粒细胞菌落刺激因子治疗中性急性呼吸窘迫综合征患者的单核细胞失活

介绍

在严重的中性化脓性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中，巨噬细胞和单核细胞是最后潜在的剩余天生的免疫细胞。然而，我们之前已经表明了中性化脓性ARDS患者的肺泡巨噬细胞的失活。在本研究中，我们试图表征体外单核细胞基线细胞因子产生和对脂多糖暴露的反应性。

方法

22名连续的癌症患者被纳入了一项在重症监护病房的前瞻性观察研究。所有患者均发生脓毒性ARDS，分为两组:中性粒细胞减少组(n= 12）和非中性患者（n= 10)。所有中性粒细胞减少的病人接受粒细胞集落刺激因子治疗，而非中性粒细胞减少的病人没有接受粒细胞集落刺激因子治疗。我们比较了脓毒性急性呼吸窘迫综合征中性粒细胞减少患者、非中性粒细胞减少患者和健康对照组的单核细胞(n= 10)。培养外周血单核细胞，并测定细胞因子水平（TNFα，IL-1β，IL-6，IL-1和IL-1受体拮抗剂），并在没有脂多糖刺激的情况下测定。

结果

中性粒细胞减少患者未刺激单核细胞TNFα、IL-6、IL-10和IL-1受体拮抗剂水平较非中性粒细胞减少患者低。在健康个体中获得的值低于预期，与中性粒细胞减少患者相当。在脂多糖刺激的单核细胞中，与非中性粒细胞减少患者和对照个体相比，中性粒细胞减少患者的炎症和抗炎细胞因子的产生均显著降低。

结论

与先前关于肺泡巨噬细胞失活的结果一致，我们观察到脓毒中性腺ARDS中单核细胞的全身丧失激活。这种失活参与总体免疫缺陷，可以与败血症，化疗和/或使用粒细胞菌落刺激因子相关联。

宿主免疫应答在脓毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发病机制中的作用尚不清楚。事实上，肺内吸收的激活炎症细胞是先天免疫防御呼吸道病原体的主要决定因素[1］．响应的损害有助于感染，因此病原体介导的损伤[1］．

在暴露于辐射或细胞毒性药物导致严重中性粒细胞减少的患者中，中性粒细胞聚集到肺中是一种明显受损的防御机制。在这些患者中，其他参与先天免疫反应的细胞群可能仍然可用。

一种替代人群可能是活化的肺泡巨噬细胞，其可以释放各种各样的介质[2- - - - - -5］．然而，我们最近证明了中性血管巨噬细胞在中性血症患者中的肺泡巨噬细胞[6］．另一种选择可能是单核细胞，其在感染性ARDS中的作用和激活状态尚不清楚，尽管一些研究已经发现单核细胞在人类败血症中失活的证据[7，8］．

因此，我们的假设是，单核细胞除了中性粒细胞减少外，在中性粒细胞减少患者接受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗后出现脓毒性ARDS的免疫抑制中也起主要作用。我们研究的目的是在这些患者中寻找单核细胞低反应性的证据。

为了表征单核细胞的低反应性，我们评估了单核细胞细胞因子的产生体外在基础条件下，在脂多糖(LPS)暴露后，使用培养的单核细胞从接受G-CSF治疗的中性粒细胞减少患者或非中性粒细胞减少患者的血液中分离出来，这两种患者均有脓毒性ARDS。我们还使用健康个体的单核细胞作为对照人群。

耐心

二十两次连续癌症患者均在研究中进行初步招生。所有患者均开发了记录的化粪池，分为两组：中性患者（绝对中性粒细胞计数<1,000 / mm^3.)和非中性粒细胞减少患者(绝对中性粒细胞计数> 1000 /mm^3.）。

我们采用了美欧共识会议推荐的ARDS定义[9］．脓毒症的定义依据美国胸科医师学会/重症监护医学共识会议的标准[10］．该研究在获得了我们的制度伦理委员会批准后进行的;知情同意是从每位患者的下一个亲属或直接从健康的志愿者获得。

为每位患者提供标准的支持治疗和广谱抗生素。所有中性粒细胞减少患者在重症监护室入院前均接受G-CSF治疗，而非中性粒细胞减少患者组没有患者接受G-CSF治疗。所有患者均于ARDS发病后3天采血。中性粒细胞减少患者和非中性粒细胞减少患者在单核细胞收集前的ARDS持续时间相似。

单核细胞的分离和培养

抽取10毫升血液，用等渗盐水稀释后离心。回收含有单核细胞的细胞球，采用塑料贴壁法分离单核细胞，加入RPMI 1640(10%胎牛血清、2 mM l -谷氨酸、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)于37℃孵育24小时。采用鲎试剂(Whittaker Bioproducts, fontenes -sous- bois，法国)排除内毒素污染。

细胞因子测定单核细胞活化和免疫测定

培养单核细胞(5 × 10)⁵在含有10％胎牛血清和存在的胎儿牛血清和抗生素的RPMI 1640中的细胞/测定）（大肠杆菌提取055:B5;Sigma, St Louis, MO, USA)，在37°C下放置16小时。收集细胞上清，在-70°C下保存。细胞因子测量采用定量三明治酶免疫分析法(R&D Systems, British Biotechnology, Abingdon, UK)。采用Immunotech (Marseille, France)提供的酶免疫法检测上清中TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10的含量。使用R&D Systems提供的试剂盒检测IL-1受体拮抗剂。免疫分析试剂盒的分析内和分析间变异系数在5%到10%之间。

统计分析

由Mann-Whitney U测试分析了两个独立组之间的比较。对于二分数据，计算百分比并使用Fisher的确切测试进行比较。为了评估在两种条件下在每种亚组（基线和LPS刺激）下是否在每种亚组中进行修饰的细胞因子产生，进行Wilcoxon配对数据统计测试。对于每个测试，P< 0.05被认为是显著的。

表中总结了嗜中性粒细胞减少患者和非嗜中性粒细胞减少患者的基线特征1．

表格2呈现基础条件下的单核细胞细胞因子产量和LPS曝光后，从中性患者的血液中分离的培养的单核细胞，或者来自无中性化脓性ARDS患者和健康对照个体。

在健康对照个体的单核细胞中，促炎和抗炎细胞因子水平在LPS作用下较基线水平显著增加，显示了正常单核细胞的反应性。非中性粒细胞减少脓毒性ARDS患者的单核细胞表现出类似的反应，尽管其基线水平明显高于对照组(IL-1除外)。在LPS达到水平的反应中，所有细胞因子显著增加，显著高于对照个体，表明这些单核细胞的反应性增加。然而，中性粒细胞减少脓毒性ARDS患者的单核细胞基线水平与对照组相似，表现为抑制状态。这些水平在LPS反应中没有增加，因此显著低于对照组和非中性粒细胞减少的脓毒性ARDS患者的LPS反应单核细胞，表明这些单核细胞的低反应性。

对现有临床资料的分析表明，中性粒细胞减少患者的死亡率明显高于非中性粒细胞减少患者，尽管PaO₂/ fio.₂比率和简化的急性生理学得分II在两组之间相当（表3.）。

我们的结果表明，从中性粒细胞减少的脓毒性ARDS患者血液中分离出来的培养单核细胞受到抑制，证据是细胞因子基线水平较低，在LPS刺激下呈低反应，证据是细胞因子没有增加。与非中性粒细胞减少的脓毒性ARDS患者和健康对照组的单核细胞进行比较。

这些结果与我们之前的研究相关联，该研究表明，中性粒细胞减少的脓毒性ARDS患者表现出与肺泡巨噬细胞失活相关的局部肺免疫抑制[6]但也表现出一种深深的低于无核性/巨噬克反应。实际上，我们以前在这些患者中表现出支气管肺泡灌洗具有低细胞性，具有肺泡巨噬细胞的优势。HLA-DR被下调，并且LPS诱导的巨噬细胞因子反应减少，这两个特征都在下划出严重的低对抗状态。这种局部巨噬细胞高次激力与促成局部宿主免疫抑制的严重肺泡中性粒细胞病症有关。在本研究中发现的全身单核细胞高病毒只能有助于这种宿主免疫抑制。

由于所有中性患者均表现出深层白细胞（白细胞计数<100 / mm^3.)，我们无法使用流式细胞仪评估单核细胞HLA-DR表达(数据未显示)。推测我们的结果与之前在脓毒症患者中描述的单核细胞抗原或白细胞全身性失活的证据一致[11[但是，很诱人。通过损失HLA-DR丧失证明的单核细胞失活在脓毒症患者的早期发生，持续失活与死亡率相关[7］．由于革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体，脓毒症在脓毒症中显示了细胞因子生产中的白细胞低反向性。8］．已经描述了更完整的单核细胞失活的表型和功能表征，称为免疫分析，其中仍然是HLA-DR和细胞因子低吸力仍然是主要成分[11］．

这种低反应状态的机制尚不清楚，可能是多因素的，与脓毒症有关[12]化疗[13]或嗜中性白血球减少症本身．首先，败血症的演变遵循双相免疫模式：早期的炎性阶段通过可能导致过炎，免疫抑制状态的抗炎反应进行抗衡化[12］．后一种条件与免疫缺陷和单核细胞失活相关。与败血症相关，化疗可以通过直接细胞毒性作用诱导细胞因子产生的下调[13］．有趣的是，无论使用何种药物，细胞因子的产生都可能发生减少，这表明一种非特异性机制[13］．

然而，我们不能考虑由于单核细胞对脓毒症患者的宿主免疫状态的单核细胞低于性导致细胞因子减少的这些影响，而无需讨论其潜在参与ARDS。实际上，通过先天免疫反应细胞的细胞因子产生是双刃剑：损伤导致免疫抑制和相关损伤，但增加或分解的促炎细胞因子反应是ARDS的主要组成部分[1]，一些研究表明，在ARDS或肺炎中，炎症反应增加可能导致更糟糕的结果[14，15］．此外，抗炎细胞因子参与损伤后肺修复调节[4］．

在本研究中，与非中性粒细胞减少患者相比，中性粒细胞减少患者的单核细胞失活与促炎和抗炎细胞因子有关。考虑到所测细胞因子的非详尽组，且不可能将所测细胞因子水平与净促炎或抗炎平衡相关联，因此不可能得出结论:所观察到的低反应性是否导致促炎或抗炎失衡。

尽管我们的研究并非旨在研究单核细胞失活与死亡率之间的关系，但我们观察到，中性粒细胞减少型ARDS患者(低反应单核细胞)的死亡率高于非中性粒细胞减少型ARDS患者(高反应单核细胞)。不能用ARDS严重程度或患者严重程度来解释，因为PaO没有差异₂/ fio.₂比率或简化急性生理学评分II。

而在非中性粒细胞减少的ARDS患者中，局部免疫抑制与预后良好相关[16]，全身免疫抑制(单核细胞失活，中性粒细胞减少)可能不适合中性粒细胞减少的脓毒性ARDS患者，并可能导致死亡率增加。

本研究中所有中性粒细胞减少患者均接受G-CSF支持治疗，G-CSF是一种诱导抗炎细胞因子分泌的分子[17[可能会增加单核细胞的失活 - 所以观察到的低调刺激的中性患者的产生可能与G-CSF的使用有关。根据触发，促炎和抗炎反应之间的这种平衡非常变化。在哈特乡及同事研究中，作者表明，G-CSF的主要作用是朝向抗炎细胞因子反应的转变;实际上，除了LPS之外，可以使用各种刺激获得TNF释放的减少[17］．G-CSF的结果也可能影响急性肺损伤的演变。在中性粒细胞减少导致急性肺损伤的大鼠模型中，Azoulay和同事显示了g - csf治疗动物肺泡细胞募集和肺水肿的增加[18］．作者在他们的研究中得出结论，中性粒细胞减少症的恢复会加重急性肺损伤，G-CSF会加重。此外，在一项临床研究中，Karlin和同事还表明，g - csf诱导的中性粒细胞减少症恢复与呼吸状态恶化的风险相关[19］．此外，G-CSF可促进中性粒细胞减少患者肺部感染所致ARDS的发生[20.］．从这些数据来看，G-CSF在这种情况下的使用仍有待仔细评估。然而，由于在我们的研究中所有患者都接受了G-CSF，因此没有因其使用而产生偏倚。

我们的研究有一些局限性。我们选择使用固体器官恶性肿瘤的控制群;在这几个中间有化疗，但相反，中性患者所有接受化疗。因此，可以认为化学治疗剂可能考虑细胞因子产生的一些差异。在本研究中，我们没有分析反映单核细胞功能的其他参数，例如吞噬吞噬，肽识别或迁移;因此，我们不能排除保留单核细胞功能的其他方面。最后，我们没有研究细胞表面表位，也可能参与中性患者中细胞因子的产生减少。

如果肺泡细胞反应和全身细胞反应之间存在平行关系，我们可以通过研究从血液样本分离的单核细胞中基线和脂多糖诱导的细胞因子随时间的产生来监测肺防御机制。此外，测量炎症介质的循环浓度可能有助于评估并可能定位给药免疫调节剂的最佳时间[21］．

目前的发现有助于在脓毒症的管理中使用抗炎治疗的辩论。更好地理解什么是抗炎细胞因子与促炎细胞因子的充分平衡，可能是改善中性粒细胞减少脓毒症患者的关键。

• 中性粒细胞减少患者接受G-CSF治疗并表现为脓毒性ARDS单核细胞失活。

• 这种低反应状态可能与脓毒症、化疗或中性粒细胞减少有关。

• 在这种情况下使用G-CSF仍有待仔细评估。

ARDS:

急性呼吸窘迫综合征

G-CSF：

粒细胞菌落刺激因子

HLA-DR：

II类主要组织相容性复合体

IL：

白细胞介素

有限合伙人:

脂多糖

PAO：

PaO₂/ fio.₂= PaO₂/吸入氧气的分数

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子。

从属关系

1. 保利-卡尔梅特学院麻醉科和重症监护室，232 bd圣玛格丽特，马赛Cedex 9, 13273，法国

   Djamel Mokart, Pierre Guerre-Berthelot, Antoine Sannini, Jean-Paul Brun和Jean-Louis Blache

2. EA2689, SGRIVI, hospital Calmette, CHRU de Lille, 59037, Lille Cedex

   Eric Kipnis和Benoit P Guery

3. 免疫学和血液学实验室Hôpital de la Conception，马赛，法国

   Christian Capo和Jean-Louis Mege

4. 法国马赛巴利 - 平静学院血液学系

   诺伯特·维和迪迪埃·布莱斯

相应的作者

对应于Djamel Mokart．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

DM，AS，CC，BPG和EK收集并分析了数据。DM，J-PB，J-LB，DB，J-LM和PGB审查并协调了该研究。

再版和权限