冈比亚结核病病例治疗后ELISPOT试验的恢复

背景

新工具需要改善结核病（TB）诊断和治疗，包括增强比较新的治疗策略的能力。ELISPOT测定用途结核分枝杆菌-特异性抗原产生对病原体的免疫应答的精确定量读数。我们假设冈比亚的结核病患者在成功治疗后会降低ELISPOT计数。

方法

我们用痰涂片和培养阳性结核病招募了冈比亚成年人，为ELISPOT测定和艾滋病毒检测，并在一年后进行了一年以后重复测试和文件治疗结果。我们使用ESAT-6，CFP-10和纯化的蛋白质衍生物（PPD）作为刺激抗原。我们在23个志愿者通过2个测试中的23个志愿者确认了我们的测定的可靠性，在主题变化内和之间的课程变异之间和之间进行比较。

结果

我们在89名患者中进行了ELISPOT测试和12个月后12个月。在招聘中，70/85个HIV阴性患者（82％）是ESAT-6或CFP-10（EC）ELISPOT阳性，77（90％）是PPD ELISPOT阳性。成功完成治疗八十二个病例（96％）：44（55％; P <0.001）在12个月内为EC ELISPOT负数，17例（21％; p = 0.051）是ppd ELISPot阴性。六十（73％）固化病例有CFP-10 ELISPOT计数下降，64（78％）具有ESAT-6 ELISPOT计数降低，58（70％）PPD ELISPOT计数降低。平均下降25,44和47 SFU / 2×10^5.CFP-10、ESAT-6和PPD的差异无统计学意义(p < 0.001)。4例HIV阳性患者中3例治愈，3例均行ELISPOT逆转;4例未治愈患者(3例HIV阴性，1例HIV阳性)12个月时ESAT-6、CFP-10和PPD ELISPOT均为阳性。

结论

成功的结核病治疗伴随着显着的减少玉米菌菌- 特异性抗原ELISPOT计数。ELISPOT具有作为TB治疗结果的代理衡量标准。有必要进一步调查T细胞腐烂动力学的治疗。

结核病（TB）每年估计估计200万人死亡[1[发展中国家的压倒性多数势头[2]， 和结核分枝杆菌感染了世界上的大约三分之一的人口[3.］．在世界许多地区，结核病发病率已经稳定或正在下降，而在非洲，发病率每年大约上升6% [4.］．需要新的TB，新增和增强的治疗策略，以及对比较它们的效力标记，以帮助打击流行病。这些需要显示在TB-特有的热带环境中有用。

基于T细胞的免疫测定有希望诊断TB疾病和玉米菌菌感染。这离体ELISPOT能精确计数干扰素γ (IFN-γ)产生的致敏t细胞玉米菌菌抗原和我们已经表明定量ELISPOT计数反映了传染性的负荷玉米菌菌在冈比亚[5.］．注意到这一特性，我们假设在结核病病例中，ELISPOT计数会随着抗结核治疗的一个疗程而减少。因此，作为确定ELISPOT是否可能在冈比亚以这种方式成为有效标志物的第一步，我们评估了ELISPOT在治疗前后对结核病病例的反应。

参与者

在冈比亚的一个大写联系研究中嵌套[6.]，我们招募了痰涂片和培养阳性成人结核病病例。我们在诊断时从每种情况下服用10毫升血液样本，并在12个月后遵循重复样品。国家TB控制计划通过直接观察治疗，所有患者的治疗，短期课程（DOTS）给出每种案例。本研究的道德批准是从联合MRC - 冈比亚政府道德委员会获得的。获取知情同意于所有研究参与者。

我们通过随访访谈跟踪患者的临床结果，并通过临床记录(结核病治疗卡和临床治疗登记)证实结果。在随访中发现的患者成功地完成了治疗，并且在12个月的血液测试时情况良好(治疗完成后没有咳嗽/出汗/体重下降或其他结核病症状)，被归类为“治愈”。其他则根据世界卫生组织的标准定义进一步分类[7.]:如果治疗连续中断两个月，他们被定义为“默认”;如果在4个月或之后的治疗过程中痰涂片仍然呈阳性，他们被定义为“失败的治疗”。

实验室程序

制备痰涂片，用金胺酚染色[8.[Ziehl-Neelsen染色结果证实了结果。将净化的标本接种到低苯坦-Jensen培养基和Bactec 9000液体培养基中，用于分离和鉴定M.结核病，如前所述[9.］．艾滋病毒检测由酶联免疫吸附试验（ELISA;惠氏体;惠灵格实验室，达特福德，肯特，英国）和特定于特定的Western Blot（新的Lav污染物I和新的Lav Blot II，诊断Pasteur，Marnes-La-Coquette，法国）。使用Double Data Rest进入Access数据库并验证所有数据。

例如，如前所述的重复进行前体内ELISPOTS [10.］．将横跨ESAT-6和CFP-10 (ABC, Imperial College, London, UK)长度的重叠肽分别分成肽池，以5 μg/ml的浓度使用。纯化蛋白衍生物(PPD;MTB.， RT49，他汀血清研究所，哥本哈根，丹麦)，剂量为10 μg/ml。阳性对照为植物血凝素(PHA;英国Sigma-Aldrich)。检测采用自动ELISPOT阅读器(AID-GmbH, Strassberg, Germany)进行评分。阳性测试井被预先定义为至少包含10个以上的点形成单元(sfu)，至少是阴性对照井的两倍。PHA井被设置为至少比阴性对照井高150个sfu，阴性对照井要求小于30个sfu才能被纳入分析。抗原SFUs报告数高于阴性对照SFUs。

ELISPOT测定的可靠性

我们以两种方式评估了ELISPOT测定的可靠性。首先，为了评估对象内的可变性，我们测试每个受试者的副本测试每个抗原，并通过拟合对象的随机效果模型进行对象可变性之间的内部和之间。在我们的大案件联系人研究中，我们使用ELISPOT结果来自连续招聘的TB案例联系人：1223 eSat-6肽的重复结果和CFP-10肽的1182个重复结果。对于CFP-10，受试者标准偏差是29.4个点，并且在主题标准偏差中为3.6点。对于ESAT-6，受试者之间的标准偏差为38.9个斑点，并且对象内标准偏差为4.2个斑点。因此，与受试者之间的可变性相比，对象内变异非常小。其次，为了评估日常变异性，我们从一般社区招募了23名成人志愿者，并进行了一个ELISPOT测试，然后在1周后重复测试。最初，十二名志愿者的负面测试：其中一周后，这些都没有阳性测试。最初，十一志愿者有一个正面的考验：一周后，这些只有其中一个都有负面测试。对于那些在两次阳性的人点点，SFU在两个时间点之间的差异分别为：-15，-7，-4，-1,3,5,6,6,12和35 sfu。

数据管理与分析

通过Double Data Rest进入Access数据库并检查所有数据并检查错误。使用SPSS软件进行统计分析。通过学生的T-Test（配对）的比例和定量结果进行比较来比较定性结果。必要时（对于ESAT-6和CFP-10）日志（基部10）进行变换。

我们鉴定了151例痰涂片和培养阳性的受试者，他们在诊断时的血液测试中有令人满意的ELISPOT测试结果。在12个月时，发现了97例(64%)病例，同意抽血并采集血样。从中，89名受试者获得了满意的ELISPOT结果(92%的技术成功率);7例elisa检测失败，阳性对照数较弱，1例阴性对照数过高。表格1显示了纳入研究的89例患者的基本特征。62例(70%)为男性，平均年龄32岁(范围18 - 80岁)。4例(4%)HIV阳性。

数字1显示了在85个HIV阴性案件中招生和12个月的定性ELISPOT结果。在招聘中，70例（82％）是ESAT-6或CFP-10（EC）ELISPOT阳性，77个（90％）是PPD ELISPOT阳性。八十二名受试者（96％）成功完成了6个月的TB药物治疗方案，被认为是治愈的。其中，44（54％）在12个月内为EC ELISPOT阴性，17例（21％）是PPD ELISPot阴性。对于ESAT-6和CFP-10，招生和12个月之间的差异非常显着（P <0.001，比例测试）。PPD ELISPOT积极性的差异是临界意义（P = 0.051）。三种治愈病例是EC ELISPOT在招募的阴性，但在12个月内为阳性，而7个治愈病例是PPD ELISPOT在招生中为负，但在12个月内为阳性。在招聘和12个月内患上欧共盟ELISPOT试验的34个治愈案件之间没有显着差异，在12个月和12个月内恢复为负电信，或者在两次分数中的负数（数据未显示）。

数字2显示了82例治愈病例的ELISPOT计数在招募和12个月之间的数量变化。60例(73%)患者在12个月时CFP-10 ELISPOT计数下降，64例(78%)患者ESAT-6计数下降。58例(70%)治愈后PPD ELISPOT计数下降。在这三种试验中，在12个月时，25、44和47 SFU/2 × 10的计数平均下降^5.用于CFP-10，ESAT-6和PPD的细胞，所有非常显着（P <0.001）。六（7％）治愈案件的ESAT-6或CFP-10 ELISPOT数量至少为10 SFU（图2A和2B.），包括对抗原的数量增加的人;18例（21％）病例增加了至少10个SFU的PPD ELISPOT数量增加（图2C）其中包含6个中的4个，EC计数增加。

三种HIV阴性病例被定义为“未治愈”。两种被定义为“免于药物治疗”;随后的两种症状都存在于12个月验血后表达TB复发的症状。一种情况被定义为“治疗失败”：尽管良好的合规性，他在TB治疗的六个月结束时被痰涂淋巴。这些受试者中的所有三个受试者是ESAT-6，CFP-10和PPD ELISPOT在12个月内阳性。

四种HIV阳性病例中的三种完成了TB治疗课程，并在12个月的测试时健康。所有3的EC ELISPOT测试从正到负面恢复。一种艾滋病毒阳性受试者违反TB治疗：他的所有三种ELISPOT测试（CFP-10，ESAT-6和PPD）在12个月内为阳性。

据我们所知，这是迄今为止迄今为止抗TB治疗后ELISPOT逆转的最大研究。成功完成标准结核病课程的大量比例的患者从初步诊断后12个月内从阳性到阴性EC ELISPOT发生变化。平均ESAT-6，CFP-10和PPD ELISPOT计数也显着减少。对于PPD的21％，7％的病例患者的ELISPOT计数增加了它们的eLISPOT计数。

这里报告的数据无法通过ELISPOT读数的固有变异来解释，并且与其他设置中的其他研究虽然与其他环境的研究一致。前两位结核病患者在英国（英国; N = 4）和意大利（n = 18）报告了药物治疗后定量ESAT-6 ELISPOT计数的下降[11.那12.然而，在英国的一项研究中，10名已完成结核病治疗的患者的ESAT-6 ELISPOT计数略高于8名不同结核病治疗早期患者的ESAT-6计数[13.］．

这离体ELISPOT响应被认为是最近的激活淋巴细胞，即立即效应记忆，一旦抗原清除，只有在循环中仅存在有限的时间[14.］．因此，抗结核病治疗后抗原戒断将伴随着T细胞频率的下降。有几种可能的解释为什么甚至'特定的'抗原（ESAT-6和CFP-10）计数在冈比亚的正义和相对保守的截止的情况下没有普遍地下降到冈比亚的阳性（10 SFU）。首先，一些患者可能已被重新暴露于玉米菌菌治疗完成后和重新进入潜伏后玉米菌菌感染。其次，它们可能已经暴露于环境分枝杆菌，通常遇到的热带地区，其共享ESAT-6和CFP-10基因（例如。M. Marinum.）。第三，最有趣的是，有证据表明，在一些人在没有直接分枝杆菌抗原刺激的情况下，在没有直接分枝杆菌抗原刺激的情况下持续存在于活化的T细胞的持续存在，即使在完成治疗后几年15.］．

确定，即使在这种TB-特有的热带环境中，ELISPOT计数在治疗后的结核病病例中也会显着降低，我们将在治疗过程中探讨特定抗原T细胞应答的衰变动力学。有人建议，抗原特异性T细胞的衰减率约为每周总数的5.5％，[11.这将导致在40周内大约90%的计数下降。在南非的一项小型研究中，Nicol等人显示，在6个月的治疗过程中，10名结核病儿童的ELISPOT计数最初上升，然后下降[16.］．在冈比亚的Vekemans等人表明，与具有证据的健康对照相比，Tb患者对纯化分枝杆菌抗原的T细胞反应相对较低。玉米菌菌感染 [17.］．对这些发现的一个明显的解释是，诊断时患者由于身体不适而抑制了T细胞反应。玉米菌菌本身可以干扰IFN-γ信令[18.]，提供另一种可能的解释。其他因素也可能是重要的，例如随着抗生素治疗发作的病原体杀伤而增加的早期抗原呈现。因此，细胞动力学的隐含轨迹是T细胞应答，即早期治疗增加，然后拒绝玉米菌菌抗原负荷减小。可能的采样框架是在1个月，2个月内进行重复ELISPOT测试（以与涂片阳性案例的痰转化相比），4个月和6个月。我们还旨在遵循那些随着时间的推移作为队列的持续积极持续的人。

虽然有兴趣的是，我们研究中的所有四个治疗失败（3艾滋病毒阴性，1个艾滋病毒阳性）在12个月内患有阳性EC和PPD ELISPOT测试，但需要更多的类似案例来确定真正的敏感性ELISPOT持续治疗失败。少数治疗案例对ESAT-6和/或CFP-10的ELISPOT计数有所增加，表明这种治疗失败的阳性预测值在冈比亚不是100％。但是，“治愈患者”在以后的日期可能会复发。

现在，来自各种环境的令人信服的证据表明，在通过结核病治疗治愈的结核病患者中，ELISPOT计数显著下降。这可能对临床实践具有重要意义:有效监测对治疗的反应，调整抗结核药物治疗的时间，比较新疗法(包括治疗性疫苗)的疗效，以及合理化治疗潜伏感染的基础都是可能的应用。需要进一步研究确定ELISPOT逆转和持续与结核治疗相关的敏感性和预测价值，以找到进行重复试验的最佳时间。并确定持续ELISPOT反应的临床和免疫学危险因素，以及这些个体是否存在疾病复发的风险。12个月时的重复ELISPOT试验反映了抗结核治疗一个疗程的有效性，即使在结核病流行的热带环境中也是如此。

我们感谢国家结核病控制计划，为他们正在进行的合作和领域和实验室助理为他们的辛勤工作。

隶属关系

1. 冈比亚班珠尔医学研究理事会实验室结核病司

   亚历山大·艾肯，菲利普C山，安妮特·福克斯，基思PWJ Mcadam，多莉杰克逊 - Sillah，摩西D Lugos，Simon A Donkor，Richard A Adegbola＆Roger H Brookes

通讯作者

对应于菲利普C山。

利益争夺

RHB具有与之相关的专利离体ELISPOT通过牛津大学获得许可。没有其他已知的利益冲突。

作者的贡献

AA监督随访，起草手稿并进行分析。PH参与了研究的设计，监督了田野工作，并与AA共同起草了手稿。AF参与了研究的设计，并共同监督了实验室的工作。知识管理部门参与了研究的设计，并参与了实地和实验室方面的协调工作。DS监督了现场工作，并进行了研究的临床方面。ML进行免疫检测。SD管理数据的输入、验证和质量。RA监督了研究的微生物方面。RB参与了研究的设计并监督了实验室方面的工作。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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