巨噬细胞吞噬作用;和3)刺激自然杀伤细胞活性和IL-1的产生14,16.它还代表粘附分子与选择素和β无关2-整合素是链球菌肺炎期间中性粒细胞向肺募集的基础17,18.相反,半乳糖凝集素-1可抑制单核细胞/巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α14提示半乳糖凝集素-1和-3在细胞凋亡/增殖和吞噬细胞活化方面具有平衡、相反的作用。值得注意的是,这两种凝集素在肺中大量表达11,18.
半乳糖凝集素-3在肺癌和哮喘中的作用已被评估,但其在COPD中的作用尚不清楚。因此,我们采用免疫组化方法检测了8例接受肺移植的重症COPD患者大气道和小气道支气管上皮中半凝集素-1和-3的表达。来自9名非吸烟者和6名非COPD吸烟者的肺标本作为对照。在大气道和小气道中,凝集素的表达与气流限制、上皮细胞增殖(Ki-67表达)和上皮细胞和固有层中中性粒细胞、巨噬细胞和t细胞的组织聚集有关。
材料和方法
病人
正如之前在其他地方描述的那样,COPD患者是从肺移植人群中招募的7.根据全球慢性阻塞性肺病分类倡议,8名非常严重的COPD患者被列为IV期1,都包括在内。The mean (range) age was 52 (42–60) yrs. The COPD patients were ex-smokers, had symptoms of chronic bronchitis and all but one were treated by inhaled corticosteroids. Controls consisted of six patients, aged 60 (42–74) yrs, recruited from a population of smokers without COPD and nine nonsmokers (mean age 62 yrs) undergoing lung surgery for a solitary peripheral lung tumour. All patients were clinically stable with no evidence of lung infection at the time of surgery. Pulmonary function tests were performed 37±26 (mean±sd)。对每个患者,随机从一个或两个肺(单肺或双肺移植)的每个叶的中心和外周区域取样组织块(每个患者3至11个),在恒定的充气压力(30 cmH)下固定2O),用4%甲醛处理,进行免疫组化处理。患者特征见表1⇓.
免疫组织化学
组织切片进行胶质免疫染色。内源过氧化物酶活性在0.03%培养液中被抑制V./V.H2O2和切片进行正常马血清和抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒(DAKO,Glostrup的,丹麦)阻断。Sections were then treated for 30 min with 1:100 rabbit polyclonal anti-human galectin-1 or -3 antibodies, which had been rigorously tested for specificity by ELISA and Western blotting12,19,20..对照切片用正常兔血清(1:100)孵育。采用生物素化马抗兔IgG(1:100)作为二抗,切片与亲和素-生物素-辣根过氧化物酶(ABC标准试剂盒Vectorstain;Dako)。用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐和0.03% H2O2,部分用甲苯胺蓝染色。
使用针对中性粒细胞弹性蛋白酶(中性粒细胞)、CD68(单核细胞/巨噬细胞)和CD3 (t淋巴细胞)的特异性抗体检测白细胞。对于巨噬细胞和t细胞,在0.01 M pH 5.7的柠檬酸缓冲液中使用微波处理(5个周期3分钟,350瓦)进行抗原回收。0.03% H的培养抑制了内源过氧化物酶活性2O2和切片被1%牛血清白蛋白封闭。然后将部分与小鼠单克隆抗体孵育至中性粒细胞弹性蛋白酶(MIGG1κ,克隆NP57; Dako)或CD68(MIGG3κ,克隆PG-M1; Dako)或与CD3(Dako)的多克隆兔抗体。用正常的兔血清或小鼠IgG同种型适当处理控制部分。二次抗体是生物素化的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(Dako)。通过与链霉抗生物素蛋白 - 过氧化物酶缀合物孵育并使用二氨基苯甲酸和H透露反应。2O2.切片用Mayer's hemalum进行反染色,用Eukitt medium (Vel, Leuven, Belgium)的盖子进行安装。
使用MIB-1单克隆抗体(DAKO)和先前描述的抗小鼠检测方法进行KI-67抗原染色。
计算机辅助免疫染色定量
免疫染色的定量方法与之前发表的方法相同7.在10个随机选择的保存完好的支气管上皮区域(每个受试者3 ~ 11个)进行了Galectin和Ki-67染色研究,每个切片(每个受试者3 ~ 11个)中,无论大小气道。在每个切片上随机选择10个上皮区域、10个固有层区域和10个粘膜下腺体区域进行白细胞浸润评估。大气道被定义为带有粘膜下腺体的软骨性支气管,小气道被定义为膜性细支气管,没有软骨或腺体,内径小于2mm,如前面所述21.每张幻灯片上有2到9个不同的气道,每个受试者总共有10到21个大气道和9到28个小气道。在非吸烟者、吸烟者和COPD组中分别分析了30、34和45个组织切片。
计算机辅助定量选定区域的染色使用SAMBA 2005系统(法国格勒诺布尔阿尔卡特TITN),配备彩色摄像机和光学显微镜(奥林巴斯BX 50;奥林巴斯光学有限公司,东京,日本),使用最终放大400×。结果表示为平均光密度(以任意单位),代表的意思是染色强度在考虑区域,随着标签索引(按分),代表的比例表面染色面积的选择,因此,反映阳性细胞的相对数量。
统计方法
对每个患者的不同部分中的染色指数进行统计分析。进行了两种类型的比较。首先,针对来自不同部分中获得的染色指数和组之间的比较来计算每个患者的平均值(COPD与对照),采用Mann-Whitney u检验。其次,对配对数据进行组内比较与小气道),使用Wilcoxon配对检验在同一切片(大气道和小气道均存在)获得。相关性采用非参数Kendall检验或Spearman方法进行检验。p值<0.05被认为有统计学意义。结果以中位数和范围表示。
结果
半乳凝素-1的气道表达和-3在COPD和对照患者
在来自对照和COPD患者的支气管上皮内检测到Galectin-1表达(图1A⇓),以及在固有层特别是在内皮细胞(数据未显示)。Galectin-3 immunostaining was observed in bronchial epithelial cells, especially in the cytoplasm of ciliated and sero-glandular cells (fig. 1b⇓),而巨噬细胞也可见染色(图1b)⇓).
a)半乳糖凝集素-1和b)慢性阻塞性肺疾病患者小气道半乳糖凝集素-3染色和c)正常兔血清对照染色。箭头表示肺泡巨噬细胞中半乳糖凝集素-3的表达。
虽然在大气道中没有观察到半乳糖凝集素的表达变化,但与不吸烟者相比,吸烟者的支气管上皮在小气道中表现出半乳糖凝集素-1的表达增加(大约增加3倍;p < 0.001;图2⇓).在COPD中,半乳糖凝集素-1的表达也有增加的趋势(p = 0.06,与不吸烟者相比),但远低于吸烟者(图2)⇓).
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/5/914/F2.medium.gif)
半乳糖凝集素-1和-3在支气管上皮中的表达。a)半乳糖凝集素-1和b)半乳糖凝集素-3在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者大、小气道中的上皮表达与非吸烟者(Nonsm)和吸烟者(Sm)用平均光密度(MOD)表示。水平条代表中值。盟:任意单位。* *: p < 0.01;#: p = 0.06 (Mann-Whitney U-test)。
相比之下,在小气道上皮中半乳糖凝集素-3的表达在吸烟者中有增加的趋势(p = 0.06),在COPD中强烈增加(大约增加2倍;p < 0.001;图2⇑).
Ki-67在COPD和正常气道中表达上皮细胞
与吸烟者相比,重度COPD患者小气道中表达Ki-67的上皮细胞数量显著增加(p = 0.05;图3⇓).COPD大气道Ki-67染色未见明显变化(数据未显示)。
![图3-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/29/5/914/F3.medium.gif)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)和对照组支气管黏膜上皮增生(Ki-67染色)在重度COPD患者、非吸烟者(Nonsm)和吸烟者(Sm)的小气道中显示了表达Ki-67的上皮细胞的相对数量(以标记指数(LI)表示)。水平条代表中值。#:P = 0.05(Mann-Whitney U-Test)。
慢性阻塞性肺病气道中嗜中性粒细胞、巨噬细胞和t细胞浸润
与对照组相比,重度COPD患者中性粒细胞数量显著增加(p<0.001;表2⇓).与吸烟者相比,中性粒细胞在粘膜腺体中升高,小,但不大的气道(表2⇓).因此,与非吸烟者相比,吸烟者大气道上皮内中性粒细胞数量有增加的趋势(表2)⇓).
CD68+单核细胞/巨噬细胞也在COPD气道中偶有聚集(数据未显示),而与对照组的染色值大致重叠(表2)⇑).然而,与不吸烟者相比,吸烟者和COPD患者小气道中巨噬细胞的相对数量显著增加(表2)⇑).
在COPD气道(数据未示出)周围观察淋巴灶,与吸烟者相比,上皮细胞和小型气道的下皮细胞数增加(P = 0.003和P <0.001;表2⇑).
半抗素,上皮增殖,气道炎症和肺功能之间的关系
小气道上皮半乳糖凝集素-3表达与COPD上皮细胞增殖或中性粒细胞浸润无关。在小气道中,Ki-67+细胞数量与中性粒细胞相关(p = 0.03, r = 0.76;图4⇓).此外,通过一秒用力呼气量(FEV)评估,上皮内中性粒细胞与气流阻塞相关1/ /强制生命能力比(p = 0.001,k = -0.93)和耻骨细胞单核细胞/巨噬细胞与FEV相关1(图5⇓).
严重慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者小气道中性粒细胞(棕色染色细胞)与Ki-67+上皮细胞(棕色染色细胞)的关系c)具有代表性的同型(小鼠免疫球蛋白G1κ)对照。d)重症COPD患者小气道内Ki-67+增殖的上皮细胞按Spearman法绘制中性粒细胞。李:标签索引。P = 0.03, r = 0.76。
重度慢性阻塞性肺疾病患者小气道中性粒细胞、巨噬细胞与肺功能的关系气道阻塞的功能参数(1秒用力呼气量(FEV)1)和fev.1/强制生命能力(FVC)比率绘制成A)内皮中性粒细胞(P = 0.001,K = -0.93)和B)表达为平均光学密度(MOD)的耻骨血压巨噬细胞(P = 0.03,K = -0.73)价值观。%pred:%预测;盟:任意单位。K(肯德尔的TAU)和P值根据KENDALL测试计算。
讨论
半乳糖素是分泌凝集素,其参与中性粒细胞募集和细胞凋亡/增殖的调节,特别是在肺部发育和炎症反应期间10- - - - - -14.本研究首次发现半乳糖凝集素-3在重症COPD患者小气道上皮表达增加。相反,在非COPD吸烟者小气道中观察到半乳糖凝集素-1增加。通过评估包含不同气道代的大量组织标本(完整的外植肺和手术标本),这可能提高了检测组间差异的能力22然而,还表明,在严重的COPD中性粒细胞中优先微局部地局限于小型气道的上皮,在那里它们与增加的上皮增殖和气流梗阻相关。
研究表明,半乳糖凝集素-1的表达可在鼻息肉中诱导皮质类固醇治疗,这可能限制组织嗜酸性粒细胞增多23.半乳糖凝集素-1表达减少和半乳糖凝集素-3表达增加与幼年特发性多发性关节炎滑膜单核细胞凋亡缺陷有关24.最近的一项研究表明,半乳糖凝集素-3是心脏成纤维细胞的有丝分裂细胞,诱导胶原沉积,并可能导致心室功能障碍25.在肺中,半乳糖凝集素-3的上皮表达在非小细胞肺癌中增加26,27而在小鼠哮喘模型中,针对半乳糖凝集素-3的基因治疗可抑制变应原诱导的气道炎症,包括IL-5的表达和上皮粘液化生28- - - - - -30..半乳糖凝集素-3的分泌也在辐射诱导的肺纤维化大鼠模型中上调31,32.
本研究中观察到的凝集素表达的变化可能与COPD的发病机制有关,因为凝集素控制上皮细胞和炎症细胞的凋亡以及中性粒细胞和巨噬细胞的激活。因此,半乳糖凝集素-3参与中性粒细胞的招募,并触发其氧自由基和弹性酶的释放14,其被认为介导由吸烟引起的肺破坏33.然而,目前的研究集中在气道而不是肺实质,肺泡上皮细胞和内皮细胞凋亡率的增加可能是肺气肿发生的基础34,包括在终级COPD中35,36.小气道中半乳糖凝集素-1和-3之间的平衡改变有利于COPD中观察到的支气管上皮增生。在COPD小气道中观察到增殖(表达Ki-67)上皮细胞数量增加,与之前报道的大支气管的鳞状化生区相同37.Ki-67在重症COPD患者的肺泡壁中表达升高38,而另一名研究中的控制保持不变36.有趣的是,在目前的研究中,小气道中的Ki-67+上皮细胞数量与中性粒细胞相关,表明炎症和组织重塑之间存在联系。因此,在哮喘中,变应原激发后Ki-67+上皮细胞增加与气道嗜酸性粒细胞增多有关39.另外,这些相关性可能是由于表达Ki-67抗原的上皮内炎症细胞的存在。虽然不能排除这种可能性,但Ki-67染色与中性粒细胞浸润上皮细胞无关通过慢性阻塞性肺病连续切片的Ki-67染色和中性粒细胞检查(数据未显示)。
无COPD吸烟者小气道支气管上皮中半乳糖凝集素-1表达增加,与半乳糖凝集素-3的增加趋势平行,提示半乳糖凝集素-1和-3之间的平衡受损,有利于气道炎症和重塑,仅在发展为COPD的易感吸烟者中观察到。很容易推测,在不敏感的吸烟者中,半乳糖凝集素-1可能有助于抑制炎症和增殖反应的信号。然而,本研究的目的不是探讨这些变化的机制,这些变化可能与COPD支气管上皮的内在变化或与严重疾病相关的非特异性因素,如缺氧40.也不能排除治疗COPD的调整效果,尽管吸入的皮质类固醇治疗似乎不太可能考虑到Galectin表达的观察到的变化23.
本研究未发现重度COPD患者上皮半乳糖凝集素-3表达与中性粒细胞聚集之间的相关性。正如前面了41- - - - - -45,观察到严重COPD患者气道的中性粒细胞渗透。本作者表明,严重COPD患者中的中性粒细胞在粘膜腺体和小型气道中更特别地局部,后者与轻度阶段COPD相反46- - - - - -48.吸烟者的特征是近端支气管嗜中性粒细胞浸润,特别是在上皮内。如之前在其他地方报道的43,45尽管在本研究中观察到小气道中巨噬细胞数量有增加的趋势,但在吸烟者中观察到的巨噬细胞数量在很大程度上与吸烟者重叠。
关于T细胞,在大气道中观察到基团之间的无显着差异。这与先前对温和至中等COPD的研究表现出增加的耻骨上皮CD342,44,45和CD8细胞44,45在大型航空公司。相反,在Di Stefano的一项关于严重慢性阻塞性肺病的研究中等等。49, CD3和CD8细胞数量减少,并与气流受限程度呈负相关,提示吸烟引起的支气管炎症随着疾病的进展而下调。另外,重度COPD可能代表具有独特免疫表型的COPD患者的一个特定亚组。然而,目前的研究结果证实了t细胞浸润了重症COPD患者的小气道,正如在COPD肺实质中观察到的那样50在肺血管周围51这一事实与之前对严重慢性阻塞性肺病的一项研究一致52之前在轻度慢性阻塞性肺病病例中也有报道48.此外,示出的是,与不吸烟者相比,T细胞数量减少表征吸烟者不COPD。正如上面所提到45,这一观察结果可能与CD3细胞计数较低的吸烟受试者亚群的选择有关,这些人更能抵抗香烟烟雾的影响。
最近有报道称,在COPD中中性粒细胞微定位到平滑肌53以及与CXC趋化因子的局部表达54.同样,哮喘患者支气管周围平滑肌内肥大细胞的定位55是否与平滑肌细胞释放CXCL10有关56.这项研究表明,上皮内,相比于上皮下,中性粒细胞与气道阻塞严重COPD相关因素微本地化。除了生产半乳凝素-3在本研究中报道的,支气管上皮细胞可表达CXC趋化因子和粘附分子,其可以促进嗜中性粒细胞的运输至气道上皮。相反地,中性粒细胞衍生的产品,如弹性蛋白酶,可以在COPD有助于局部激活上皮细胞和触发转录程序导致促炎介质的表达上皮。本作者观察到的巨噬细胞上皮下还与气流限制相关,这表明在COPD炎症细胞具有各种气道微隔间内的不同功能的影响57.
虽然少数患者限制了结论,但本研究提供了进一步证明严重COPD患者支气管上皮发生的重要变化。上调的Galectin-3表达,Galectin-1不平衡,在制定严重COPD的吸烟者的小型气道中观察到,与没有COPD的吸烟者往往展示相反的表达谱的吸烟者相比。虽然涉及其他因素,但Galectin表达的变化可能导致COPD患者气道中的上皮增生和中性粒细胞积累。值得注意的是,Galectin-2在T细胞调节中的新出现累及和心肌梗死的发病机制强调了进一步分析肺病疾病的进一步分析的重要性58- - - - - -60..
本研究表明,在严重的慢性阻塞性肺病中,小型气道上皮是中性粒细胞浸润的特定部位,与上皮增殖和气流限制有关。调查结果支持以前的研究61.,这提出了在慢性阻塞性肺病的病理生理学中的小型导电气道的重要作用。建议,上皮的慢性损伤在易感吸烟者中有易受影响的吸烟者,增强的Galectin-3表达,并且中性粒细胞对小气道上皮的微观定位是严重的慢性阻塞性肺病中的特定和功能相关的特征。
致谢
作者要感谢p Thurion(实验室的组织病理学,鲁汶大学Mont-Godinne,比利时)为他的优秀的技术援助和鲑鱼,c . Decaestecker和n D 'Haene(实验室的组织病理学,布鲁塞尔大学布鲁塞尔,比利时)帮忙统计分析和染色量化。作者还想感谢L. Wilcock(伦敦帝国理工学院,伦敦,英国)对手稿的语言修订。
- 已收到2005年6月25日。
- 接受2007年1月3日。
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