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摘要
背景监测哮喘患者痰中嗜酸性粒细胞，可预测哮喘的恶化并改善哮喘的管理。到目前为止，血液中嗜酸性粒细胞和FE没有在预测嗜酸性粒细胞性气道炎症方面显示出矛盾的结果。最近，血清骨膜蛋白被认为是一种新的嗜酸性粒细胞性炎症的生物标志物。
目标血液嗜酸性粒细胞、FE相互关系的定量研究没有通过外部验证，在两组不同哮喘严重程度的独立队列中发现血清骨膜蛋白与痰嗜酸性粒细胞。
方法第一个队列包括110例轻至中度哮喘患者(外部验证队列)。复制队列包括37例中度至重度哮喘患者。对两组进行横断面评估。诱导痰液检测嗜酸性粒细胞。同时，血液嗜酸性粒细胞计数，血清骨膜蛋白浓度和FE没有被评估。通过受试者工作特征曲线下面积(ROC AUC)计算这些标记物识别嗜酸性粒细胞哮喘(痰嗜酸性粒细胞≥3%)的诊断准确性。
结果在外部验证队列中，血液嗜酸性粒细胞的ROC AUC为89% (p<0.001)， FE为89%没有痰中嗜酸性粒细胞水平78% (p<0.001)≥3%。血清骨膜素不能区分嗜酸性粒细胞性和非嗜酸性粒细胞性气道炎症(ROC AUC=55%， p=0.44)。当把这三个变量结合起来时，没有看到任何改善。复制队列中证实了血液嗜酸性粒细胞的诊断价值(ROC AUC 85%， p<0.001)。
结论在轻度至中度哮喘患者以及较严重哮喘患者中，血液嗜酸性粒细胞在哮喘痰嗜酸性粒细胞鉴别中具有最高的准确性。血液嗜酸性粒细胞的使用可以促进哮喘的个体化治疗和管理。
试验注册NTR1846和NTR2364。
- 哮喘
- 嗜酸性粒细胞生物学
统计数据来自Altmetric.com
关键信息
关键问题是什么?
血液嗜酸性粒细胞和FE的相互关系是什么没有在轻至中度哮喘患者队列中，血清骨膜蛋白与痰嗜酸性粒细胞结合，这些发现能否在更严重哮喘人群中得到复制?
底线是什么?
以往关于血液嗜酸性粒细胞诊断准确性的研究没有血清骨膜素用于评估嗜酸性粒细胞性气道炎症的结果相互矛盾，这三种生物标志物尚未得到外部验证。
为什么要继续读下去?
这项研究表明，在两个独立的哮喘患者队列中，血液嗜酸性粒细胞是嗜酸性气道炎症的准确生物标志物，这对指导当前和新的个性化治疗具有很大的实际优势。
介绍
哮喘是一种异质性的疾病，包括几种在严重程度、自然史和治疗反应上不同的临床表型。1近期前瞻性临床研究的证据表明，患者的炎症(亚)表型有助于优化治疗和疾病预后。2这表明，在临床实践中，在识别患者和监测哮喘时，应考虑炎症的生物标志物，如类固醇治疗的滴定。
痰嗜酸性粒细胞增多已被证实是预测哮喘预后的一个关键标志。3.嗜酸性粒细胞性哮喘对类固醇抗炎治疗反应良好，而非嗜酸性粒细胞性哮喘则很少或没有反应。4此外，停用皮质类固醇的研究一致表明，痰中嗜酸性粒细胞计数升高预示着病情加重。5，6随机试验强有力的证据表明，监测痰嗜酸性粒细胞可改善预后，显示痰嗜酸性粒细胞计数正常化可使哮喘发作减少60%。2，7，8
高渗盐水诱导痰通常被认为是一种可靠的非侵入性方法来评估和监测嗜酸性粒细胞增多症。9然而，痰液分析的使用受到实验室设施的要求和分析时间的限制。此外，在严重且无法控制的哮喘患者中，诱导痰液可能存在问题，因为高渗盐诱导的气道狭窄和/或约四分之一的患者无法产生足够的痰液样本。10
因此，需要有足够的哮喘嗜酸性粒细胞炎症的替代标记物。FE的测量没有被认为是嗜酸性粒细胞性气道炎症的替代标记物。然而，FE没有痰中嗜酸性粒细胞的数量似乎并不多，11特别是在类固醇依赖性哮喘患者中。12这与Cochrane的一项meta分析一致，该分析显示FE监测类固醇治疗的益处不足没有，2尽管这一点受到了最近初级保健领域积极成果的挑战。13另外，哮喘患者血液嗜酸性粒细胞计数与痰嗜酸性粒细胞呈中等至良好相关性，14与疾病严重程度和哮喘表型相关。15，16因此，血液嗜酸性粒细胞可能预测和指导抗炎治疗，这在哮喘和COPD中有初步证据。17日然而，最近的一项研究表明FE的相关性很差没有血液中的嗜酸性粒细胞和痰中的嗜酸性粒细胞，无论是单独的还是联合的，21由此引发争议。最后，血清骨膜蛋白被认为是哮喘嗜酸粒细胞性气道炎症的系统性生物标志物，显示出与痰嗜酸粒细胞的显著相关性，并预测哮喘中的类固醇反应性。22，23
根据诊断准确性研究报告标准的国际指南，在评估疾病标记物的诊断或表型准确性时，必须进行外部验证。24但对于伴有FE三联征的痰嗜酸性粒细胞还没有这样做没有，血液嗜酸性粒细胞和血清骨膜蛋白。因此，我们的目标是量化FE的相互关系没有在轻度至中度哮喘患者的外部验证队列中，血液嗜酸性粒细胞和血清骨膜蛋白与痰嗜酸性粒细胞结合，并在更严重哮喘人群中重复研究结果。
方法
主题
对于外部验证队列，我们在阿姆斯特丹学术医学中心(AMC)的门诊和两家非学术肺部二线转诊门诊招募了200名轻度至中度哮喘患者。对于复制队列，我们在AMC的门诊招募了40名中度至重度哮喘患者。对于两组患者，哮喘的诊断均由医生对FEV可逆性哮喘的诊断来确定1≥预测值的12%和/或气道高反应性(PC20.乙酰胆碱<8 mg/mL)。
在外部验证队列中，吸烟者或有吸烟史>10包年的前吸烟者如果没有表现出FEV的改善就被排除在外1吸入400 μ g沙丁胺醇后，在包入时具有正常的扩散能力，至少12%。在复制队列中，排除了所有吸烟史为>10包年的吸烟者或戒烟者。在研究访问期间，至少4周内没有患者出现任何呼吸道感染症状。
两项研究均获得医院医学伦理委员会批准，所有患者均给予书面知情同意。外部验证队列在荷兰试验注册(http://www.trialregister.nl)和NTR2364下的复制队列。
设计
这些研究有相似的横断面设计，并包括一次医院访问的所有测量。在访问期间，检查纳入和排除标准，检查肺功能和痰诱导高渗盐水。外部验证队列的炎症状态也通过评估血液嗜酸性粒细胞和FE来衡量没有血清骨膜素。在复制队列中，测量了血液嗜酸性粒细胞和血清骨膜蛋白，以便在更严重哮喘人群中复制结果。
测量
肺功能和过敏测试
根据欧洲呼吸学会(ERS)的建议进行肺功能检查。188bet官网地址25通过对常见空气过敏原的总免疫球蛋白E (IgE)和特异性免疫球蛋白E (IgE)来评估特异反应状态。如果至少有一种血清特异性IgE >0.34 kU/L，则认为患者是特应性的。
炎症标志物
根据ERS的建议，每隔5分钟吸入三次高渗盐水诱导痰液。26诱导痰前，患者吸入沙丁胺醇400µg。对于外部验证队列，评估整个痰液样本的体积，加入等量的二硫曲醇(10 mM DTT, 135 mN Tris缓冲液，pH 8.0)。对于复制队列，选择的桥塞用0.1%的DTT处理。痰液和细胞计数的处理由有经验的实验室分析人员完成，对其他结果不知情。差异细胞计数以非鳞状细胞的百分比表示，基于500个非鳞状细胞。有明显鳞状细胞污染的(>80%)排除在分析之外。根据之前的研究，我们使用3%的痰嗜酸性粒细胞计数作为确定嗜酸性或非嗜酸性气道炎症的阈值。7
外周血嗜酸性粒细胞计数来自同一中心的标准全血计数和FE没有使用恒定流量为50 mL/s的在线设备进行测量(Niox Mino;Aerocrine AB，索尔纳，瑞典)。27将室温下凝固30分钟的血液离心获得血清，之后用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清骨膜蛋白水平，使用DuoSet Human periostin /OSF-2 (R&D系统)(参见在线知识库中的方法部分)。本内源性骨膜蛋白ELISA法经10×、20×、40×和80×稀释法测定血清中骨膜蛋白，验证了该方法的有效性。±15.5%变异)和穗恢复(77.75%±11.69%;(平均数±标准差))。组内和组间变异系数分别为12.3%(9.08%±3.91%;(平均值±SD))和17.4%(12.69%±4.08%)。进行Western blot以确定抗体能识别哪些骨膜蛋白异构体(参见在线知识库中的方法和结果部分)。此外，所有的盲血清样本都采用第二种独立的骨膜蛋白测定方法(Elecsys periostin，用于COBAS e601)进行分析，该方法由德国Penzberg的罗氏专业诊断公司开发，使用之前描述的相同抗体。22
统计分析
采用SPSS (V.18.0)软件进行数据分析。连续变量的结果用均数±标准差表示;偏态分布以IQRs的中位数表示。非正态分布变量被转换为对数或平方根值。用Pearson相关系数分析痰中嗜酸性粒细胞与替代标记物的关系。
对于外部验证队列，分别或联合对每个变量进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，以确定最能识别痰中嗜酸性粒细胞计数≥3%的标记物。为了分析不同ROC曲线的曲线下面积(AUC)是否有显著差异，使用R (V.2.15)和pROC包对AUC进行比较。28考虑各变量的最佳切点，计算敏感度、特异度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。此外，计算了以前发表的备选切点的敏感性和特异性:血液嗜酸性粒细胞≥0.25×109/L≥0.22×109/ L;菲没有水平>50，<24和>20 ppb;血清骨膜蛋白水平以生物标志物的中位数为临界值。16，22，29-31
外部验证队列中痰嗜酸性粒细胞最佳预测标志物的诊断准确性随后在复制队列中使用ROC曲线分析进行验证。
结果
在外部验证队列(招募:2009年6月- 2011年6月)中，200例患者中有110例，在复制队列(招募:2010年10月- 2011年6月)中，40例患者中有37例能够产生足够的痰样本。两个队列的患者特征描述在表1，按痰嗜酸性粒细胞计数≤3%或≥3%分层的特征见在线资源库在线补充表E1。
血液嗜酸性粒细胞外效，FE没有血清骨膜素
血液中嗜酸性粒细胞和FE没有与痰中嗜酸性粒细胞百分比相关(r=0.59, p<0.001, r=0.52, p<0.001)。采用体内骨膜蛋白ELISA检测，血清骨膜蛋白与痰嗜酸性粒细胞百分比无显著相关性(r=0.09, p=0.4)。使用Elecsys骨膜蛋白检测，血清骨膜蛋白和痰嗜酸性粒细胞百分比之间存在微弱但显著的相关性(r=0.32, p=0.001)。
血液嗜酸性粒细胞的诊断准确率(ROC AUC)为89% (p<0.001, 95% CI 0.81 ~ 0.96) (图1)．使用≥0.27×109以/L血嗜酸性粒细胞为切点，嗜酸性粒细胞和非嗜酸性粒细胞炎症有很好的区分，敏感性为78%，特异性为91% (表2)．
血液嗜酸性粒细胞(eos)、FE敏感性和特异性的受试者工作特征曲线分析没有血清骨膜素(内部)诊断嗜酸性粒细胞性炎症。AUC，曲线下面积。
FE的总体精度没有区分嗜酸性粒细胞炎症和非嗜酸性粒细胞炎症的ROC AUC为78% (p<0.001, 95% CI 0.66 ~ 0.89) (图1)．该ROC AUC与血液嗜酸性粒细胞的ROC AUC无显著差异(p=0.09)。一个铁没有≥42 ppb水平的敏感性为63%，特异性为92% (表2)．
ELISA检测的血清骨膜蛋白不能区分嗜酸性粒细胞性和非嗜酸性粒细胞性炎症(ROC AUC=55%， p=0.44, 95% CI 0.43 ~ 0.67) (图1)．使用Elecsys periostin测定法进行的血清骨膜蛋白分析也显示了类似的结果(参见在线知识库中的在线补充结果)。
当结合这三个变量预测嗜酸性粒细胞性炎症时，未见改善，ROC AUC为88% (p<0.001, 95% CI 0.79 ~ 0.97)。其次，对以往研究中使用的不同标准的敏感性、特异性、PPV和NPV进行了介绍表2．
由于其他人报道了2%的痰嗜酸性粒细胞作为嗜酸性粒细胞性或非嗜酸性粒细胞性哮喘的替代诊断标准，8以2%的痰嗜酸性粒细胞为阈值进行ROC曲线分析。结果与使用3%痰嗜酸性粒细胞的结果相似，血液嗜酸性粒细胞的ROC AUC为88% (p<0.001)， FE的ROC AUC为79% (p<0.001)没有血清骨膜蛋白的诊断准确性不显著(参见在线知识库中的在线补充表E2)。
复制
在复制队列中，血液嗜酸性粒细胞百分比和痰嗜酸性粒细胞百分比之间也存在显著相关性(r=0.80, p<0.001)。血液嗜酸性粒细胞水平可有效评估嗜酸性粒细胞炎症，ROC AUC为85% (p< 0.001, 95% CI 0.72 ~ 0.98) (图2)．使用≥0.27×109外部验证队列中报告的/L血嗜酸性粒细胞作为最佳阈值，敏感性为60%，特异性为90%(参见在线知识库中的在线补充表E3)。与外部验证队列的结果一致，在复制队列中，血清骨膜蛋白(使用内部ELISA)和痰嗜酸性粒细胞之间没有发现相关性(r=0.13, p=0.46)，骨膜蛋白也不能区分嗜酸性粒细胞炎症和非嗜酸性粒细胞炎症(ROC AUC 54%， p=0.79, 95% CI 0.34至0.74)(图2)．使用Elecsys Periostin检测的独立分析也提供了类似的结果(参见在线知识库中的在线补充结果)。
研究结果的复制:在患有更严重哮喘的第二队列中，血液嗜酸性粒细胞(eos)和血清骨膜素(内部)诊断嗜酸性粒细胞炎症的敏感性和特异性的受试者工作特征曲线分析。AUC，曲线下面积。
讨论
本研究表明，在轻中度哮喘患者中，血液中嗜酸性粒细胞是痰中嗜酸性粒细胞的准确替代标记物。接下来，我们能够在第二组更严重哮喘患者的独立队列中复制血液嗜酸性粒细胞作为高效的替代标记。菲没有是第二好的，而血清骨膜素显示在两个队列中嗜酸性粒细胞性哮喘的准确性最低。这些研究结果表明，血液嗜酸性粒细胞计数可作为一种易于测量的痰嗜酸性粒细胞百分比的生物标志物用于轻、中、重度哮喘，对指导当前或新型抗炎治疗具有很大的实用优势。骨膜蛋白可能提供不同的信息与痰嗜酸性粒细胞，这可能是互补的哮喘表型。
有趣的是，在我们的两个队列中，血液嗜酸性粒细胞和痰嗜酸性粒细胞高度相关，并显示出最高的诊断准确性，这验证了之前的数据，31，32最近的一份报告也在一定程度上表明了这一点。21我们不能显示骨膜蛋白在两个人群中作为痰嗜酸性粒细胞的诊断标记的作用。目前的数据与之前调查气道嗜酸性粒细胞增多症与所有三个标记物之间关系的单一研究不一致，该研究显示血清骨膜蛋白的ROC AUC最高。22然而，后一项研究同时使用高痰液和高组织嗜酸性粒细胞作为嗜酸性气道炎症的定义。此外，他们只包括了未控制的严重哮喘患者，而本研究包括了更大的轻至中度患者队列和较小的严重患者队列。
在我们的研究中，FE没有似乎是嗜酸性粒细胞性炎症的第二最佳预测因子，其ROC AUC为0.78，这与以往的研究几乎相似21，22，31然而，令人惊讶的是，在我们的轻至中度疾病患者队列中，灵敏度和特异性的最佳组合达到了42 ppb的相当高的切点。即使FE没有与痰嗜酸性粒细胞明显相关，当结合ROC分析中的三个标记时，FE没有骨膜素也没有任何附加价值。我们的数据证实了最近一篇论文中发现的血液嗜酸性粒细胞与FE之间的弱相关性没有，33表明血液中嗜酸性粒细胞和FE没有与两种不同的炎症途径有关。这支持了我们的主要结果，即血液嗜酸性粒细胞计数是嗜酸性粒细胞气道炎症最强的独立预测因子。
据我们所知，这是第一项从外部验证血清骨膜蛋白作为轻至中度哮喘患者痰嗜酸性粒细胞替代标志物的研究，包括在病情更严重的第二队列中的复制。我们认为，这项研究的优势在于，我们有两个独立的特征良好的队列，哮喘的严重程度和治疗方法各不相同，但哮喘的诊断标准相似。另一个优势是外部验证队列的规模，这保证了分析的信心。然而，严重哮喘患者的复制队列的规模有限，这可能需要在大的严重哮喘队列中进行进一步的分析，如U-BIOPRED(预测呼吸疾病预后的无偏性生物标记物)。在我们的队列中，血液嗜酸性粒细胞的预测准确性不太可能受到治疗的影响，因为我们招募了不同水平的轻、中、重度患者的治疗，包括19%的重度患者使用口服皮质类固醇。接下来，两组患者的痰液用不同的标准化方法处理(整个样本vs选定的痰液)。然而，与血液嗜酸性粒细胞的相关性是一致的，这可能是由于严格的质量控制程序。根据文献，我们将3%的痰嗜酸性粒细胞作为嗜酸性或非嗜酸性气道炎症的阈值。由于其他人使用2%作为临界值，我们以2%的嗜酸性粒细胞为阈值重新分析数据，得出了类似的结果。最后，我们使用了两种独立的骨膜素测定方法，从而提高了我们数据的有效性。
本研究的一个潜在弱点是我们无法从所有患者中获得足够的痰液。然而，血液嗜酸性粒细胞计数和FE无明显差异没有痰分泌成功的患者与痰分泌失败的患者之间的水平(数据未显示)。因此，我们不认为我们的研究结果受到这一局限性的影响。此外，队列之间的吸烟状况不同，因为戒烟者被纳入验证队列，而被排除在复制队列。在验证队列中，与从不吸烟的患者相比，有吸烟史的患者痰中嗜酸性粒细胞显著升高(p=0.05)，而在血液或痰中性粒细胞、血液嗜酸性粒细胞、FE方面没有发现差异没有骨膜蛋白(p=0.26, p=0.09, p=0.46, p=0.25, p=0.31)。因此，吸烟状况似乎并没有影响我们的结果。最后，与之前的研究相比，我们使用了不同的测定方法来测定血清骨膜蛋白。我们内部对骨膜素的ELISA验证如在线知识库中描述的那样。有人认为，一些抗骨膜素抗体可能不能识别血清中所有四种骨膜素亚型。22，34由于尚不清楚血清中存在哪些异构体，我们使用山羊多克隆抗体(R&D;AF3548)与骨膜蛋白(Asn22-Gln836;数据未显示)。鉴于本研究报告的血清中骨膜素的含量与其他研究报告的相似，22，30.我们认为，我们内部的ELISA不太可能未能识别出血清中最丰富的骨膜蛋白剪接变体。此外，Elecsys Periostin抗体的附加分析旨在识别所有已知的剪接变体，显示类似的结果。
哮喘患者血液和痰嗜酸性粒细胞之间的相关性在生物学上可能并不令人惊讶。嗜酸性粒细胞在骨髓中产生，在炎症发生时，嗜酸性粒细胞的形成被放大，并流入炎症部位，这一切都受到许多细胞因子的影响，如白细胞介素(IL)-5。35哮喘患者的血液嗜酸性粒细胞有一个独特的表型，特别是与它们的粘附特性有关，36它参与了在内皮细胞和上皮细胞之间的转运。在过敏原挑战后，血液和痰中均可见嗜酸性粒细胞增多。37此外，一些研究表明静脉注射抗il -5可显著降低血液和痰液或支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞水平。18- - - - - -20.，38-41因此，尽管嗜酸性粒细胞从血液进入肺是一个复杂的活动过程，但在哮喘等慢性炎症性疾病中，血液和痰中的嗜酸性粒细胞水平似乎密切相关。
我们研究的临床意义是什么?由于与痰中嗜酸性粒细胞相比，血液嗜酸性粒细胞的测量容易且快速，我们的数据支持评估嗜酸性粒细胞气道炎症的存在或不存在，并监测哮喘的治疗。这得到了最近两项使用抗il -5(美波珠单抗)的试验的支持，结果显著减少了每日口服糖皮质激素治疗的需求，减少了严重嗜酸性粒细胞性哮喘患者的恶化和改善哮喘症状，筛查前一年血液嗜酸性粒细胞计数≥300个/µL或随机化前≥150个/µL。19，20.此外，在一项使用抗il -5靶向重度哮喘患者嗜酸性粒细胞气道炎症的大型研究中，基线水平的血液嗜酸性粒细胞计数可预测减轻加重的疗效。18该研究的后续分析显示，安慰剂组的血液嗜酸性粒细胞计数随着时间的推移趋于稳定。42此外，一些研究表明，抗il -5治疗可显著降低痰液和血液中嗜酸性粒细胞计数，但对FE无影响没有，18，40证实了血液嗜酸性粒细胞在抗il -5分层研究中的相关性。在抗il -13治疗方面，血液嗜酸性粒细胞对治疗有反应的患者的分层并不成功。43然而，后一项研究对血液嗜酸性粒细胞使用了一个更低的切点(≥0.14×10)9/L)，并结合血清IgE和血液嗜酸性粒细胞计数来鉴定IL-13标记替代品。最近一项关于抗il -4/IL-13的研究，使用更高的血液嗜酸性粒细胞切点对患者进行分层(≥0.30×109/L)，治疗后确实有显著改善，因此支持血液嗜酸性粒细胞计数作为生物标志物。44显然，这需要复制。
关于骨膜蛋白，本研究表明该生物标志物与痰嗜酸性粒细胞增多无关。这并不排除鼻窦炎作为哮喘的生物标志物对痰嗜酸性粒细胞的补充信息。事实上，由于血清骨膜蛋白被证明是预测抗il -13治疗有效性的成功生物标志物，因此骨膜蛋白很可能在基于th2 -高细胞因子谱的特异性表型鉴定中发挥有意义的作用43并与无法控制的严重哮喘患者气道嗜酸性粒细胞增多有关。22
在我们的研究中，复制队列中血液嗜酸性粒细胞在区分嗜酸性粒细胞和非嗜酸性粒细胞哮喘方面的诊断准确性与验证队列相同。然而，两个队列的最佳切割点是不同的，复制队列的切割点较低(见表2和在线补充表E3)。这可能是由不同队列之间疾病严重程度的差异所解释的。因此，当使用血液嗜酸性粒细胞计数作为嗜酸性粒细胞性气道炎症的生物标志物时，每个人群和每个研究问题的最佳切点可能不同。24
总之，在两个哮喘严重程度不同的独立队列中，我们显示了血液嗜酸性粒细胞和痰嗜酸性粒细胞之间有意义的关系。菲没有是嗜酸性粒细胞性气道炎症的次佳预测因子，尽管FE没有没有显示出对血液嗜酸性粒细胞的附加价值。轻至中度哮喘患者的血清骨膜蛋白与痰嗜酸性粒细胞无关，这一发现在病情更严重的人群中得到了重复。这表明骨膜蛋白可能捕获其他哮喘表型，而不是痰嗜酸性粒细胞本身所代表的表型。我们的数据表明，血液嗜酸性粒细胞是哮喘痰嗜酸性粒细胞的准确生物标志物，有助于有效指导哮喘个体化治疗。
致谢
我们要感谢Barbara Smids, Tamara Dekker, Dr Marianne van de Pol和Annemiek Dijkhuis对痰液进行了专业的技术处理，进行了差异细胞计数，测量了骨膜蛋白并验证了骨膜蛋白测定方法。此外，我们还要感谢来自葛兰素史克探索技术公司的Stewart Bates博士就骨膜素测量和验证提供的技术建议。最后，我们要感谢来自罗氏集团成员基因泰克公司的Cecile Holweg博士和他的同事们，感谢他们与罗氏专业诊断公司开发的Elecsys骨膜蛋白测定法合作并迅速促进了血清骨膜蛋白分析。
参考文献
补充材料
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补充数据
这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。
本数据补编中的文件:
- 数据补充1-在线增刊
脚注
AHW和SBdN贡献相同。
合作者Barbara Smids, Tamara Dekker, Marianne van de Pol, Annemiek Dijkhuis, Stewart Bates, Cecile Holweg。
贡献者AHW和SBdN对数据进行了收集和分析，并撰写了论文。RL、ARS、EJMW、EHB和PJS负责研究的设计，并对文章进行了批判性的修改。所有人都同意出版这个版本。
资金本研究是由研究人员发起的研究，由葛兰素史克的两项无限制赠款和罗氏集团的成员基因泰克提供资金支持。
相互竞争的利益所有作者声明本稿件不存在竞争利益。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准阿姆斯特丹医学学术中心的医学伦理委员会。
来源和同行评审不是委托;外部同行评审。
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