肿瘤坏死因子-α +489G/A基因多态性与慢性阻塞性肺疾病相关

背景

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以慢性炎症过程为特征，其中促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α被认为发挥了作用。在目前的研究中，假定参与TNF.-α基因多态性在慢性阻塞性肺病发病机制中的作用TNF.-α基因多态性在高加索COPD人群中的研究。

方法

TNF.对169例荷兰COPD患者进行了-376G/A、-308G/A、-238G/A和+489G/A位置的-α基因多态性检测，这些患者平均1秒用力呼气量(FEV1)为37±13%，并与358例荷兰人群对照组进行了比较。

结果

数据显示TNF-α +489G/A基因型频率在COPD患者中与对照组相比有差异，这是由于GA基因型频率增加所致。与此相一致，次要等位基因的携带与COPD发展风险的增加相关(优势比= 1.9,p = 0.009)。另一个TNF.-α基因多态性研究显示，患者和对照组之间没有区别。四组没有差异TNF.-α多态性在COPD亚型之间被发现，并根据放射性肺气肿的存在进行分层。然而，慢性阻塞性肺病亚型与对照组的比较显示了显著的差异TNF.没有放射性肺气肿的患者α+ 489g /基因型（χ²-test: p < 0.025 [Bonferroni校正])，而在放射性肺气肿的COPD患者和对照组之间没有观察到差异。

结论

根据报告的数据，结论是COPD，特别是具有放射性肺气肿的COPD患者的亚组，与之相关TNF.-α+ 489g /基因多态性。

促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α在炎症过程中起重要作用。该细胞因子的基因编码位于主组织相容性复合体的III类区域的第6号染色体上。这种基因的几种双等位多态性是已知的，包括TNF.-α -308G/A基因多态性，首次被发现TNF.-α基因多态性，TNF.-α-376g / a和-238g /基因多态性。后一种基因多态性位于基因的启动子区，而另一种在+ 489g / a处发现的另一种基因多态性位于基因的第一个内含子[1- - - - - -3.］．

几项研究分析了这种关系TNF.-α基因多态性与疾病。马车的TNF.-α -308A等位基因与类鼻塞病等疾病相关[4]皮肤粘膜利什曼病[5]和脑型疟疾[6]，尽管可以与脑膜炎疾病等其他疾病进行证明没有关联[7[类风湿性关节炎（RA）[8］．关于两者之间的关系报道了相互矛盾的结果TNF.-α -308G/A多态性与哮喘。几项研究发现这种疾病与TNF.-α -308次要等位基因[9，10，而阿尔布开克和他的同事们则报告了一项研究TNF.-α -308儿童哮喘常见等位基因[11］．此外，Louis等人没有显示出两者之间的任何关系TNF.-α -308G/A多态性与哮喘[12］．

有关TNF.-α -238G/A多态性，在多发性硬化症中A等位基因的频率更高[13和酒精性肝病[14，而其他人报告与恰加斯病没有关联[15]煤炭工人尘肺[16］．这TNF.-α -376G/A基因多态性被报道为脑型疟疾发生的独立危险因素[17而这种多态性与类风湿性关节炎等自身免疫性疾病无关[18］．最后，有限的研究调查了TNF.-α+ 489g /一种多态性，显示与前列腺癌的关联，并且常见可变免疫缺乏患者的颗粒组合颗粒组织[19，20.］．相反，在RA患者中报道了较低频率的次要等位基因，而在特发性肺纤维化患者中与此无关TNF.观察到-α+ 489g / a多态性[21，22］．

为了研究其功能TNF.-α基因多态性，已进行体外研究。其中一些研究表明，细胞系与未成年人TNF.与携带-308G等位基因的细胞系相比，-α -308A等位基因产生更多的TNF-α [23，24]，而其他研究TNF-α产生与TNF.-862C/A、-856C/T、-574G/A、-308G/A、-238G/A和+70(C的添加)位点的-α基因多态性均未显示出相关性[13，25，26］．因此，看来两者的关系TNF.-α基因多态性和TNF-α的产生尚未明确。

慢性炎症通常被认为是慢性阻塞性肺病患者的一个特征，并被认为有助于病理。痰中TNF-α水平升高[27并在流通中[28[COPD患者，表明这种细胞因子涉及到COPD中存在的局部和全身炎症。分析可能TNF.-α基因多态性在COPD中可能与发展这种致残性病理状态的较高易感性有关。以前，COPD和TNF.-α -308G/A多态性在台湾一株[29和日本人口[30.］．最近针对白种人COPD人群的研究并不支持这些数据[31- - - - - -33]，尽管有人认为A等位基因的纯合性使COPD预后更差[33］．在目前的研究中，假定参与TNF.通过分析在位置-376g / a，-308g / a，-238g / a，-238g / a，-238g / a和+ 489g / a的这些多态性的分析来延长与copd相关的基因多态性延长，这是迄今为止最多研究的多态性，并且据报道，如上所述，与某些疾病有关。该研究在高加索COPD群体中进行，分层用于基于高分辨率计算断层扫描（HRCT）扫描的放射性肺气肿。

研究人口和控制人口

患者组包括169名入住一家肺康复中心(Horn, The Netherlands)的白种荷兰COPD患者。COPD的诊断依据美国胸科学会[34］．1秒用力呼气量(FEV1)必须小于参考值的70%，吸入a β后FEV1增加₂-激动剂小于参考值的10%。α1-抗胰蛋白酶缺乏患者和支气管哮喘患者被排除在本研究之外。

358例来自荷兰莱顿免疫血液学与输血学系的健康荷兰白人献血者作为人群对照组。虽然从荷兰的不同地区招募，人口分层不太可能是一个问题，因为这个国家的规模小。

当地伦理审查委员会批准了该研究项目，并获得知情同意。

DNA分离和TNF-α基因多态性打字

这四个TNF.-α基因多态性位于-376G/A， -308G/A， -238G/A和+489G/A位置，相对于转录起始位点TNF.-α基因，如前所述，在来自外周血白细胞的基因组DNA中检测到[13，35］．简而言之，碎片TNF.引物'C'跨越-164/-144 (5'-TCTCGGTTTCTTCTCCATCG-3')， 'D'跨越-675/-655 (5'- gagtctcccgggtcagaatga -3')扩增-α启动子基因。扩增后的DNA片段用生物素标记探针进行斑点杂交分析，检测启动子区这三种多态性的G或A变体。类型为TNF.引物'A'生成+48/+67 (5'- ggagagagcaactacagac -3')， 'B'生成+598/+579 (5'-CACACTTAGTGAGCACCTTC-3')。PCR产物用打我(MBI Fermentas, St. Leon-Rot，德国)和大小在1.2%琼脂糖凝胶分离。在来自携带正常等位基因2的个体的PCR产物中打我存在限制性位点，产生111,159和281 bp的片段。替代+489g将导致丢失一个打我酶切位点形成两个片段，分别为159和392 bp。

计算断层扫描（CT）肺气肿分数

所有患者均采用商业扫描HRCT (Somatom Plus;西门子、德国埃朗根)。右肺和左肺均在充分吸气时以仰卧位进行5次薄层HRCT扫描。在隆突上方3cm和6cm处进行两次上区扫描，在隆突下方3cm和6cm处进行两次下区扫描，在隆突水平处进行一次扫描。扫描参数为准直1.0mm, 137 kVp, 220 mA, 1.0秒扫描时间，高分辨率重建算法(级别B800 HU;宽度:1600)。根据Sakai等的方法，采用视觉CT肺气肿评分评估放射性肺气肿分级[36]，这是基于肺气肿的严重性和程度两个方面的评估。严重程度采用4分制评分:0分，无肺气肿;1、低衰减区域直径< 5 mm;2、除< 5 mm外，外切低衰减区> 5 mm;3、弥漫性低衰减区，无正常干预肺。肺气肿的程度采用4分量表:1，< 25%的肺实质受累;2、25 - 50%的参与;3, 50 - 75%的参与;4、> 75%参与。对于10个肺野中的每一个，严重性(0-3的4分评分)乘以程度(1-4的4分评分)，得出放射肺气肿评分的程度。 The score for the ten lung fields were summed. The potential maximal score for each patient was 120. A CT emphysema score of < 30 is considered as having limited or no radiological emphysema [37］．将所有患有放射性肺气肿（CT评分> 30）的患者一起服用，与认为没有放射性肺气肿（CT得分<30）的组进行比较。

肺功能

肺功能由一名经验丰富的肺功能技术员使用气压计测量(Jaeger 7, Würzburg，德国)。所有测量均按照欧洲呼吸学会的建议进行[188bet官网地址38］．使用了至少三种技术上可接受的肺活量测定方法中的最高值。

统计分析

数据以均数±标准差(SD)表示。各组间年龄和FEV1的差异采用Mann-Whitney U检验。的χ²-检验用于检测基因型频率和性别的显著性差异。在研究小组之间的多重比较中应用Bonferroni校正。计算95%可信区间(CI)的比值比(OR)，以估计次要等位基因(未校正的p;Fisher在需要的时候精确无误)。p值小于0.05为显著差异。在进行Bonferroni校正时，统计学意义定义为p < 0.05/k，其中k为每组比较中Bonferroni校正的参数数。数据用社会科学10.0计算机程序的统计软件包(SPSS Inc.，芝加哥，IL)进行分析。

COPD人群的特征

对169名荷兰白人COPD患者进行了研究(平均年龄66±8岁，介于39-88岁之间)。男性COPD患者占COPD人群的65%。肺活量数据显示患者存在严重的气流限制(FEV1预测:平均37±13%，范围14-69%)。49例患者(29%)为当前吸烟者，115例患者(68%)为既往吸烟者，只有5例患者(3%)表示从未吸烟。目前吸烟者和既往吸烟者的平均吸烟年限为33±19年(范围2-90)。患者的维持治疗一般包括吸入糖皮质激素、β2激动剂和抗胆碱能药物(溴异丙托品)。60%的患者使用口服皮质类固醇，55%使用口服茶碱。20%的患者持续吸氧。

人口对照组由源自匿名献血者的358个随机健康的荷兰白种人受试者组成，平均年龄为40±17岁（P <0.025 [Bonferroni调整]与COPD人口相比）。507％的对照是男性，与患者群体不同（P = 0.1）。没有该人口对照组的进一步特征可用。

TNF-α基因多态性和易感性发展COPD

四种基因型频率TNF.将COPD人群与对照组的-α基因多态性进行比较，以评估两组之间的差异(表21）.在患者和对照组中，在各个位置处的等位基因TNF.-α基因处于Hardy-Weinberg平衡，χ值不显著²-values(数据未显示)。为TNF.-α+ 489g /基因多态性，观察到COPD患者和对照之间的基因型频率差异（p = 0.019），这是由于患者组中的GA频率增强。在测试的三种其他多态性中没有获得差异TNF.-α基因座位位置-376g / a，-308g / a和-238g / a。由于对照组比上述患者群体更年轻，因此如上所述TNF.COPD患者-α +489G/A基因型频率与40岁以上对照组(n = 165，年龄53±9岁)比较，差异有统计学意义(p = 0.011)。接下来是承运人之间的联系TNF.使用整个人口对照组分析-α+ 489A等位基因和发展COPD的易感性。该分析表明，与非载体（GG）（或= 1.9 [95％CI = 1.2-3.1; P = 0.009]）相比，载体（GA）载体（GA）的风险发生了显影COPD的风险，这加强了上述观察结果。

目的分析COPD各亚型是否与TNF.-α基因多态性，在HRCT扫描的基础上对存在放射性肺气肿的COPD人群进行分层(表2）.159例HRCT患者中有32例(20%)未发现放射性肺气肿，而80%的患者存在放射性肺气肿。两组患者在年龄和性别上没有差异。然而，与无放射性肺气肿的亚组相比，放射性肺气肿患者的预测FEV1%显著降低。令人惊讶的是，5个从未吸烟的患者中有4个属于没有放射性肺气肿的亚组，占患者的12.5%。相比之下，127例放射性肺气肿患者中仅有1例不吸烟(χ²-test, p < 0.01 [Bonferroni adjusted])。此外，肺气肿患者亚组的平均背包年倾向于更高。

各亚组间无显著差异TNF.-376g / a（p = 0.477），-308g / a（p = 0.334），-238g / a（p = 0.207），+ 489g / a（p = 0.184），α多态性。但是，如表所示3.的,比较TNF.- α+ 489g /没有放射性肺气肿和人口对照的患者之间的基因型显示出显着差异（p = 0.004，因此P <0.025 [Bonferroni调节]），而对照受试者与放射性肺气肿的患者没有差异（P =0.131）。在这里，分析了对贡献的贡献TNF.-α +489A等位基因(通过GA基因型与GG基因型的比较)对COPD发展风险的OR为3.6 (95% CI = 1.6 - 8.1;p = 0.003)，而对COPD合并放射性肺气肿患者和对照组的分析显示OR为1.7 (95% CI = 0.97 - 2.8;p = 0.064)。

本研究描述了COPD和四种TNF-α基因多态性在荷兰高加索人群中的关系。数据显示，与群体对照组相比，TNF-α+ 489g /基因型频率趋于不同于COPD患者的频率，同时在-376g / a，-308g / a -308g的TNF-α基因中没有显着差异/ a，和-238g / a。由于人口对照组比COPD人群更年轻，因此选择了40岁及更老的对照组的亚组，与COPD患者相比，分析显示TNF-α+ 489g /基因型频率显着差异。此外，TNF-α+ 489A等位基因的载体关系与增强的开发COPD（或= 1.9）有关。TNF-α+ 489g / COPD群体多态性越高的频率可能与具有TNF-α+489A GA基因型的个体百分比增加，而与健康对照相比，+ 489 AA的频率太低（1％的患者与控制中的2％相比）以允许有意义的比较。基于HRCT评分，一种通常被接受的技术在相对较早阶段准确地检测肺气肿，并允许客观测量的异常程度[37，39)，将患者分为有和没有放射性肺气肿的患者。由于HRCT不能检测到显微镜下的肺气肿，因此不能排除影像学上无肺气肿的患者可能存在显微镜下的肺气肿。这表明在本研究中，较严重的肺气肿(影像学诊断为肺气肿)患者与较轻或无肺气肿(影像学诊断为无肺气肿)患者进行了比较，这也得到了观察到的两亚组FEV1差异的支持。TNF-α +489G/A多态性的差异似乎与该多态性在非放射性肺气肿亚组患者中较高的患病率有关。有趣的是，32例患者中有4例(12.5%)从未吸烟。这四名患者中有三人表现出杂合子基因型(数据未显示)。这些数据强烈提示TNF-α +489G/A多态性是COPD的危险因素。需要进行进一步的研究来证实这一观察结果，并对大量吸烟和非吸烟相关性COPD患者进行分析。此外，使用年龄相近、有吸烟数据的对照人群将进一步加强这类研究的力度。

基因多态性TNF.-α +489G/A于1996年首次被描述，位于基因的第一个内含子[3.］．到目前为止，有限数量的研究已经检查了这种多态性和病理条件之间的可能关系。在患有前列腺癌的患者中发病率增加TNF.据报道-α+ 489A GA基因型，暗示改变TNF.-α +489G/A可能参与前列腺癌的发生[19］．此外,小TNF.+ 489A等位基因与甘蓝粒细胞常见可变免疫缺乏患者的亚组有关[20.］．与这些研究相反，与目前的研究结果相反，在慢性阻塞性肺病中，出现慢性阻塞性肺病的频率明显较低TNF.-α+489 GA和TNF.与对照组相比，RA患者报告了-α +489个AA基因型。携带次要+489A等位基因的RA患者也表现出较轻的病程[21］．此外，在特发性肺纤维化患者中没有与之相关的关联TNF.观察到-α+ 489g / a多态性[22］．因此，需要进一步的研究来阐明这一影响TNF.-α基因多态性与炎症性疾病的易感性和严重程度

最近，Kaijzel等人通过分析不同的贡献，研究了+489G/A多态性的功能后果TNF.TNF前mrna产生中的-α等位基因。健康个体和RA患者在体外和生理刺激条件下TNF-α pre-mRNA产量的不同等位基因之间未检测到差异[35］．因此，没有迹象表明这一特殊的功能意义TNF.-α基因变异已被证实。一般来说，一种特定疾病与等位基因之间的联系既可以解释为一种因果关系，也可以解释为等位基因与附近的一个基因或一组与该疾病的病理生理学有关的基因之间的连锁不平衡。未成年人是否TNF.-α+ 489A等位基因本身与较高的显影COPD易感性有关，或者等位基因也仍有待确定与附近的因果基因的连锁不平衡。这TNF.该基因位于MHC的III类区域，6p染色体上。在这个区域有几个编码免疫和炎症反应的蛋白质的基因，因此可能是潜在的研究对象。这些基因包括补体系统蛋白C2、C4和B因子，淋巴毒素(LT) α和β，以及70 kDa热休克蛋白(hsp70)家族成员[40］．除了研究单核苷酸多态性外，还应分析该区域基因的扩展单倍型，因为不太可能只有一个基因位点决定疾病的易感性和临床结果。唯一的TNF.在COPD中检查的-α基因多态性是TNF.-α基因多态性位点-308G/A。根据我们的数据，对白种人的研究表明COPD和TNF.-α -308G/A多态性[31- - - - - -33］．然而，Keatings等人指出，A等位基因的纯合性使COPD预后更差，这意味着由于GA和GG组的生存偏倚，COPD组A等位基因的增加可能被遗漏[33］．与这些针对白人的研究相反，有两项针对亚洲人的研究显示了一种关联TNF.-α -308G/A多态性在COPD患者与人群对照中的研究[29，30.］．造成这种差异的可能原因可能是影响患病率的种族差异。这TNF.-α-308a等位基因频率范围为10％[32至17% [31， 5% [29至8% [30.在亚洲人口中。或者，该等位基因可能与另一个基因存在连锁不平衡，增加了仅在亚洲人群中吸烟者对COPD的易感性。

我们研究中报告的等位基因频率TNF.-α-376a（两个研究组中的1％），TNF.-α -238A(对照组和COPD患者分别为3%和4%)TNF.-α +489A(对照组和COPD患者分别为12%和9%)与其他分析高加索人群的研究一致[3.，13，18，22］．然而，由于Gene inai -376和-238的罕见等位基因非常罕见，我们不能排除II型错误的可能性（研究人群太小而无法检测到差异）。

综上所述，从本研究中可以确定TNF.-α +489G/A基因多态性与COPD相关，特别是在非放射性肺气肿的亚组患者中。相比之下，基因型频率TNF.COPD人群-α -376G/A、-308G/A和-238G/A基因多态性与对照组无差异。它的影响TNF.-α +489G/A基因多态性与COPD易感性的关系以及对COPD炎症过程的影响有待探讨。

答:

腺嘌呤

BP：

碱基对

CI：

置信区间

慢性阻塞性肺病:

慢性阻塞性肺疾病

残:

一秒钟内的用力呼气量

G：

鸟嘌呤

HRCT：

高分辨率计算机层析成象

或者:

赔率比例

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

SD:

标准偏差

TNF：

肿瘤坏死因子

我们要感谢M. Nio对DNA样本的分离，以及Dr. A.M.W.J. schools对她的统计帮助。

这项研究得到了荷兰葛兰素史克公司的资助。

隶属关系

1. 荷兰马斯特里赫特大学马斯特里赫特研究所(NUTRIM)肺科、营养与毒理学研究所，荷兰马斯特里赫特

   MehmetKüçükaycan，Mieke A Dentener＆Emiel FM Wouters

2. 荷兰莱顿大学医学中心风湿病学系

   米歇尔·范·克鲁格曼和汤姆·韦吉·赫伊津格

3. Hornerheide，肺康复中心，喇叭，荷兰

   Herman-Jan彭宁斯j .

4. 荷兰马斯特里赫特大学马斯特里赫特外科、营养和毒理学研究所(NUTRIM)

   维姆·一个Buurman

通讯作者

对应到Emiel调频武泰．

再版和权限