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。 2012年10月15日,26 (20):2325 - 36。
doi: 10.1101 / gad.198069.112。 Epub 2012年9月26日。

通过H2AΔNp63α压制anti-proliferative基因。Z沉积

山腰的L Gallant-Behm1, 马修·R拉姆齐, 克莱尔·L Bensard, Ignacio Nojek, 杰克Tran, 明华刘, 列夫W Ellisen, 华金M埃斯皮诺萨
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通过H2AΔNp63α压制anti-proliferative基因。Z沉积

山腰的L Gallant-Behmet al。 基因开发。 。
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文摘

ΔNp63αp53家族的成员函数作为癌基因的转录因子鳞状细胞癌(癌)。因为ΔNp63α和p53绑定几乎相同的DNA序列图案,它提出了ΔNp63α功能的显性负抑制剂p53促进增殖和细胞凋亡。然而,大多数癌并发ΔNp63α过表达和灭活p53,暗示这些致癌事件的自主行动。这里我们报告一个新颖的机制的发现的转录镇压ΔNp63α和解这些观察。我们发现,虽然两个蛋白质绑定相同的基因组网站,他们很大程度上调节不重叠的基因集。在激活p53结合所有增强剂无论ΔNp63α状态但未能transactivate基因ΔNp63α紧。我们发现ΔNp63αassociates SRCAP染色质监管复杂参与H2A / H2A。Z交换和H2A提供中介。Z沉积at its target loci. Interestingly, knockdown of SRCAP subunits or H2A.Z leads to specific induction of ΔNp63α-repressed genes. We identified SAMD9L as a key anti-proliferative gene repressed by ΔNp63α and H2A.Z whose depletion suffices to reverse the arrest phenotype caused by ΔNp63α knockdown. Collectively, these results illuminate a molecular pathway contributing to the autonomous oncogenic effects of ΔNp63α.

数据

图1所示。
图1所示。
独立于p53ΔNp63α驱动器SCC细胞增殖。(一个)免疫印迹H226细胞提取物后48 hΔNp63α击倒和/或12 h的p53激活10μM Nutlin-3 (前板)或稳定p53击倒后(底面板)。Nucleolin作为加载控制。(B)细胞增殖试验由直接的细胞计数。细胞携带稳定综合成分对ΔNp63α和p53是使用强力霉素播种前5 d诱导ΔNp63α击倒。细胞(1×106在第0天)被播种,强力霉素被撤在第十天中,让ΔNp63α的表达。(C)流式细胞术分析BrdU合并后的5 dΔNp63α击倒。(D)芯片结果的热图和维恩图48 h后ΔNp63α击倒或12 h (p53激活10μM Nutlin-3。显著诱导ΔNp63α击倒或激活p53被定义为> 1.5倍和改变P< 0.05相对于控制样本。基因p53激活后表达增加我将以后称为“类。“基因是上调后ΔNp63α击倒“第三类。“基因表达增加以下两个治疗”二类。”(E)验证芯片结果中存在分析选定类的我,第二,第三和目标基因后12 h(10μM Nutlin-3治疗,48 hΔNp63α击倒,或联合治疗。
图2。
图2。
ΔNp63α并不妨碍p53对其基因组的网站的访问。芯片分析进行全细胞提取物控制细胞(黑条)后12 h(10μM Nutlin-3治疗(红酒吧),48 hΔNp63α击倒(蓝色酒吧),或结合Nutlin-3治疗和ΔNp63α击倒(紫色酒吧)。p53特定抗体(得了)和ΔNp63α(D-F)使用。ChIP-enriched DNA被量化实时PCR的p53、p63响应元素表示基因。参见图5基因补充地图和扩增子的位置。Meta-enhancer值计算的平均每个治疗组相对于Nutlin-3-treated PCR信号(p53 IP)或基底(ΔNp63αIP)测试响应所有元素的值在一个基因类。
图3。
图3。
子单元的SRCAP复杂关联ΔNp63α和目标基因的抑制。(一个)Silver-stained凝胶后利用c端国旗/ HA-taggedΔNp63α或控制GFP蛋白JHU029鳞状细胞癌的细胞。小说ΔNp63α-interacting蛋白质被质谱分析以粗体表示。(B)利用/免疫印迹确认特定的绑定ΔNp63αACTL6A, DMAP1 RUVBL1, RUVBL2。(C)CofractionationΔNp63αACTL6A、DMAP1 RUVBL1, RUVBL2, SRCAP 10% - -40%甘油密度梯度。部分数字和分子量标准表示。(D)中存在基因表达分析在H226细胞中稳定表达shrna SRCAP子单元SRCAP, ACTR6, ACTL6A, RUVBL1, RUVBL2, DMAP1, VPS72, YEATS4 non-SRCAP子单元KAT5, EP400, INO80。
图4。
图4。
ΔNp63α损耗导致RNAPII SRCAP子单元和H2A同时激活。Z ZHX2轨迹。芯片的化验ZHX2轨迹进行使用细胞提取物H226细胞。(一个)从细胞中提取前(黑线),48 h后(蓝线)ΔNp63α击倒。(B)提取物控制细胞(黑线)和DMAP1本构击倒(绿线)。抗体的特定p63 Ser5-phosphorylated (S5P) RNAPII DMAP1, RUVBL2, H2A。Z。ChIP-enriched DNA被实时PCR量化。每个PCR扩增子的位置显示在线性范围内的轨迹模型。p53、p63响应的位置元素是由一个红色的星号表示。灰色的乐队代表了转录区域的轨迹。
图5。
图5。
H2A。Z压制ΔNp63α目标基因。细胞增殖是由直接细胞计数(化验一个)和BrdU公司(B有和没有H2A) H226细胞。Z击倒。看到H2A补充图13。Z击倒的效率。(C)细胞凋亡被膜联蛋白V化验染色流式细胞术分析。5 -氟尿嘧啶是用作积极控制。(D)存在分析选定类的我,II类和III类基因5 d H2A之后。Z在H226细胞击倒。(E)中存在的分析选择我类和III类基因5 d H2A之后。Z在HaCaT击倒,SCC-13 Cal-27细胞。
图6。
图6。
SAMD9L救助枯竭造成的扩散逮捕ΔNp63α击倒。(一个)细胞增殖是由sulforhodamine监控B (SRB)化验后5 d H226ΔNp63α击倒的稳定细胞系表达shrna表示ΔNp63α目标基因。结果给出了吸光度的比值(A510)后/前强力霉素治疗诱导p63击倒。(B)时间细胞增殖过程中由直接的细胞计数。细胞(1×1060)被播种的一天。细胞与强力霉素5 d播种前预处理诱导ΔNp63α击倒。同基因的细胞系H226稳定SAMD9L击倒或IGFBP3击倒而独自ΔNp63α击倒(控制)。请补充图14为每个SAMD9L和IGFBP3第二个成分。(C)ΔNp63α新兵SRCAP子单元的复杂和H2A提供中介。Z公司在anti-proliferative压制RNAPII自治的p53基因机制。
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