更正
2013年8月21日:Bloom Ci，Graham Cm，Berry MPR，Rozakeas F，Redford PS等。（2013）校正:转录血液标记可区分肺结核、肺结节病、肺炎和肺癌。PLOS ONE 8(8): 10.1371/annotation/7d9ec449-aee0-48fe-8111-0c110850c0c1。https://doi.org/10.1371/annotation/7d9ec449-aee0-48fe-8111-0c110850c0c1观点修正
数据
摘要
引文：Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Rozakeas F, Redford PS, Wang Y, et al.(2013)转录血液标记区分肺结核、肺结节病、肺炎和肺癌。PLoS ONE 8(8): e70630。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630
编辑：Jyothi Rengarajan，美利坚合众国埃默里大学医学院
已收到：2013年3月23日;公认：2013年6月20日;发布：2013年8月5日
版权：©2013 Bloom等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
资助:AOG, CMG, PSR, Medical Research Council (U117565642)， FR &耗材，Institute Merieux, SILA, CIB, Medical Research Council Clinical Research Training Fellowship资助;RJW & KAW, MRC U1175.02.002.00014.01, Wellcome Trust 084323和088316,EDCTP (IP.07.32080.0002)，和欧盟(FP7 IRSES295214)。在巴黎招募患者(DV, GG, MM和DB)，并获得AP-HP资助(PHRC AOR-09-085);里昂，里昂网络(里昂民事临终关怀行动促进会)。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。
利益争夺：合著者罗伯特·威尔金森是《公共科学图书馆·综合》编委会成员，但这并不改变作者对共享数据和材料的所有公共科学图书馆政策的遵守。除此之外，所有其他作者都宣称不存在相互竞争的利益。
介绍
大约九百万例新的活性结核病（TB）和TB的140万人死亡，每年均估计全球发生[1]．及时诊断对于避免治疗延迟至关重要，因此能够与其他肺部条件区分TB的能力，这些肺部条件与TB类似于结节病，或急性（群落获得的肺炎）或慢性（原发性肺癌）呈现很重要。
结核病和结节病是普遍的多系统疾病，优先涉及肺部，通常以类似的临床，放射性和组织学方式出现。因此，区分这些疾病可能需要侵入性活组织检查。肉芽肿形成对既有条件和病原体的根本结核分枝杆菌被认为是结核病的疾病原因，结石的下潜是未知的［2］．肉芽肿炎症中涉及的途径也很糟糕，并且对疾病特异性差异几乎没有了解。结核病和结节病还可以显示与急性肺传染病如群体获得的肺炎和慢性肺病等原发性肺癌等血糖传染病相似的呈现。
鉴于这些疾病的复杂性，系统生物学方法可能有助于解开主要宿主免疫反应。外周血具有反映体内其他地方的病理和免疫变化的能力，并且可以通过血液转录签名来确定疾病相关的改变的鉴定［3］．为了支持这一概念，我们最近在伦敦和南非的肺结核患者中证明了一种干扰素(IFN)诱导的血液特征［4］，现已在非洲的三项独立研究中验证[5]，[6]和印尼[7]．血基因表达分析也已成功应用于其他传染病和炎症性疾病，例如Systemic Lupus红斑（SLE），以帮助了解疾病机制并改善诊断和治疗［3］．最近的两项研究使用了血液转录谱来比较肺结核和结节病;两项研究都发现，这两种疾病有相似的转录反应，其中涉及到ifn诱导基因的过度表达[8]，[9]．然而，这些研究没有检查其他类似的肺部疾病提出这些转录签发是否也反映了其他肺病的问题。
我们研究的主要目的是通过比较肺结核病患者，肺结结病，肺炎和肺癌患者中发现的血液转录反应来改善我们对免疫病变和结核病潜免疫病变和TB的理解。我们还比较了在每种疾病的治疗前后进行的血液转录反应，并检查了肉芽微粒疾病的不同白细胞群中所见的转录反应。此外，我们研究了临床活性与观察到的血液转录异质性之间的结节症。
方法
研究人群和纳入标准
大多数TB患者招募了伦敦皇家自由医院NHS基金会信托。患有皇家自由医院NHS基金会信托，圣玛丽医院帝国学院NHS Trust，Barnet和Chate Farm NHS Trust招聘了康斯特氏症患者，在伦敦，牛津的牛津圣诞病诊所，牛津丘吉尔医院和巴黎的阿维塞纳医院。肺炎患者被招募伦敦皇家自由医院招募。在法国里昂协作网络招募了试验集中的肺癌患者和5例TB患者。所有患者都随着时间的推移招募，使得培训集首先招募，然后是测试集，验证集，最后用于细胞纯化的患者样品。在我们之前的研究中招募和分析的肺和潜TB患者获得了另外的血基因表达数据，然后在该研究中重新分析TB治疗前后的反应[10]．
纳入标准对每种疾病有特异性。肺结核患者：文化证实结核分枝杆菌在痰或支气管肺泡灌洗;肺结节病:由结节病专家诊断，活检肉芽肿，符合临床和放射学检查结果(招募后6个月内)，根据WASOG指南［11］；社区获得性肺炎患者:符合英国胸科学会诊断指南［12］；肺癌患者:由肺癌专家诊断，组织学和放射学特征与原发性肺癌一致;健康对照组:性别、种族、年龄与患者相似，QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT) (Cellestis)试验阴性。所有患者和健康对照组的排除标准包括显著的其他病史(包括任何免疫抑制，如艾滋病毒感染)，年龄在18岁以下或怀孕。患者是在2009年9月至2012年3月期间招募的。除非另有说明，患者在开始治疗前被招募。
道德声明
本研究由伦敦中央3研究伦理委员会（09 / H0716 / 41）和CPP Sud-Est IV，法国，CCPPRB，Pitié-Salpétrière医院（Paris）批准。所有参与者都提供了书面知情同意书。
基因表达分析
通过标准静脉切开术，在收集后立即剧烈混合，将3毫升全血收集到坦克管（应用生物系统/ amaion）中，并在RNA提取之前储存在-20和-80°C之间。根据制造商的说明，使用1.5ml全血和Magmax-96血液RNA分离套件（应用生物系统/ ambion）分离RNA。使用Globinclear 96孔格式套件（应用生物系统/ Ambion）根据制造商的说明，250μg分离的总RNA为珠脂。使用Agilent 2100 BioAnalyzer（Agilent Technologies）评估总和均蛋白降低的RNA完整性。使用Nanodrop8000分光光度计（NanoDrop产品，Thermo Fisher Scientific）评估RNA产率。然后使用Illumina Customprep RNA扩增试剂盒（Applied Biosystems / Ambion）从珠素减少的RNA的200-250ng制备生物素化的扩增的反义互补RNA（CRNA）靶标。将750ng标记的CRNA与Illumina人HT-12 V4珠芯片阵列（Illumina）杂交过夜，其含有超过47,000个探针。根据制造商的说明，在Illumina Iscan上洗涤，堵塞，染色并扫描并扫描并扫描。然后使用GenomeStudio（Illumina）进行质量控制并产生信号强度值。
微阵列的细胞纯化和RNA加工
采集全血中肝素钠。使用淋巴准备蛋白™(Axis-Shield)密度梯度从粒细胞/红细胞中分离外周血单个核细胞(PBMCs)。使用磁性抗体偶联(MACS)全血珠(Miltenyi Biotec, Germany)，按照制造商说明书从PBMCs中依次分离单核细胞(CD14+)、CD4+ T细胞(CD4+)和CD8+ T细胞(CD8+)。红细胞裂解后从粒细胞/红细胞层分离出中性粒细胞，然后用CD15+ MACS珠(Miltenyi Biotec, Germany)。从全血(5 ' Prime PerfectPure Kit)或分离细胞群(Qiagen RNeasy Mini Kit)中提取RNA。总RNA完整性和产量的评估如上所述。然后使用NuGEN WT-Ovation™RNA Amplification和Encore BiotinIL模块(NuGEN Technologies, Inc)从50 ng总RNA中制备生物素化的扩增反义互补RNA (cRNA)靶标。使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen, Germany)对扩增的RNA进行纯化。然后按上述方法处理cRNA。
原始数据处理
原始数据使用genspring GX 11.5版本(安捷伦技术)进行处理，所有分析采用以下方法。在减去背景后，每个探针都被赋予一个标志来表示其信号强度检测P.价值。标记用于过滤掉至少10%的样本中没有导致“present”调用的探测集，其中“present”的下限为0.99。然后将信号值设置为阈值10，对log2进行转换，并使用75对每个芯片进行归一化th百分比变化的算法。接下来，每个基因的标准化是通过将每个信使RNA转录本除以所有样本的中位数强度进行的。所有的统计分析都在此阶段之后进行。原始微阵列数据已存入GEO(登录号GSE42834)。实验中收集和分析的所有数据都遵循微阵列实验最小信息(MIAME)指南。
数据分析
Genespring 11.5用于选择从所有转录物的中值（无监督分析）的表达可变性显示表达变异的转录物。将过滤器设定为仅包括从中值的至少两倍变化的转录物，并且存在于≥10％的样品中。未经监督的分析用于衍生3422份转录物。应用非参数统计过滤器（Kruskal Wallis试验与FDR（Benjamini Hochberg）= 0.01），未经监督的分析，产生1446-转录物和1396-转录签名。两个签名只有在其中统计滤波器的群体仅不同的差别;1446，五组（结核病，结核病，肺炎，肺癌和对照）和1396，六组（结核病，活性结节病，非活跃的结节病，肺炎，肺癌和对照）。
每一种疾病的差异表达基因是通过将每种疾病与一组与种族和性别匹配的对照组进行比较得出的，差异在10%以内。genespr11.5用于选择与对照组平均表达差异≥1.5倍且具有统计学意义的转录本(Mann Whitney unpaired FDR (Benjamini Hochberg) = 0.01)。比较独创性途径分析(IPA)(独创性系统公司，Redwood, CA)用来确定与每一种疾病相对于其他疾病的差异表达基因相关的最重要的典型途径(Fisher’s exact FDR(Benjamini Hochberg) = 0.05)。每个比较IPA图的底部x轴和柱状图表示对数(p值)，顶部x轴和线表示该通路中存在的基因百分比。
如前所述测定与健康状况（MDTH）的分子距离[13]，然后应用于不同的转录签名。如前所述，转录模块分析被应用[14]．在每个样品和该数据集中存在的所有对照之间比较了从背景杂交中显着检测到的所有转录物的原始表达水平。每个模块中显着表达基因的百分比由颜色强度表示（学生T检验，P.<0.05)，红色表示过表达，蓝色表示过表达。在特定模块中，显著基因的平均百分比和这些基因与对照组相比的平均折叠变化也以图形形式显示。MDTH和模块分析在Microsoft Excel 2010中进行计算。GraphPad Prism版本5用于生成图形。
利用微阵列显著性分析(SAM)获得训练集结核患者与活动性结节病患者之间的差异表达基因(问：<0.05）和≥1.5倍的表达变化[15]．由于与Mann-Whitney相比，由于这种非参数测试的敏感性增加而允许在结核病和活性结节病之间鉴定更差异的表达的转录物，因此使用了SAM。使用机器学习算法支持向量机（SVM）在Genespring 11.5内进行类预测。该模型是使用示例分类器的“TB”或“不是TB”构建的。SVM模型应在一个研究队列中构建，并在独立的队列中运行，以防止过度拟合预测签名。我们研究的所有队列都是可能的。在研究队列使用不同的微阵列平台的情况下，SVM模型必须重新构建该队列。为减少过度拟合的效果，始终使用相同的SVM参数。使用的内核类型是线性的，最大迭代100,000，成本100，比率1和验证类型n折叠，其中n = 3，10重复。使用Microsoft Excel 2010计算曲线（AUC）下的接收器操作曲线（ROC）和区域。
采用stata9 (StataCorp 2005)进行单因素和多因素回归分析。Stata统计软件:第9版。大学城,TX;StataCorp LP)。在多变量回归分析中，如果数据点缺失(血清ACE和HRCT疾病活度)，以防止列表缺失，则使用虚拟变量调整。
使用POWER分析和示例大小软件（PASS）2008进行功率计算。
结果
肺肉芽肿性疾病，结核病和结节病等于血液转录曲线，但不同于肺炎和肺癌
结核病和结节病的群组，社区获得的肺炎和肺癌患者，以及健康对照表1图和图S1-S3，并在临床上和临床上适当匹配（表S1-2）。计算电力是针对训练集（标准差= 0.4,3,000探针真正差异表达的，折叠变化≥1.5，两个样品T检验，FD为0.05）。每组八至40名患者为每种探针提供大于0.85的功率（使用PASS 2008计算），随着提高样品尺寸的最小益处。
无偏见的分析表明，TB和结节病血症转录型谱组合在一起，但与肺炎和癌症明显，它们本身聚集在一起（培训集; 3422册，图S4A)．统计过滤生成1446个差异表达转录本(Training Set，图S4B)．这种聚类模式在一个独立队列中得到了验证(测试集，图1），并没有受民族或性别的影响（数据未显示）。途径分析（IPA）揭示了TB和结节病，样品与干扰素（IFN）信号传导和免疫应答途径的过度相关（图2)．肺炎和肺癌样品与与炎症有关的过度途径有关。所有疾病均显示出富裕的T和B细胞途径。
1446-转录物在训练集合健康对照，肺结核患者，肺酸性松病，肺炎患者和肺癌患者的全血中差异表达。1446-转录物的聚类在一个独立的队列中测试了它们未来自测试集的独立队列。Heatmap显示了由无偏见的分层聚类算法组织的转录物和测试集患者的曲线。将虚线添加到Heatmap中，以帮助可视化由聚类算法生成的主群集。转录强度值归一化为所有转录本的中位数。红色转录本相对过剩，蓝色转录本相对不足。Heatmap底部的彩色杆表示配置文件所属的组。
三种显性转录物中的每一个与训练集中的不同研究组相关联。顶部成绩单簇在肺炎和癌症患者中过度丰富，与与炎症有关的IPA途径显着相关（Fisher的Fishiini Hochberg FDR = 0.05）。中间成绩单簇在结核病和结节病患者中过于丰富，与IFN信号传导和其他免疫应答IPA途径显着相关（Fisher的Chanmini Hochberg FDR = 0.05）。底部转录群体在所有患者中都是丰富的，与T和B小区IPA途径显着相关（Fisher的精确本杰明Hochberg FDR = 0.05）。
结节病症患者转录谱的异质性与临床表型相关联
结节病患者的转录谱与TB患者或健康对照组聚集（1446份转录物，图1)．因此，通过反映该时间点的疾病活动快照概况的临床参数的预定决定树评估患者的疾病活动（标记为活性或非活性）。图S5；表S3)．发现1396-转录物使用这种结节病分类进行差异表达。再次与TB患者聚集的活性结节病患者，而非活跃的结节病患者与对照组聚集（1396名转录物，图3A)．这在独立队列检验和验证集(图S6A& B;表S4A，S4B)．
在六组施用分析后，1396-转录物在训练组的全血中表达，包括分析患者的两种表型。（a）通过无监督的分层聚类组织了1396名转录物和培训患者的概况。在热图中添加一条虚线，以明确聚类算法生成的主要聚类。转录强度值归一化为所有转录本的中位数。（b）训练和试验组中的1396转录物的分子距离和试验组中的转录物的距离表明了相对于对照的转录变化的量化。平均值，sem和P-显示值（具有Tukey多个比较测试的ANOVA）。
分子距离的应用（MDTH）算法[13]对于所有疾病组显示，非活跃的结节病MDTH评分与对照量没有大量显着不同，而活跃的结节病变分数是（图3B.)．结核评分显著高于活动性结节病评分，肺炎评分显著高于肺癌评分，其中肺炎和结核的MDTH评分最高。总的来说，这表明了血液转录特征在数量上和质量上的差异。
三种数据采矿策略表明，结核病和活跃的结节病是由IFN诱导基因的主导，而肺炎和肺癌是由炎症基因的主导
我们进一步研究了与每个疾病组相关的生物学途径，使用模块化分析，[14]，IPA和对每个疾病组的顶部差异表达基因的注释。考虑到对照差异表达的所有基因的模块化分析，验证了与其他肺部疾病群体相比，TB和活性结节病表现出IFN模块的显着过表达（图4一；训练集;图S7，测试集），而肺炎和癌症患者表现出显着过表达炎症模块（图2)．与活性结节病患者相比，TB患者患有IFN诱导基因数量和其表达程度的显着性升高（图4B，4C)．与结核病和活动性结节病相比，肺炎和肺癌的炎症模块中存在的基因数量和表达程度显著增加(图4 d, 4 e)．肺炎患者显示中性粒细胞模块中存在的基因数量增加（图S8），与血液中性粒细胞计数相关（Spearman的相关性，r = 0.42，P.<0.0001）。
（a）与背景杂交相比，所有转录物的基因表达水平显着检测到（15212份转录物，P.在每个患者组之间的训练中进行比较<0.01）：TB，活跃的结节病，非活跃的结节病，肺炎，肺癌，健康对照组。每个模块对应于一组共同调节的基因，这些基因通过公正的文献分析被分配生物学功能。红点表示转录本显著过丰，蓝点表示转录本显著过丰(p<0.05)。颜色强度与该模块中的基因的百分比相关，这些模块显着表达。模块化分析也可以以图形形式表示，如（b） - （e）所示，包括训练和测试集样品。平均值，sem和P-显示值（具有Tukey多个比较测试的ANOVA）。（b）每种疾病的3个IFN模块中的基因的百分比显着过表达。（c）与对照相比，IFN模块中存在的基因表达的折叠变化。（d）每种疾病的5个炎症模块中的基因显着抑制的基因百分比。（e）与对照相比，炎症模块中存在的基因表达的折叠变化。
比较IPA，使用在每个疾病组和一组匹配的对照组之间差异表达的基因，在跨疾病的比较中揭示了最重要的途径(Mann Whitney Benjamini Hochberg说，与对照组相比变化≥1.5倍P.<0.01;TB = 2524，活性结节病= 1391，肺炎= 2801和肺癌= 1626份转录物）。前四个重要途径与蛋白质合成（EIF2信号传导），免疫应答，IFN信号传导，图案识别受体识别细菌和病毒，以及抗原呈现（图5A和表S11)．EIF2信号通路的低度由肺炎患者驱动。与蛋白质合成（核糖体蛋白和其他真核蛋白酶）相关的其他基因和展开的蛋白质反应（对过度蛋白质合成的应力反应）在肺炎患者中也显着低于肺炎患者。Perk，Chec，Abce1（数据未显示）。统计显着性（底x轴，条形图，图5A）和基因百分比（顶部x轴，线图，图5A）三种免疫应答途径主要由TB和活性结节病患者推动，再次展示了这些疾病的生物途径的相似性。然而，IFN信号通路更为显着（图5A）含有较多的TB基因，而不是活跃的结节病（图5B.)．
差异表达基因来自于训练集通过比较每个疾病健康对照组与种族和性别:结核病= 2524,活跃的结节病= 1391 = 2801肺炎和肺癌= 1626成绩单(≥1.5折变化控制的均值,曼惠特尼业务与Benjamini罗斯福= 0.01)。(A) IPA规范途径用于确定与每种疾病相关的最显著途径(i-iv)相对于其他疾病(Fisher’s exact with Benjamini Hochberg FDR = 0.05)。每个图表底部的x轴和柱状图表示对数(p值)，顶部的x轴和线表示该途径中存在的基因的百分比。EIF2信号通路中的基因主要是低丰度基因，而其他三个信号通路中的基因相对于对照主要是过丰度基因。蓝色虚线以上的路径是有意义的(p<0.05)。(B) IFN信号IPA途径覆盖在每个疾病组上。与对照组相比，有色基因在该疾病组中有差异表达(Fisher的精确FDR = 0.05)。红色基因表示过量，绿色基因表示不足。结核病的途径被放大了，这样就能看到基因的细节，除了其他疾病，它还以更小的规模再次显示，这样就更容易进行视觉上的比较。
每种疾病的前50个过度丰富的差异表达转录本与模块化和IPA分析的结果相关，其中TB和活动性结节病主要由ifn诱导基因，如IFITM3, IFIT3, GBP1, GBP6, CXCL10, OAS1, STAT1, IFI44L, FCGR1B (表S5)．在结核病中，这些比特数更大。肺炎的前50个过量的转录物由抗微生物中性粒细胞相关基因的抗微生物中性粒细胞相关基因为例如Elane，Defa1b，mmp8，阵营，defa3，defa4，mpo，ltf。基因Fcgr1a，b和c在所有四个肺病的前50个转录物中过度丰富。差异表达基因的4颗静脉图显示了每个疾病组的独特基因（图S9和表S6），具有超过三倍的TB基因数量而不是独特的活性结节病基因。TB独特基因包含与IFN信号通路和抗原呈递显着相关的免疫应答基因。独特的肺炎基因与与蛋白质合成有关的途径的大量途径有关。独特的肺癌基因与过度丰富的炎症相关途径和诸如T细胞途径的低度相关。所有四种疾病群共有的重叠基因与T和B细胞途径的低度显着相关。
结核病和肺炎患者在治疗后显示了转录谱的减少，而结节病患者对糖皮质激素的反应显示了显著的转录活性增加
我们接下来检查了对治疗的转录反应。肺炎患者，在其医院排放后至少6周随访，表现出对标准抗生素治疗的良好临床反应（表S7A.）通过模块化分析（所有可检测的转录物）和MDTH（1446-转录物）对转录谱的转录谱的转录水平减少（图6A＆6B)．在本研究不同肺病的目前研究的1446-转录物的MDTH也在完成治疗后在南非TB患者的血液中减少，恢复潜伏TB对照的签名（图6C.）支持我们之前的报告[10]．
(一)模块化分析。在至少10%的样本中，与背景杂交相比，所有转录本的基因表达水平均被显著检测到(p<0.01)，并在健康对照组和以下每个患者组之间进行比较:治疗前肺炎、治疗后肺炎患者和治疗前结节病、治疗反应不充分结节病和治疗反应良好结节病患者。红点表示转录本显著过丰，蓝点表示转录本不足(p<0.05)。颜色的强度与该模块中显著差异表达的基因百分比相关。MDTH显示了治疗后相对于对照组的1446转录本的转录变化的量化。显示平均值、SEM和p值(ANOVA with Tukey’s multiple comparison test)。(B)肺炎的病人。(D)结节病的病人。(C) Bloom等人在南非开展的研究中的结核病患者，本研究中的对照组是潜伏结核病的参与者。
结节病患者在其实践医师确定的免疫抑制治疗后显示出可变的临床反应（表S7B.）;如果在临床后续随访时，患者的治疗被分类为“治疗反应不足”;继续相同的治疗或减少治疗将患者分类为具有“良好的治疗反应”（表S7B.)．具有“良好治疗反应”的结节病患者显示出炎症转录物中的转录活性显着增加，尽管IFN诱导的转录物保持不变，但在结节病患者中没有看到“治疗反应不足”（图6A＆6B)．“良好的治疗反应”结节病患者中的前50个过表达炎症基因包括抗炎基因，例如IL1R2，DUSP1，IL18R，C-FOS，IκBα和MAPK1（表S8)．
IFN-诱导基因在结核病和结节病中的中性粒细胞中最丰富
纯化血细胞群分析显示，中性粒细胞显示出IFN诱导基因的最高丰度（图7A，B＆D；表S9& 10);在结节病和结核病患者中，单核细胞中ifn诱导基因的丰度高于淋巴细胞(图7 a e)．结核病患者的调查结果与我们之前的研究保持一致［4］．
从全血中纯化的白细胞群中测量IFN-诱导基因的表达。（a）Heatmap显示IFN诱导转录物的表达，从Berry等人2010研究中，对于该细胞类型的对照，每个疾病组都是对照的。（b）在相同IFN诱导型转录物的TB样品中的平均表达折叠变化。（c）同一IFN诱导型转录物的平均表达折叠变化。（d）与对照相比，在三个IFN模块中存在的所有基因的TB样本中的平均表达折叠变化。（e）与对照相比，三种IFN模块中存在的所有基因的平均表达倍数变化。图表显示平均值和sem。
肺结核患者可与其他肺部疾病和健康对照者区分开来
TB转录谱对最相似的群体，活性结节病的比较显示，差异表达了144个转录物，包括IFN诱导基因（表2.；训练集;微阵列的显著性分析问：<0.05，折叠变化≥1.5）。使用机器学习算法，支持向量机（SVM），这144个转录物显示出良好的灵敏度（高于80％）和特异性（高于90％），在我们自己的研究（培训，测试和验证集）和培训，测试和验证集）和的所有三个独立队列中此外，在Maertzdorf的外部队列中测试等研究[9]（表3，图S10和S11a）。然而，通过Maertzdorf提出的NIH David基因ID转换工具的76个转录物（共有76个转录物）等．为了区分结核病和结节病，表现出更低的敏感性（45-56％），尽管在我们三个独立的队列中测试时（表4.＆图S11b)．Koth发现50个基因在结核和结节病中有差异表达等等。[8]虽然在我们的三个独立队列中检测的特异性相似(超过87%)，但也导致了较低的敏感性(75-45%)。表5.＆图S11c)．分类预测可能受到每个研究中使用的不同微阵列平台的影响;然而，我们的144份转录本(Illumina)在Maertzdorf的外部验证等学习（安捷伦）提供了进一步证明144份转录物的辨别准确性。我们的研究之间几乎没有重叠的成绩单，Maertzdorf等学习和凯特等学习;这可能反映了Maertzdorf和Koth中缺乏衍生的成绩单列表的验证等学习 （图S10)．
讨论
我们展示患有肺肉芽糖疾病，结核病和结节病的患者IFN诱导的血液转录签名，这与代表急性和慢性病症，肺炎和肺癌的肺病不同，这些血糖疾病是由炎症签名所导样的。结节病转录型材揭示了与临床疾病活性相关的异质性。IFN诱导的转录物似乎在结节病的中性粒细胞以及结核病中占主导地位。治疗结核病和肺炎患者表现出对转录活动的显着递减，然而，治疗响应性的患者揭示了由炎症转录物主导的显着更具活跃的转录型材。
我们之前报道了肺结核患者的IFN诱导血液转录签名，其与放射线疾病程度相关，治疗减少［4］，[10]目前，这项研究已在其他研究中得到证实[5]，[6]，[7]．利用公开的数据(7)和较小的患者队列，在结核和结节病患者中类似的由ifn信号主导的血液转录谱[8]，[9]已被报告以来。我们现在在TB和结节病患者中展示了一种IFN诱导的血液转录签名，使用较大的招聘参与者和肺癌和肺癌不同拟签名的新发现。通过先前未报道的临床活性表型显着相关，解释了结节病血症转录谱的异质性。[8]，[9]，[16]，但根据已知的结节病患者的临床异质性［11］，[17]．洛杉矶等等。，展示了肺活结患者肺活检表达谱之间的相关性，以及随访后渐进式纤维化或自我限制的临床分类[18]．总的来说，这些发现表明，血液转录组学方法有潜力在患者长时间随访前提供信息，并允许开发急需的工具来标准化和帮助结节病的管理。
与IFN-signalling通路在结核病和结节病,肺炎和肺癌的转录组代表炎症相关的途径,符合不同免疫发病机理的这些疾病,和肺炎的感染呼吸道导致肺部和外周血的急性炎症[19]，[20]．肺癌患者的炎症血液转录特征与炎症在原发性肺癌中的作用一致[21]，建议血液可用于组织不可用的进一步探索性研究。与所有四种疾病中的T和B细胞有关的成绩单的低度成绩单与先前的TB患者血液中的免疫细胞数量减少的观察结果一致，可能因移民或死亡而可能是由于迁移或死亡［4］，[22]，［23］．
尽管Tb和raratio病表现出类似的IFN诱导的转录签发，但全血和中性粒细胞的转录活性的显着定量差异可能反映了观察到的临床差异。结节病患者患有TB患者聚集的主要IFN诱导症状，而那些较弱的IFN诱导型材与健康对照组聚集。虽然IFNγ已被证明是控制分枝杆菌感染的至关重要［24］， 1型IFN，由细胞外分枝杆菌DNA激活胞质受体诱导[25]，或NOD2/IRF5通路的肽聚糖激活[26]，可能会加剧TB[27]［4］，[10]，[28]．尽管提示与巨噬细胞和Th1激活有关，但导致结节病的免疫途径仍未解决[29]．值得注意的是，IFNα治疗丙型肝炎是开发结节病的记录危险因素（约5％的病例）[30]；IFNß治疗也与结节病的病例报道有关[31]．结节病和结核病患者显示出类似的转录签名表明这两个肉芽肿性疾病的潜在免疫过程有很多共同之处[29]．常规表明的rAracoizosis的治疗剂是分枝杆菌，但这是辩论的证据[32]．建立该IFN诱导型签名是否反映肉芽肿的炎症，或对病原体如分枝杆菌的反应，需要研究额外的肺肉芽肿疾病。
成功治疗TB和肺炎患者抗微生物药物的患者导致血液转录签名的递减。然而，成功响应治疗的患者患有炎症转录物的MDTH的转录活性显着增加，包括抗炎基因，IL1R2，IL18RAP，DUSP1，FOS，IκBα和MAPK1，其总是伴随炎症途径的激活[33]，[34]，[35]．这与糖皮质激素刺激来自健康捐赠者的血液刺激后发现的混合转录反应一致[36]．但是，IFN诱导签名不变。在SLE中，已经表明，虽然糖皮质激素在许多细胞中抑制炎性NF-κB途径，但它们对IFNα的分泌不受血浆细胞骨质细胞的影响，提供了降低糖皮质激素敏感性的潜在原因[14]．在许多结节病患者中，导致糖皮质激素部分或可忽略的临床反应的潜在机制尚未确定[37]．
我们鉴定了144个在结核和活动性结节病之间差异表达的转录本，包括ifn诱导转录本，这些转录本仅在结核患者中过多，并在我们的三个队列和一个外部队列中将结核样本与所有其他疾病区分(Maertzdorf)等队列)[9]，（敏感性> 80％;特异性> 90％）。比较Tb和结节病患者的全血表达谱的两个先前发表的研究也衍生出转录物清单以区分疾病[8]，[9]，然而他们的列表产生了低得多的敏感性，但在与我们的队列测试时具有相似的特异性值。所有转录本列表的高特异性是由于真正结核病样本患病率低导致的非常低的I型错误率。因此，在满足大规模人群的严格检测和验证之后，血液转录标记可能有望成为肺结核诊断的支持性替代标记。
我们已经表明，与TB等血液转录组是由IFN诱导的中性粒细胞驱动的签名，这种签名的异质性反映了结节病的疾病活动。相比之下，肺炎和肺癌是炎症签名的主导。通过转录组织鉴定生物途径增强了我们对潜在因素的理解，潜在的病原体是肺肉芽肿疾病结核病和结节病和急性和慢性肺病，肺炎和肺癌。
支持信息
图S4。
肺肉芽肿性疾病显示出与肺炎和肺癌不同的类似转录签名。(A)在应用统计过滤器之前，在健康对照者、肺结核患者、肺结节病患者、肺炎患者和肺癌患者的全血中，通过训练集中无监督分析获得的3422个转录本。3422份转录本和患者档案是通过无监督的层次聚类来组织的。(B)在3422份转录本中添加统计过滤器后，1446份转录本在训练集中的所有组中得到差异表达。1446份成绩单的聚类在这里进行了独立的队列测试集。在热图中添加一条虚线，以澄清聚类算法生成的主要聚类。转录强度值归一化为所有转录本的中位数。红色转录本相对过剩，蓝色转录本相对不足。热图底部的彩色条表示配置文件属于哪个组。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s004
（PDF）
图S5。
分类结节病患者的临床决策树。决策树显示了每个结节病患者是如何被划分为活动性肺结节病、活动性胸外结节病或非活动性结节病的，使用的是已知与疾病活动性相关的临床变量，并作为标准医疗护理的一部分进行常规测量。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s005
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图S6。
活动性结节病的特征与结核相似，但不同于与健康对照相似的非结节病。1396转录本在健康对照组、肺结核患者、活动性结节病患者、非活动性结节病患者、肺炎患者和肺癌患者全血中有差异表达。1396份转录本和患者档案是通过无监督的层次聚类来组织的。在热图中添加一条虚线，以明确聚类算法生成的主要聚类。转录强度值归一化为所有转录本的中位数。红色转录本相对过剩，蓝色转录本相对不足。热图底部的彩色条表示配置文件属于哪个组。(A)测试集(B)验证集。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s006
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图S7。
模组分析显示了与结核病和结节病相关的类似途径，与肺炎和癌症不同。与背景杂交相比，显着检测的所有转录物的基因表达水平（18894年转录物，P.<0.01)比较了结核、活动性结节病、非活动性结节病、肺炎、肺癌各患者组与试验组健康对照组之间的差异。每个模块对应于一组共同调节的基因，这些基因通过公正的文献分析被分配生物学功能。红点表示转录本显著过丰，蓝点表示转录本显著过丰(p<0.05)。颜色的强度与该模块中显著差异表达的基因百分比相关。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s007
（PDF）
图S8。
中性粒细胞模块。（a）在培训和测试集中的每种疾病中，在中性粒细胞模块中显着过表达的基因的平均百分比。（b）与对照相比，中性粒细胞模块中存在的基因表达的平均折叠变化。平均值，sem和P-显示值（具有Tukey多个比较测试的ANOVA）。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s008
（PDF）
图S9。
维恩图比较了每个疾病组与对照组的差异表达基因。差异表达基因来自于训练集通过比较每个疾病健康对照组与种族和性别:结核病= 2524,活跃的结节病= 1391 = 2801肺炎和肺癌= 1626成绩单(≥1.5折离均值变化的控制,曼惠特尼Benjamini业务P.<0.01）。使用venny（Oliveros 2007）创建了4个镶嵌Venn图。IPA规范途径用于确定与每种疾病的独特转录物相关的最重要的途径（Fisher的确切FDR = 0.05）。Active SARC =活跃的结节病。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s009
（PDF）
图S10。
比较用于类预测的基因列表的维恩图。从该研究中获得基因名单（144 illumina探针），Maertzdorf等研究（其中100名探针只有76个探针被认为是使用David转换器的基因）和Koth等人研究（从Affymetrix平台获得的50个基因）。在用于比较这些列表的Illumina平台中，一些基因由一个以上的成绩单表示，例如，Koth等人研究中的50个基因转化为77 illumina探针/转录物。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S010
（PDF）
图S11。
在类预测中使用的基因列表的接收机操作曲线。接收器操作曲线和曲线下的区域并行于支持向量机的结果显示表3.- - - - - -5．（a）来自我们研究的144名转录物（b）来自Maertzdorf的76个探针等研究（c）来自Koth的50个基因等学习。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S011
（PDF）
表S1。
招募患者和对照组的人口统计资料。(A)训练集和测试集的总数，年龄，性别和种族。(B)验证集。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S012
(PPTX)
表S2。
训练集的临床特征与测试和验证集没有显着差异。（A-D）患者在训练组中的临床特征。（E-H）比较患者在测试和验证组中患者的培训临床特征（T-Test或Chi SquaredP.<0.05）。BAL =支气管肺泡灌洗液，IGRA = ICNγ-释放测定，淋巴=淋巴细胞计数，BHL =双侧肝淋巴结病，中性=中性粒细胞计数，CXR =胸部X射线，ISC =印度次大肿，CRP = C-反应蛋白，IND = indeterminate, ND = not done, N/A = not available, pred = prednisolone. Dyspnoea = breathlessness. Haemoptysis = coughing up blood. CURB65 score = pneumonia severity score where 5 is the most severe. HT = hypertension. DM = hypertension. Adeno = adenocarcinoma.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S013
(PPTX)
表S3。
结节病患者的临床特征及临床分类决策树确定。（a）培训集（b）测试集（c）验证集（d）三个数据集中所有结节病患者的人口统计数据。CXR =胸部射线照片，CT =计算机断层扫描，ACE =血管紧张素转换酶，淋巴=淋巴细胞计数，中性粒细胞计数，TLCO =一氧化碳转移因子，KCO =转移系数，FVC =强制呼气量，FEV1 =强制呼气量在1秒内，ABDO =腹部，LN =淋巴结，MED =纵隔，NA =非活跃的结节病，AET =活跃的超胸结节病，神经=神经疾病。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S014
(PPTX)
表S4。
用于将患者分类为活性或非活跃的结节病的临床分类决策树预测了结节病患者的转录谱的聚类比标准单一或多个临床变量更好。(A)单变量回归分析，根据训练集和测试集中1446转录本的无监督聚类，确定哪些单临床变量可以最好地预测那些将与结核患者聚类的结节病患者，以及那些将与健康对照组聚类的结节病患者(参见图1&S4b) (B)多变量分析，确定多个变量预测结节病患者聚类的能力。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S015
(PPTX)
表S5。
与匹配的对照相比，每种疾病的前50个差异表达的转录物。差异表达基因来自于训练集通过比较每个疾病健康对照组与种族和性别:结核病= 2524,活跃的结节病= 1391 = 2801肺炎和肺癌= 1626成绩单(≥1.5折离均值变化的控制,曼惠特尼Benjamini业务P.<0.01）。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S016
(PPTX)
表S6。
由4型venn图所确定的每种疾病的前50个差异表达的转录物独特。通过将每种疾病与种族和性别匹配的健康对照组进行比较(Mann Whitney Benjamini Hochberg称，与对照组的平均值相比变化≥1.5倍)，差异表达基因从训练集中获得P.<0.01）。用于鉴定每种疾病是独特的基因的4型静脉曲图。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S017
(PPTX)
表S7。
对开始治疗的结节病患者的药物治疗，以及在观察他们对治疗的反应后对其执业医生的临床管理。每个患者研究ID和“治疗响应类”与用于模块化分析的图例相关。当患者对其练习医生有多次访问时，使用患者的上标次数.22是在治疗和2次开始后的访问3.是随后的访问。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.S018
(PPTX)
表S11。
在IPA规范途径中存在的转录物列表图5．基因符号列出了IPA规范途径中的基因符号：EIF2信号传导，干扰素信号，模式识别受体在识别细菌和病毒的作用，以及抗原呈递途径。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070630.s022
(PPTX)
致谢
我们感谢患者和志愿者参与者。我们感谢Sally Lewis在皇家自由医院的Sarcoizis诊所的帮助下。我们感谢皇家自由医院的TB服务。我们感谢Anjali Crawshaw获得牛津招聘的帮助。我们感谢Esperanza Anguiano和Genomics Core的成员，比尔，达拉斯，用于微阵列样本。我们感谢Simon Caidan（NIMR），John Wills（NIMR）和Steve Philips（BIIR）有关样品存储和运输的帮助和建议。我们感谢FIN MCNAB用于帮助细胞净化。我们感谢Wai Yau寻求Graphics（NIMR）。我们感谢微生物学家Oana Dumitrescu和Gerard Lina帮助他们的Lyon协作网络样本。
作者捐款
实验设计:AO CIB MPRB JB VP DC HB ML。实验执行:CIB FR CMG YW PSR YK ms。数据分析:CIB AO D. Blankenship。贡献试剂/材料/分析工具:LPH ZX KAW RJW D. Bouvry GD TF MM VD GG PV RV HB MW。撰写论文:AO CIB MPRB D. Blankenship ML。
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