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呼吸系统的研究
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Tiotropium变弱IL-13-induced杯状细胞化生人类呼吸道上皮细胞
免费的
  1. 卫矛E M Kistemaker1,2,
  2. Pieter年代Hiemstra3,
  3. 我索菲T Bos1,2,
  4. Susanne Bouwman1,2,
  5. Maarten van den贝2,4,
  6. 经济分析家N Hylkema2,5,
  7. 赫尔曼·穆尔1,2,
  8. Huib A M Kerstjens2,4,
  9. Reinoud Gosens1,2
  1. 1部分子药理学,格罗宁根大学,格罗宁根、荷兰
  2. 2GRIAC研究所,格罗宁根大学医学中心,格罗宁根大学,格罗宁根、荷兰
  3. 3肺学部门,莱顿大学医学中心,莱顿、荷兰
  4. 4肺系疾病,格罗宁根大学,格罗宁根大学医学中心,格罗宁根、荷兰
  5. 5的病理生物学和医学,格罗宁根大学医学中心,格罗宁根、荷兰
  1. 对应到卫矛E M Kistemaker、分子药理学、格罗宁根大学Deusinglaan 1,格罗宁根9713 AV,荷兰;l.e.m.kistemaker在{}rug.nl

文摘

背景它已经表明,乙酰胆碱是一种神经递质和作为当地的中介,由气道细胞包括上皮细胞。体内研究表明乙酰胆碱在上皮细胞分化的间接作用。在这里,我们旨在调查直接内生non-neuronal乙酰胆碱对上皮细胞分化的影响。

方法人类健康的捐赠者的气道上皮细胞培养在气液界面(ALI)。细胞暴露在毒蕈碱的拮抗剂tiotropium(10海里)、白介素(IL) -13(1、2和5 ng / mL),或结合IL-13 tiotropium,期间或之后在阿里分化。

结果人工气道上皮细胞表达的所有组件non-neuronal胆碱能系统,表明乙酰胆碱生产。Tiotropium没有空气接触后对上皮细胞分化的影响。分化成杯状细胞几乎没有空气接触后引起。因此,IL-13 (1 ng / mL)被用来诱导杯状细胞化生。IL-13诱导MUC5AC-positive细胞(5倍)和杯状细胞(14),评估通过组织化学和MUC5AC基因表达(105倍)。这些影响一定程度上阻止了tiotropium (47 - 92%)。杯状细胞化生被IL-13诱导剂量依赖性的方式,由tiotropium抑制。此外,tiotropium逆转2周的诱导下,杯状细胞化生IL-13曝光。IL-13减少forkhead盒蛋白A2 (FoxA2)表达式(1.6倍)和增加FoxA3(3.6倍)和SAM-pointed domain-containing ETS转录因子(SPDEF)(5.2倍)表达式。Tiotropium防止影响FoxA2 FoxA3,但不是SPDEF。

结论我们证明tiotropium没有影响上皮细胞分化后空气接触,但抑制和逆转IL-13-induced杯状细胞化生,可能通过FoxA2和FoxA3。这表明non-neuronal乙酰胆碱有助于杯状细胞通过直接影响上皮细胞分化。

  • 哮喘药理学
  • 气道上皮细胞

http://dx.doi.org/10.1136/thoraxjnl - 2014 - 205731

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    关键信息

    关键问题是什么?

    • 乙酰胆碱有直接影响上皮细胞分化,特别是IL-13-induced杯状细胞化生吗?

    底线是什么?

    • Tiotropium变弱IL-13-induced杯状细胞化生人类呼吸道上皮细胞,建议直接在上皮细胞分化为内源性乙酰胆碱作用。

    为什么要读吗?

    • 尽管预计tiotropium变弱粘液分泌过多的病人,几乎没有证据表明上皮细胞分化的直接乙酰胆碱的作用,在这里我们提供这样的证据作用,探讨可能的机制。

    背景

    乙酰胆碱长期以来一直被称为经典神经递质在航空公司,从副交感神经纤维释放。它引起支气管收缩和粘液分泌通过毒蕈碱的受体。出于这个原因,抗胆碱能治疗已被用于许多世纪治疗阻塞性气道疾病,长效抗胆碱能代理,tiotropium,已被证明有效的治疗慢性哮喘。1,2

    此外,有证据表明,乙酰胆碱还可以合成和释放non-neuronal起源,作为自分泌和/或旁分泌中介气道细胞。3特别是,气道上皮细胞已被证明表达相对较高的乙酰胆碱水平。4,5上皮细胞表达酶合成乙酰胆碱,包括胆碱乙酰转移酶(聊天),同时也被证明通过有机阳离子转运蛋白non-neuronal释放乙酰胆碱。4,6

    上皮细胞在哮喘起着重要的作用。上皮分化是改变的疾病,有杯状细胞数量的增加,导致过多的粘液生产,因此气道梗阻。7IL-13的主要驱动力是响应和已被证明在哮喘中发挥核心作用。8从动物模型众所周知,白介素(IL) -13足以诱发杯状细胞增生,9可以复制在气液界面(ALI)在体外细胞培养。10,11IL-13-induced MUC5AC基因表达是通过一个复杂的转录网络,介导的抑制因子的表达,forkhead盒蛋白A2 (FoxA2),减少STAT6激活,而表达SAM-pointed domain-containing ETS转录因子(SPDEF)和FoxA3增加,促进MUC5AC基因表达。12,13

    有趣的是,一些研究已经间接地证明了乙酰胆碱的作用在上皮细胞分化和杯状细胞化生。Tiotropium,抗胆碱能药物,已表现出抑制ovalbumin-induced杯状细胞化生在几内亚猪和老鼠,14,15敲除后也观察到M产生影响3受体在小鼠体内。16此外,增加MUC5AC表达观察tiotropium过敏原接触抑制后的豚鼠和M3基因敲除小鼠。14,16此外,轻度哮喘患者,反复挑战醋甲胆碱诱导上皮细胞增生,杯状细胞化生。17虽然这些研究都指向一个关键角色乙酰胆碱在杯状细胞化生,仍未得到解决,如果这是通过直接调节气道上皮杯状细胞分化的细胞或通过促炎细胞和细胞因子的间接调节驱动这种反应,因为tiotropium也抑制了炎症反应在上面描述的动物研究。

    因此,在这项研究中,我们调查了内生non-neuronal乙酰胆碱的作用主要人工气道上皮的分化(已经)细胞,分化阿里细胞培养。我们表明,抑制内源性乙酰胆碱tiotropium对上皮细胞分化没有影响空气接触后,但抑制和逆转IL-13-induced杯状细胞化生和MUC5AC表达,这可能是通过FoxA2和FoxA3介导的。

    方法

    文化有细胞

    不朽的人类支气管上皮细胞系,16 hbe14o−,由D C Gruenert博士请捐赠,佛蒙特大学,伯灵顿佛蒙特州,美国。18细胞培养如前所述19并简要描述在线补充数据。

    主要有细胞从肺移植获得捐助者事后剖析,从残留的气管和主支气管组织,在肺移植后1 - 8 h。选择标准移植捐赠者Eurotransplant指南中列出,包括没有原发性肺部疾病,如哮喘和慢性阻塞性肺病,不超过20年的吸烟史。材料收集在carbogenated Krebs-Henseleit缓冲区(117.5毫米组成:氯化钠、氯化钾5.6 1.18 MgSO42.5 CaCl21.28不2阿宝425 NaHCO3和5.5葡萄糖)。上皮细胞被酶消化、分离和培养如前所述,11也简要解释在线补充数据和总结图1。阿里细胞分化为两个星期。在最初的实验中,细胞暴露于tiotropium(勃林格殷格翰集团提供的)剂量10 nM实现> 99%的受体入住率20.分化时期。在随后的实验中,细胞暴露于tiotropium和/或IL-13 (1 - 5 ng / mL;Peprotech,落基山,新泽西,美国)。在最后的实验中,细胞暴露于IL-13和/或tiotropium 2周,然后暴露于IL-13和tiotropium 1周(图1)。

    Schematic representation of the air–liquid interface (ALI) culture model. Human airway epithelial (HAE) cells were seeded on to a transwell insert and grown to confluence. Thereafter, apical medium was removed to create an ALI. Medium and stimuli were refreshed three times per week. Cells were harvested after 14 or 21 days for PCR analysis or morphology, and medium was collected for ELISA. IL, interleukin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    气液界面(ALI)文化的示意图表示模型。人工气道上皮细胞(已经)被播种在transwell插入和发展到融合。此后,顶端中被创建一个阿里。媒介和刺激刷新每周3次。细胞收获14或21天后PCR分析或形态,并为ELISA中收集。IL,白介素。

    RNA分析

    总RNA提取新鲜孤立的气道上皮细胞,从培养16 hbe14o−细胞,细胞,在水下或阿里文化(细胞),使用RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,荷兰)根据制造商的指示。等量的总RNA被reverse-transcribed,互补dna受到实时定量PCR (q) (Westburg Leusden,荷兰)或微阵列分析。细节实时qPCR和引物可以用于在线补充数据(文字和表E1)。数据是正常18 s核糖体RNA。微阵列分析ALI-cultured细胞从四个不同的捐赠者,暴露在汽车或tiotropium,分析一式两份。假设一个SD 0.5,我们有80%的力量来检测两方面的差异在一个名义上的p值为0.05。微阵列分析使用llumina HT12 V.4芯片。数据分析使用R软件和受到基因集富集分析使用基因和基因组的京都百科全书(KEGG) Biocarta和Reactome定义。

    组织化学

    文化的形态是评估使用光学显微镜。2周后,transwell插入被嵌入在石蜡根据制造商的指示。横截面5µm厚被用于的形态学分析。细胞被沾)(Sigma-Aldrich Zwijndrecht,荷兰),MUC5AC-positive细胞被染色和MUC5AC抗体染色(美国加州弗里蒙特,Neomarkers)和mucin-producing杯状细胞都沾过碘酸希夫试剂(不是;Sigma-Aldrich Zwijndrecht、荷兰)。细胞数盲评一式两份。FoxA2是沾染了一只兔子anti-FoxA2抗体(Abcam,剑桥,英国)使用辣根peroxidase-linked山羊anti-rabbit二级抗体(Dako、斯特鲁普、丹麦)和diaminobenzidine (Sigma-Aldrich)。

    细胞因子分析

    基础培养基中细胞因子浓度测定一个Milliplex试验(美国马萨诸塞州微孔,Billerica)使用Starstation Luminex 100系统软件(应用血细胞计数系统、谢菲尔德、英国)根据制造商的指示。执行屏幕26细胞因子(见在线补充数据的完整列表)。

    统计分析

    数据意味着±SEM。统计差异意味着计算使用单向或双向方差分析在适当的地方,其次是Newman-Keuls多重比较测试。差异被认为是显著p < 0.05。

    结果

    上皮细胞的分化

    首先,上皮细胞的分化状态的特征。因此,分化的基因表达标记、MUC5AC(标记为杯状细胞)和tektin 1(纤毛细胞的标志),比较在不同的细胞。我们比较水下文化的细胞系16 hbe14o−,水下文化有细胞,新鲜孤立的细胞,和ALI-cultured有细胞。MUC5AC基因表达和tektin 1在新鲜分离和ALI-cultured文化高于在水下文化(图2)。而tektin 1水平可比在新鲜分离细胞和阿里文化、MUC5AC在新鲜分离细胞水平大大高于在阿里的文化。在一起这表明阿里文化的分化后空气暴露诱发主要纤毛细胞分化与有限的杯状细胞分化(图2)。

    Differentiation state of epithelial cells. Expression of the differentiation markers, MUC5AC (a marker for goblet cells (A)) and tektin 1 (a marker for ciliated cells (B)), was analysed by real-time quantitative PCR in submerged 16HBE14o− cells and submerged human airway epithelial (HAE) cell cultures, in freshly isolated HAE cells and in ALI-cultured HAE cells. Data represent mean±SEM, n=3–5. **p<0.01, ***p<0.001 compared with submerged culture; ##p<0.01, ###p<0.001 compared with HBE culture; $$$p<0.001 compared with freshly isolated cells.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    上皮细胞的分化状态。MUC5AC表达分化标记(标记为杯状细胞(a))和tektin 1(标记为纤毛细胞(B)),分析了实时定量PCR在水下16 hbe14o−细胞和淹没人类呼吸道上皮细胞培养(有),在新鲜分离细胞和在ALI-cultured细胞。数据代表的意思是±SEM, n = 3 - 5。* * * * * p < 0.01, p < 0.001相比,水下文化;# # p < 0.01, # # # p < 0.001相比HBE文化;$ $ $ p < 0.001相比,新孤立的细胞。

    的表达non-neuronal胆碱能系统

    接下来,基因的表达参与non-neuronal胆碱能系统在有细胞特征并与16 hbe14o−细胞。在视图的基本原理研究中,我们专注于乙酰胆碱代谢基因和毒蕈碱的受体。上皮细胞表达的所有组件non-neuronal所需生产和释放乙酰胆碱,胆碱能系统中描述表1绝对的表达水平(Ct值)和在线补充表相对表达的E2与水下有文化。胆碱转运蛋白对胆碱的吸收,包括高亲和性胆碱转运体1 (CHT1),胆碱transporter-like蛋白1 (CTL1), CTL4。出乎意料,acetylcholine-synthesising酶,聊天,没有检测到任何的上皮细胞培养,而合成的酶,肉碱乙酰转移酶(克拉),大量表达。此外,乙酰胆碱酯酶(疼痛)和butyrylcholinesterase (BChE),两种酶降解乙酰胆碱,是表达。最后,毒蕈碱的米1,米2和M3受体表达在细胞乙酰胆碱作为目标(表1)。而16 hbe14o−细胞,大多数组件都表示相同或更高水平的主要细胞。最突出的高表达主要有细胞观察M3胆碱受体和转运蛋白CHT1和CTL4 (表1)。

    把这个表:
    表1

    组件的non-neuronal胆碱能系统在上皮细胞表达

    tiotropium对上皮细胞分化的影响

    因为有细胞表达的所有组件non-neuronal胆碱能系统,表明内生non-neuronal乙酰胆碱的生产,我们检查的影响毒蕈碱的拮抗剂,tiotropium,上皮细胞分化培养阿里。Tiotropium在集中管理两分化期间(10 nM)绑定> 99%的毒蕈碱的受体。20.中所描绘的一样图3,tiotropium没有影响分化的基因表达标记MUC5AC tektin 1后空气接触。此外,接触tiotropium后没有观察组织学变化,评估的)(图3B)和私人助理(图3C)染色。微阵列分析证实了这些数据,表明任何基因调节和表达下调超过两个与tiotropium治疗后,基于文化来自四个不同的捐助者(图3D)。基因集富集分析使用KEGG Reactome和Biocarta定义并没有发现显著改变的途径。此外,任何基因调节和表达下调1.5倍以上。在另一种分析关注基因调节或下调了1.1倍以上,11个基因的基础上选择他们的上皮细胞分化的相关性:增殖蛋白激酶(MEK) 1, MEK2, MEK4和快速加速纤维肉瘤(RAF) 1地图的激酶途径;层粘连蛋白(LAM) B3和LAMC2参与细胞结组织;FoxA2 FoxA3,参与杯状细胞化生;和钾离子通道KK17 KK15 KJ6。然而,这些基因的差别upregulation或对这些可以通过实时复制qPCR使用样本用于微阵列分析(图3D,个人数据未显示)。集体,tiotropium空气接触后不影响上皮细胞分化。

    Tiotropium does not affect epithelial cell differentiation after air exposure. Human airway epithelial cells were cultured at an air–liquid interface (ALI) and differentiated with or without tiotropium (10 nM) for 2 weeks as described in figure 1. (A) Expression of the differentiation markers MUC5AC and tektin 1 was analysed by real-time (RT) quantitative (q)PCR. Data represent mean±SEM. (B) Representative images of H&E staining. (C) Representative images of periodic acid Schiff staining. (D) Flow diagram of steps taken after micro-array analysis (four different donors). CTR, control; GSEA, gene set enrichment analysis.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Tiotropium空气接触后不影响上皮细胞分化。人工气道上皮细胞在气液界面培养(ALI)和分化有或没有tiotropium为2周(10 nM)中所描述的图1。(一)分化标记MUC5AC的表达和tektin 1分析了实时(RT)定量PCR (q)。数据表示的意思是±SEM。(B))染色的形象代表。(C)代表高碘酸希夫染色的图像。(D)流程图的步骤在微阵列分析(四个不同的捐助者)。CTR,控制;GSEA基因集富集分析。

    tiotropium对IL-13-induced杯状细胞化生

    由于没有空气接触后tiotropium对上皮细胞分化的影响,鉴于有限的杯状细胞分化通过使用这种方法,IL-13 1 ng / mL的浓度是诱导杯状细胞化生用于后续实验。11刺激与IL-13并不影响受体的表达和酶的non-neuronal胆碱能系统(见在线补充表E3)和诱导只有谦虚,与炎症细胞因子表达增加(见在线补充表E4)。然而,刺激与IL-13并诱导杯状细胞化生所评估的组织化学和实时qPCR (图4)。IL-13诱导增加5.3倍MUC5AC-positive细胞,由tiotropium阻止(57%;图4A、B)。此外,IL-13-induced杯状细胞数量的增加,评估PAS染色,完全阻止tiotropium (图4C, D)。此外,MUC5AC基因表达是由105倍与IL-13刺激后,由tiotropium一定程度上阻止了,虽然这是不显著(47%;图4E)。有趣的是,tektin 1的表达与IL-13刺激后下降了75%(图4F)。Tiotropium并不影响IL-13-induced减少tektin 1(图4F)。

    Tiotropium attenuates interleukin (IL)-13-induced goblet cell metaplasia. Human airway epithelial cells were cultured at an air–liquid interface (ALI) and differentiated with or without IL-13 (1 ng/mL) and/or tiotropium (10 nM) for 2 weeks as described in figure 1. MUC5AC-positive cells were determined by MUC5AC antibody staining; quantification (A) and representative images (B) are shown. Goblet cells were determined by periodic acid Schiff staining; quantification (C) and representative images (D) are shown. Expression of the differentiation markers MUC5AC (E) and tektin 1 (F) was analysed by real-time quantitative PCR. CTR, control. Data represent mean±SEM, n=4–8 donors. **p<0.01, ***p<0.001 compared with CTR; #p<0.05, ##p<0.01 compared with IL-13.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Tiotropium变弱白介素(IL) 13-induced杯状细胞化生。人工气道上皮细胞在气液界面培养(ALI)和分化有或没有IL-13 (1 ng / mL)和/或tiotropium为2周(10 nM)中所描述的图1。MUC5AC-positive细胞由MUC5AC抗体染色;量化(A)和(B)代表图像显示。杯状细胞是由高碘酸希夫染色;量化(C)和代表图像(D)所示。MUC5AC的表达分化标记(E)和tektin 1 (F)被实时定量PCR分析。CTR,控制。数据代表的意思是±SEM, n = 4 - 8。* * * * * p < 0.01, p < 0.001相对于CTR;# p < 0.05, # #与IL-13相比p < 0.01。

    在随后的实验中,我们调查了影响tiotropium细胞暴露于浓度增加IL-13 (1 - 5 ng / mL)。IL-13诱导杯状细胞化生在剂量依赖性的方式评估免疫组织化学(图5A、B)。有趣的是,tiotropium抑制MUC5AC-positive细胞的增加(p = 0.012,双向方差分析,图5)和杯状细胞(p = 0.015,双向方差分析,图5B)。

    Tiotropium attenuates interleukin (IL)-13-induced goblet cell metaplasia in a dose-dependent manner. Human airway epithelial cells were cultured at an air–liquid interface (ALI) and differentiated with or without IL-13 (1, 2 or 5 ng/mL) and/or tiotropium (10 nM) for 2 weeks as described in figure 1. MUC5AC-positive cells were determined by MUC5AC antibody staining (A), and goblet cells were determined by periodic acid Schiff staining (B). CTR, control. Data represent mean±SEM, n=4 donors. $p<0.05 for treatment effect; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with CTR.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    Tiotropium变弱白介素(IL) 13-induced杯状细胞化生剂量依赖性的方式。人工气道上皮细胞在气液界面培养(ALI)和分化有或没有IL-13(1、2或5 ng / mL)和/或tiotropium为2周(10 nM)中所描述的图1。MUC5AC-positive细胞由MUC5AC抗体染色(A),和杯状细胞是由高碘酸希夫染色(B), CTR控制。数据代表的意思是±SEM, n = 4。$ p < 0.05治疗效果;* p < 0.05* * *,* * p < 0.01, p < 0.001与CTR相比。

    tiotropium对建立IL-13-induced杯状细胞化生

    进一步评估的功能相关性tiotropium抑制作用,我们也分析tiotropium是否能够逆转了杯状细胞化生。接触IL-13 (1 ng / mL) 3周诱导增加28-fold MUC5AC-positive细胞和杯状细胞(增加三倍图6A、B)。只有tiotropium治疗3周没有影响MUC5AC或杯状细胞数量,正如前面观察2周后的风险。符合我们之前发现,治疗期间与tiotropium接触IL-13 3周阻止IL-13-induced杯状细胞化生。有趣的是,tiotropium也能够逆转了杯状细胞化生,因为它抑制MUC5AC-positive细胞的增加(90%,图6一)和杯状细胞的增加(50%,图6B)当tiotropium应用于上周只有结合与IL-13 3周持续刺激。

    Tiotropium reverses established goblet cell metaplasia induced by interleukin (IL)-13. Human airway epithelial cells were cultured at an air–liquid interface (ALI) and differentiated with or without IL-13 (1 ng/mL) and/or tiotropium (10 nM) for 2 weeks. Thereafter, cells were cultured for an additional week with IL-13 and/or tiotropium as described in figure 1. MUC5AC-positive cells were determined by MUC5AC antibody staining (A), and goblet cells were determined by periodic acid Schiff staining (B). CTR, control; wk, week. Data represent mean±SEM, n=4 donors. *p<0.05 compared with CTR; #p<0.05 compared with IL-13.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Tiotropium逆转了杯状细胞化生引起白介素(IL) -13。人工气道上皮细胞在气液界面培养(ALI)和分化有或没有IL-13 (1 ng / mL)和/或tiotropium为2周(10海里)。此后,细胞培养另一个星期IL-13和/或tiotropium中描述图1。MUC5AC-positive细胞由MUC5AC抗体染色(A),和杯状细胞是由高碘酸希夫染色(B), CTR控制;周,一周。数据代表的意思是±SEM, n = 4。* p < 0.05相对于CTR;#与IL-13相比p < 0.05。

    转录机制

    在随后的实验中,我们调查的关键转录因子参与IL-13-induced杯状细胞化生细胞和tiotropium的效果。中所描绘的一样图7,增加MUC5AC表达伴随着FoxA2表达降低(1.6倍),增加表达FoxA3(3.6倍)和SPDEF(5.2倍)。核本地化FoxA2的证明了免疫组织化学(数据没有显示)。Tiotropium没有影响基底的这些基因的表达,但完全逆转的抑制作用IL-13 FoxA2 (图7A)。此外,tiotropium部分阻止IL-13-induced FoxA3表达式(图7B)。IL-13-induced SPDEF表达式不受tiotropium (图7C)。

    Effect of tiotropium on transcriptional mechanisms involved in goblet cell metaplasia. Human airway epithelial cells were cultured at an air–liquid interface (ALI) and differentiated with or without interleukin (IL)-13 (1 ng/mL) and/or tiotropium (10 nM) for 2 weeks as described in figure 1. Expression of the transcription factors forkhead box protein A2 (FoxA2; A), forkhead box protein A3 (FoxA3; B) and SAM-pointed domain-containing ETS transcription factor (SPDEF; C) was analysed by real-time quantitative PCR. CTR, control. Data represent mean±SEM, n=8 donors. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with CTR; #p<0.05 compared with IL-13.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    tiotropium对转录的影响机制杯状细胞化生。人工气道上皮细胞在气液界面培养(ALI)和分化有或没有白介素(IL) -13 (1 ng / mL)和/或tiotropium为2周(10 nM)中所描述的图1。转录因子的表达forkhead盒蛋白A2 (FoxA2;),forkhead盒蛋白质A3 (FoxA3;B)和SAM-pointed domain-containing ETS转录因子(SPDEF;C)被实时定量PCR分析。CTR,控制。数据代表的意思是±SEM, n = 8。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001相对于CTR;#与IL-13相比p < 0.05。

    讨论

    在这项研究中我们证明non-neuronal乙酰胆碱有助于杯状细胞分化。有细胞表达了乙酰胆碱合成所需的所有组件,,虽然毒蕈碱的拮抗剂tiotropium并不影响上皮细胞分化后空气接触,tiotropium并抑制IL-13-induced杯状细胞化生。此外,tiotropium能够逆转成立IL-13-induced杯状细胞化生。此外,我们提供的证据的参与转录监管机构、FoxA2 FoxA3,这种效应。本研究首次探讨在初选ALI-cultured tiotropium上皮细胞的作用,结果暗示tiotropium可能影响粘液分泌过多。

    数据从这项研究清楚地表明,乙酰胆碱合成所需的所有组件存在于细胞培养有来自中央航空公司。的上皮细胞表达的事实组件non-neuronal胆碱能系统是与先前的研究一致。5,6然而,与先前的研究相比,不同的神经元胆碱能系统,聊天是最著名的乙酰胆碱合成的酶,4,6我们无法检测的重要表达上皮细胞培养的聊天。相反,我们展示丰富的表达acetylcholine-synthesising酶,克拉。克拉是40年前首次发现作为替代方法合成乙酰胆碱在兔心脏被白人和吴21并一直在检测到多个non-neuronal胆碱能系统从那时起,包括大鼠骨骼肌,22猫食管粘膜,23小鼠膀胱和刮擦的膀胱上皮和人类膀胱粘膜活检。24

    乙酰胆碱是一种神经递质和当地的信号分子由non-neuronal细胞产生极大地扩大了对乙酰胆碱的作用。已经建议non-neuronal胆碱能系统可能在肺生理或病理生理学中发挥作用,但是对于这样一个直接证据的作用仍然有限。在这项研究中,有细胞培养在一个阿里作为一个模型系统。通过这种方式,可以调查non-neuronal乙酰胆碱的作用,因为没有神经系统。此外,通过使用主细胞培养的阿里,人类生理反映更紧密地比使用16 hbe14o等细胞系−。而不是只有一个基底细胞类型,一个阿里文化pseudostratified黏膜纤毛的细胞培养与不同的上皮细胞,也观察到体内。我们的数据表明,纤毛细胞标记表达式ALI-cultured有细胞相媲美,在新孤立的气道上皮细胞,而MUC5AC表达,杯状细胞的标记,阿里后适度表达文化,但可以明显增加了IL-13曝光。特定的相关性对我们的研究的发现组件non-neuronal胆碱能系统在主ALI-cultured上级表达细胞比16 hbe14o -细胞。

    Tiotropium治疗抑制IL-13-induced杯状细胞分化,但并不影响上皮细胞分化后空气接触。基于n = 4复制、SD / 0.5和预期的褶皱变化的基因,可以计算0.8的幂假设1的假阳性率20(5%)基因微阵列研究。没有发现基因显著增长——或者衰减在这项研究中,即使基因集被考虑(KEGG Reactome和Biocarta基因集)。尽管这项研究不是动力,降低褶皱变化到1.1时,发现了一些基因的变化,p < 0.05。然而,这些在后续qPCR研究中被证实。因此,我们相信tiotropium并不影响上皮细胞分化,文化不受到额外刺激,但影响IL-13-induced杯状细胞分化。

    IL-13中央中介在哮喘病理导致杯状细胞化生和粘液分泌过多。8粘液分泌和MUC5AC表达增强的贡献哮喘和哮喘的气流限制阻碍较小的航空公司。25,26刺激与IL-13 MUC5AC表达增加剂量依赖性的方式在我们的研究中,这是与先前的研究使用阿里的文化。10,11此外,tektin 1的表达,纤毛细胞的标记,被IL-13同时减少。事实上杯状细胞化生是诱导,MUC5AC抗体染色和PAS染色显示mucin-producing增加细胞相比,控制部分。此外,表达的转录因子SPDEF FoxA3增强,而FoxA2表达降低。这是符合先前的研究旨在瓦解转录网络参与杯状细胞化生。12,13有趣的是,tiotropium完全阻止FoxA2表达降低,一定程度上阻止FoxA3的增加,而增加SPDEF并不影响的表达式。这也许可以解释部分的效果观察后,杯状细胞化生tiotropium曝光。

    航空公司包括上皮杯状细胞分泌粘液细胞和粘膜下腺体。它已经令人信服地表明,后者是胆碱能神经的控制之下。25迷走神经刺激的雪貂气管体外或体内增强粘液分泌,抑制的M34-DAMP拮抗剂,27和电场刺激加强人类支气管粘液释放。28这个神经acetylcholine-induced粘液释放可能是来自气道黏膜下腺体。然而,有越来越多的证据表明,乙酰胆碱也能导致粘液分泌的杯状细胞。25,29日,30.杯状细胞能否粘液分泌神经元释放乙酰胆碱仍然是一个有争议的问题,但我们的数据表明non-neuronal乙酰胆碱的作用对该细胞类型分化。在黏膜下腺体为主健康人类的航空公司,杯状细胞在哮喘患者疾病条件下接受化生和支配,25指示的潜在相关性抑制分化过程。

    因此,发现tiotropium部分防止IL-13-induced杯状细胞化生在我们的模型中暗示这可能是有利于患者哮喘。这是符合体外和体内研究的证据表明一个角色粘液分泌过多的毒蕈碱的拮抗剂。毒蕈碱的拮抗剂,氧托,剂量依赖性抑制histamine-induced从呼吸道粘液分泌的杯状细胞。31日此外,Cortijo等32证明毒蕈碱的受体刺激通过碳酰胆碱诱导增加MUC5AC表达在人类支气管上皮细胞培养,毒蕈碱的抑制的拮抗剂,aclidinium。我们的数据表明,tiotropium也能够反向建立杯状细胞增生,这是兴趣和重要性。这表明,杯状细胞的营业额是足够快速允许逆转1星期内表型,并认为胆碱能压力结合IL-13需要诱导和维持一个差异化的杯状细胞表型。我们必须考虑到所有的这些研究,包括研究提出本文使用健康细胞对毒蕈碱的受体刺激的影响,杯状细胞化生。然而,有趣的是,类似的研究结果中观察到轻微的哮喘患者,在他一再挑战醋甲胆碱诱导上皮细胞增生,杯状细胞化生。17有趣的是,这些影响是可以预防预防支气管收缩时,表明防止支气管狭窄tiotropium可能间接的抑制作用在粘液分泌过多。17动物研究也提供了间接的证据作用毒蕈碱的受体allergen-induced杯状细胞化生。在一个ovalbumin-induced豚鼠模型,tiotropium抑制MUC5AC表达和粘液腺肥大。14此外,杯状细胞化生抑制了tiotropium ovalbumin-induced小鼠模型。15有趣的是,淘汰赛的毒蕈碱的M3受体还能抑制ovalbumin-induced杯状细胞化生和MUC5AC表达。16值得注意的是,IL-13表达增强在同一动物,表明这种影响不是通过减少炎性反应介导的。16

    我们的发现扩展这些以前的观测,我们现在证明tiotropium的影响不仅是减少支气管狭窄或减少炎症细胞因子表达的结果,但这tiotropium也对上皮细胞有直接影响。我们进行了多重细胞因子分析验证的参与炎症反应的缺失。只有谦虚,不增加观察炎性细胞因子与IL-13刺激后,,此外,tiotropium对炎性细胞因子无显著影响。因此,我们可以从我们的研究得出气道上皮细胞表达non-neuronal乙酰胆碱,和抑制该组件的抗胆碱能药物足以抑制IL-13-induced杯状细胞分化。这直接影响tiotropium在气道上皮细胞中观察到我们的研究可能协同作用的间接影响tiotropium上皮细胞体内,包括减少机械应变和减少炎症。然而,未来需要临床研究来证实这一假说。

    Tiotropium目前注册为慢性治疗严重哮喘患者。最近的证据表明,治疗tiotropium诱发bronchodilation中度和重度哮喘患者。1,33严重哮喘患者,使用标准的tiotropium疗法与长效β-agonists和吸入糖皮质激素诱发FEV的增加1的数量和减少严重的加重和恶化的哮喘。2从我们的研究结果暗示粘液分泌过多也可能受到tiotropium治疗。此前,tiotropium已被证明是有效地降低患者的痰液水平慢性呼吸道粘液分泌过多。34虽然提出了抗胆碱能治疗可能会损害痰间隙,现在有越来越多的证据表明,减少痰液的体积不改变粘弹性和抗胆碱能药物有利于患者慢性粘液分泌过多。35未来的研究需要更详细地直接解决这一假设。

    结论

    我们证明tiotropium可以预防,也反向,IL-13-induced杯状细胞化生,表明non-neuronal乙酰胆碱有助于杯状细胞分化。FoxA2的调制和FoxA3表达可能的机制之一。这些数据暗示,这直接影响tiotropium气道上皮细胞,结合对支气管狭窄和炎症,其保护作用可能防止粘液分泌过多。

    确认

    作者感谢wallfisch M Verhoosel和Willemieke M Mudde技术援助和Tinne C J莫顿对专家意见的分析IL-13-induced粘蛋白的生产。本研究在经济上支持荷兰肺脏基金会(格兰特3.2.08.014)。先前的研究在实验室的P S Hiemstra ALI模型支持格兰特Boerhringer殷格翰集团。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 贡献者LEMK构思研究,参与其设计,进行了研究和起草了手稿。机顶盒和某人进行研究的一部分。PSH参与研究设计和设置阿里文化。MB微阵列分析进行。MNH HAMK和HM参与了研究设计。RG构思研究,参与其设计和协调,帮助起草手稿。所有作者修订后的手稿至关重要的知识内容和批准了最终版本的手稿。

    • 资金本研究在经济上支持荷兰肺脏基金会(格兰特3.2.08.014)。

    • 相互竞争的利益PSH、HAMK,嗯,RG接到勃林格殷格翰集团研究资助。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。