蛋白酶体抑制损伤后由调制TGF-β1阻止纤维化信号|胸腔 - 188bet官网地址,188bet体育备用网址,188bet手机版188bet手机版

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材料

间质性肺病

原文

蛋白酶体抑制损伤后通过调制TGF-β阻止纤维化₁信号

免费的

Gokhan M Mutlu1,2,
G R斯科特·巴丁格1,2,
明华吴1,2,
安娜P林1,2,
亚伦Zirk1,2,
斯蒂芬妮·里维拉1,2,
丹妮拉Urich1,2,
塞尔吉奥·E Chiarella1,2,
伦纳德H T去1,
Asish K Ghosh1,2,
莫伊塞斯塞尔曼说3,
安妮·帕尔多4,
约翰·巴尔加1,2,
大卫·W坎普1,2,
Navdeep年代昌德尔1,2,
雅各Iasha Sznajder1,2,
马努耆那教徒的1,2

¹西北大学医学系,芝加哥,伊利诺斯州,美国
²细胞分子生物学、西北大学、芝加哥,伊利诺斯州,美国
³西班牙德已经患有Respiratorias Tlalpan,墨西哥城,墨西哥
⁴大学根据墨西哥“Ismael Cosio Villegas”,墨西哥联邦直辖区

对应到G R博士斯科特·巴丁格休伦e大街240号,McGaw m - 332,西北大学,芝加哥,60611年,美国;s-buding在}{northwestern.edu

文摘

背景损伤后器官纤维化的发展需要激活的转化生长因子β₁负责监管profibrotic基因的转录。蛋白酶体抑制剂已被报道的系统性管理,防止肝纤维化的发展,肾脏和骨髓。提出,蛋白酶体抑制将防止抑制TGF-β伤后肺和皮肤纤维化₁介导的转录。

方法Bortezomib,小分子在广泛的临床使用蛋白酶抑制剂,在气管内的后接种小鼠开始7天或皮内注射博来霉素和肺和皮肤纤维化测量21岁或40天后,分别。检查机制的保护,bortezomib管理是基本正常的肺成纤维细胞和主肺和皮肤成纤维细胞获得特发性肺纤维化和硬皮病患者,分别。

结果Bortezomib促进正常维修和预防肺和皮肤纤维化时注射博来霉素开始后7天开始。原代人肺成纤维细胞在正常个体和特发性肺纤维化患者和从硬皮病患者皮肤成纤维细胞,bortezomib抑制TGF-β₁调节目标基因表达的抑制转录激活Smads引起的。增加数量和活动的核激素受体PPARγSmad-mediated转录抑制因子,导致这种反应。

结论蛋白酶体抑制防止肺和皮肤纤维化损伤后部分通过增加PPARγ的丰度和活动。蛋白酶体抑制可能提供一种新颖的患者的治疗选择提供组织修复和纤维化。

Bortezomib纤维化/ PPARγ/蛋白酶体/ TGF-β1
ARDS
细胞因子生物学
睡眠呼吸暂停
气道上皮细胞
氧化应激
肺部水肿

http://dx.doi.org/10.1136/thoraxjnl - 2011 - 200717

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关键信息

关键问题是什么?

可以系统性管理的蛋白酶体抑制剂bortezomib预防损伤后肺纤维化的发展建立了吗?

底线是什么?

Bortezomib预防肺纤维化的发展和皮肤通过抑制转化生长因子β₁介导的转录。

为什么要读吗?

Bortezomib,广泛的临床使用的药物,可能为肺纤维化的患者提供治疗的选择。

介绍

受伤后,恢复正常组织功能是可以预防或延迟了纤维化的发展。1在动物模型中,激活细胞因子转化生长因子β₁(TGF-β₁)是必需的和充分的发展的肺纤维化和其他器官。2肺,气管内的管理博来霉素导致急性肺损伤,峰后3 - 5天博来霉素和是TGF-β紧随其后₁端依赖肺纤维化。2活跃TGF-β₁绑定到特定的膜受体转录调节myofibrobast分化诱导信号级联,胶原蛋白表达和内皮/上皮间充质细胞转变。3TGF-β转录激活项目₁因此,一个有吸引力的治疗目标器官纤维化后损伤的预防。2

除了蛋白质周转的作用,泛素蛋白酶体系统中起关键作用的调制至关重要的细胞信号通路。4Bortezomib是蛋白酶体抑制剂批准用于临床治疗多发性骨髓瘤,套细胞淋巴瘤。5 6在动物模型中,bortezomib和其他蛋白酶体抑制剂可以防止肝纤维化,肾、骨髓和心脏,这表明它的作用抑制共同通路参与器官纤维化。7 - 10在这项研究中,我们试图确定血液病中的作用政府可以防止肺和皮肤纤维化引起博来霉素通过抑制TGF-β₁介导的转录。

方法

动物和博来霉素bortezomib总局

协议使用动物是西北大学动物保健和使用委员会批准。博来霉素肺损伤和纤维化的协议已经被描述在其他地方(有关详细信息,请参阅在线补充)。11血液病中的作用后进行试点实验使用不同剂量时间表(在线补充细节),野生型C57BL / 6小鼠气管内的对待博来霉素(0.075 IU /鼠标)7和14天过后,bortezomib(120μg /公斤腹腔内)或生理盐水和肺纤维化是测量21天。为皮肤纤维化实验,6-8-week-old雌性BALB / c小鼠接受filter-sterilised博来霉素(20μg /鼠标,梅恩制药,帕拉默斯,新泽西,美国)或盐水每天皮下注射(针规27日)到剃面积皮肤的动物。Bortezomib(400μg /公斤腹腔内)或车辆后7天开始的第一剂量博来霉素和每周服用两次,直到动物被杀在40天。

细胞和试剂

正常的人类肺成纤维细胞来源于Lonza(瑞士巴塞尔)。细胞融合所有条件和增长到70%后被丢弃的通道5。抗体使用包括αSMA(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国),荧光anti-mouse抗体(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国),p-Smad3(细胞信号,波士顿,麻萨诸塞州,美国),Smad1, 2 3(总Smad), CTGF和PPARγ(美国加州圣克鲁斯,Santa Cruz),胶原蛋白我(SouthernBiotech,伯明翰,阿拉巴马州,美国)和肌动蛋白和微管蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。SBE-luciferase和PPRE-luciferase记者曾被描述。12 13测定荧光素酶的活动(Promega Dual-Luciferase记者分析系统)进行了如前所述(见细节在网上补充)。14

实时定量PCR (RT-qPCR)

实时定量PCR进行如前所述根据出版的指导方针和特定的信使rna表达是正常的线粒体基因RPL19。15详细的协议和引物序列给出了在线补充。

免疫印迹和免疫荧光

免疫印迹和免疫荧光进行如前所述(见细节在线数据补充)。16

测量的活跃TGF-β₁

活跃TGF-β₁测量从支气管肺泡灌洗(BAL)流体在重复使用TGFβ吗₁E_马克斯免疫分析系统(ELISA)根据制造商的协议(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)。本试验只TGF-β措施₁裂解和生物活性。17

组织学和测量肺胶原蛋白

肺和皮肤组织学进行如前所述。11 18肺胶原蛋白测量使用先前描述的修改方法。19在网上提供的补充细节。

慢病毒PPARγ成分

pLKO。1vector was used to express shRNA targeting PPARγ1 as described previously.19使用下列顺序:5′CCGGCTGGCCTCCTTGATGAATAAACTCGAGTTTATTCATCAAGGAGGCCAGTTTTT”3。提供的控制shRNAσ。稳定细胞系被Virapower生成使用293英尺(表达载体)慢病毒感染包装细胞系和嘌呤霉素选择。293英尺转染48小时后,介质含有病毒补充8μg /毫升聚凝胺(Sigma-Aldrich)细胞株感染和应用于正常的人类肺成纤维细胞。

临床标本收集

临床数据的收集和标本被西北大学制度审查委员会批准。BAL流体从10患者的临床和放射学诊断肺纤维化和八个控制病人使用。14病人的临床细节给出了在线补充。正常的人类肺成纤维细胞是瞬变与SBE-luciferase转染质粒和孵化24 h和BAL流体从10肺纤维化患者获得或控制病人没有实质的证据,肺部疾病在血液病中的作用存在与否(200海里)。14样品从肺纤维化肺和控制肺成纤维细胞培养和存储如前所述。20.皮肤活检获得的样本的皮肤成纤维细胞的影响和影响区域的前臂硬皮病患者如前所述。21

统计分析

棱镜4中的数据进行分析(美国加州La Jolla GraphPad软件公司)。所有数据显示为手段的标准错误的意思。统计学意义是由方差分析;方差分析显示显著差异时,个体差异是探索使用t测试Bonferroni或Dunnett修正多重比较。p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

Bortezomib抑制bleomycin-induced纤维化肺和皮肤

类似于之前的报告,我们观察到,> 70%的老鼠死于高或低剂量bortezomib(分别为400或120μg /公斤腹腔内)和博来霉素之前或同时服用。22我们没有观察到小鼠的死亡率在bortezomib博来霉素后7天或更多的政府(定量的描述给出时间表使用在线补充)。血液病中的作用的最低剂量使用(120μg /公斤腹腔内)是足够敏锐地抑制chymotrypsin-like血红细胞的蛋白酶体活性和血清控制老鼠(参见图S1在线补充)。老鼠接受bortezomib(120μg /公斤腹腔内)7和14天博来霉素政府在收获后的评估肺胶原评估trichrome-stained肺组织学检查的部分,picrosirius红胶原蛋白沉淀(图1 a和C利用抗体与I型胶原蛋白)和免疫印迹(参见图S2f在线补充)。纤维化也减毒老鼠血液病中的作用单剂量治疗7天(参见图S3在线补充)和有限数量的老鼠接受bortezomib(120μg /公斤腹腔内)14和21天博来霉素管理和收获后的评估纤维化在28天(参见图在网上补充S4)。

Bortezomib abrogates pulmonary and skin fibrosis induced by bleomycin in mice. (A) Mice (C57BL/6, male) were treated with intratracheal bleomycin or saline (0.075 IU). Seven and 14 days later the mice were treated with bortezomib (120 μg/kg intraperitoneally) or saline. The mice were killed on day 21 and the lungs were examined by trichrome staining. (B) A separate group of mice (BALB/c) were treated with daily subcutaneous injections of bleomycin (20 μg) in the same region of the skin on their back and bortezomib (400 μg/kg intraperitoneally twice weekly) or saline was begun 7 days later. After 4 weeks, H&E-stained skin sections of the treated skin were obtained. The thickest regions of skin for each treatment are shown. (C) Total lung collagen was quantified by picrosirius red collagen precipitation and (D) skin thickness was measured microscopically (n≥8 (lung) and n=5 (skin) for each treatment arm). p Values for comparisons between groups are indicated in italics above the bars.

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图1

Bortezomib废除肺和皮肤纤维化博来霉素诱导的小鼠。(A)小鼠(雄性C57BL / 6,)治疗气管内的博来霉素或生理盐水(0.075 IU)。7到14天后,老鼠接受bortezomib(120μg /公斤腹腔内)或生理盐水。老鼠被杀死在21天,肺部被三色的染色检查。(B)另一组老鼠(BALB / c)是处理每日皮下注射博来霉素(20μg)在同一地区的皮肤,bortezomib(每周400μg /公斤腹腔内两次)或生理盐水是7天后开始。4周后,H&E-stained治疗皮肤的皮肤部分。皮肤最厚的地区显示为每个治疗。(C)肺总胶原蛋白被picrosirius量化红胶原蛋白沉淀和(D)的皮肤厚度测量显微镜下(n≥8(肺)和n = 5(皮肤)为每个治疗手臂)。组间比较p值在酒吧上面斜体表示。

我们还研究了在血液病中的作用效果硬皮病皮肤纤维化小鼠模型。23与生理盐水相比,bortezomib(400μg /公斤腹腔内每周两次)大幅减弱皮肤纤维化bleomycin-treated老鼠的组织学评估和量化真皮厚度(图1 b和1 d)。

Bortezomib抑制TGF-β₁全身的成纤维细胞通过阻止Smad-mediated转录的基因表达

我们用Smad-responsive转染主要正常的人类肺成纤维细胞荧光素酶记者构造。12Bortezomib导致剂量依赖性抑制Smad-mediated转录响应TGF-β重组₁(图2一个)。在一剂200海里,bortezomib一样有效ALK5受体抑制剂SB431542(10μM) (图2一个)。没有观察到明显的细胞死亡血液病中的作用剂量使用(参见图S5在网上补充)。后TGF-β₁刺激,bortezomib造成非重要增加基底和磷酸化Smad3水平在整个细胞溶解产物(图2 b),不影响核的磷酸化水平Smad3 (图2 c)。

Bortezomib does not inhibit transforming growth factor β1 (TGF-β1)-induced Smad3 phosphorylation or nuclear translocation but inhibits Smad-mediated transcription. (A) Primary cultures of normal human lung fibroblasts were transfected with a plasmid containing SBE-luciferase and 24 h later treated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib. SBE-luciferase activity was measured 24 h later. Treatment with the ALK-5 inhibitor SB431542 (10 μM) is shown as a control. p<0.0001 for difference in dose determined by one-way ANOVA; Bonferroni-corrected p<0.05 for comparisons between TGF-β1 alone and all other conditions. (B, C) Primary cultures of normal human lung fibroblasts were grown to 70% confluence and incubated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib (0.2 μM). The level of phosphorylated Smad3 was measured in (B) total cell lysates and (C) nuclear extracts using total Smad3 and RNA polymerase II (RNA Pol II) as loading controls, respectively. Phosphorylated-Smad3 expression was quantified using densitometry. p Values for comparisons are indicated in italics above the bars (N ≥3 for all measures).

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图2

Bortezomib并不抑制转化生长因子β₁(TGF-β₁全身的)Smad3磷酸化或核易位但抑制Smad-mediated转录。(A)的主要文化正常人类肺成纤维细胞转染质粒含有SBE-luciferase和24 h后TGF-β对待₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib。SBE-luciferase活动测量24 h后。治疗ALK-5抑制剂SB431542(10μM)显示为控制。p < 0.0001为差异剂量由单向方差分析;Bonferroni-corrected TGF-β之间比较p < 0.05₁单独和其他条件。(B, C)正常的人类肺成纤维细胞的主要文化融合和孵化TGF-β增长到70%₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib(0.2μM)。磷酸化水平Smad3测量总细胞溶解产物(B)和(C)核提取使用总Smad3和RNA聚合酶II (RNA聚合酶II)加载控制,分别。使用微Phosphorylated-Smad3表达量化。比较p值显示在上方斜体酒吧(N≥3为所有措施)。

在正常的人类肺成纤维细胞重组TGF-β对待₁,增加TGF-βmRNA和蛋白水平₁目标基因α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)和结缔组织生长因子(CTGF)减毒的治疗bortezomib(200海里)(图3和图3 b)。压制TGF-β₁介导的转录的信使rna编码CTGF和另一个TGF-β₁目标基因的纤溶酶原activator-1物(PAI-1)持续至少6天后血液病中的作用去除培养基(图3 c)。这是伴随着减少细胞的蛋白酶体活性溶解产物(参见图S3在网上补充)。

Bortezomib inhibits transforming growth factor β1 (TGF-β1)-induced gene expression in primary normal human lung fibroblasts. (A) Early passage primary cultures of normal human lung fibroblasts were grown to 70% confluence, serum-starved for 24 h and incubated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib (200 nM). After 24 h, α-smooth muscle actin (α-SMA) mRNA and protein were measured using RT-qPCR and immunohistochemistry, respectively. (B) Identically treated cells were harvested for measurement of connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and protein expression using RT-qPCR and immunoblotting, respectively. (C) Normal human lung fibroblasts were treated with bortezomib (200 nM) for 24 h, cultured in media without bortezomib for 5 days, treated with TGF-β1 (5 ng/ml) in the absence of serum and 24 h later RNA was harvested for measurement of mRNA encoding the TGF-β1 target genes CTGF and plasminogen activator-1 (PAI-1). The number of days after the single dose of bortezomib is indicated (N ≥3 for all conditions). p Values are indicated in italics above the bars.

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图3

Bortezomib抑制转化生长因子β₁(TGF-β₁全身的)基因表达在初级正常的人类肺成纤维细胞。(一)正常的人类肺成纤维细胞的早期主要通过文化融合,增长到70% serum-starved 24 h和TGF-β孵化₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib(200海里)。24小时后,α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA) mRNA和蛋白测定使用RT-qPCR和免疫组织化学,分别。(B)相同治疗细胞收获测量的结缔组织生长因子(CTGF) mRNA和蛋白表达使用RT-qPCR和免疫印迹,分别。(C)正常的人类肺成纤维细胞治疗与bortezomib(200海里)24 h,培养在媒体没有bortezomib 5天,TGF-β对待₁(5 ng / ml)在缺乏血清和24 h后RNA是测量的信使RNA编码TGF-β收获₁目标基因CTGF和纤溶酶原activator-1物(PAI-1)。的天数在血液病中的作用单剂量(N≥3为所有条件)表示。p值在酒吧上面斜体表示。

Bortezomib PPARγ丰度和活动增加肺成纤维细胞

PPARγ的明显的半衰期,Smad-mediated转录抑制因子,在正常的人类肺成纤维细胞在血液病中的作用存在与否来衡量。24Bortezomib增加了蛋白质丰度和半衰期的PPARγ存在和缺乏TGF-β₁(图4 a和4 b)。TGF-βbortezomib预防治疗₁介导的转录镇压PPARγ衡量使用PPRE-luciferase记者试验(图4 c)和PPARγ目标基因的转录脂肪酸结合蛋白4 (FABP4) (图4 d)(正(罗格列酮)和负(GW9662)控制图S6在线补充)。野生动物也接受bortezomib(120μg /公斤腹腔内)和24 h后肺匀浆对PPARγ使用抗体免疫印迹。治疗bortezomib导致肺总水平的增加PPARγ(图4 e)。

Bortezomib increases PPARγ abundance and activity in normal human lung fibroblasts. (A) Primary normal human lung fibroblasts were cultured in the presence of cycloheximide (10 μg/ml) with and without bortezomib (200 nM) and the protein abundance of PPARγ was assessed by immunoblotting at the indicated times. (B) The same experiment to that described in (A) was performed in cells treated with transforming growth factor β1 (TGF-β1, 5 ng/ml). (C) Primary normal human lung fibroblasts were infected with a plasmid containing PPARγ response element (PPRE)-luciferase. Twenty-four hours after transfection the cells were treated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib and PPRE-luciferase activity was measured 24 h later. (D) Primary normal human lung fibroblasts were treated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib and the mRNA level of the PPARγ target gene FABP4 was measured 24 h later by RT-qPCR. (E) Bortezomib (120 μg/kg intraperitoneally) was administered to mice and 24 h later lung homogenates were immunoblotted using an antibody against PPARγ. p Values are indicated in italics above the bars (N ≥3 for all measures).

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图4

Bortezomib增加PPARγ丰富和活动正常的人类肺成纤维细胞。(一)主要正常的人类肺成纤维细胞培养的放线菌酮(10μg /毫升)有无bortezomib (200 nM)和蛋白质丰富的PPARγ在指定的时间被免疫印迹评估。(B) (A)中描述的相同的实验,进行与转化生长因子β细胞治疗₁(TGF-β₁5 ng / ml)。(C)主要正常的人类肺成纤维细胞被感染(PPRE)荧光素酶质粒含有PPARγ响应元素。24小时与TGF-β1转染细胞治疗后(5 ng / ml)有或没有bortezomib和PPRE-luciferase活动测量24 h后。(D)与TGF-β主要正常的人类肺成纤维细胞治疗₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib和PPARγ目标基因的mRNA水平FABP4被RT-qPCR测量24 h后。(E) Bortezomib(120μg /公斤腹腔内)是管理的老鼠和24 h后肺匀浆对PPARγ使用抗体免疫印迹。p值显示在上面的斜体酒吧(N≥3为所有措施)。

我们推断,如果TGF-β的抑制₁介导的转录bortezomib部分由于PPARγ增加,那么PPARγ受体激动剂应该加强和PPARγ应该血液病中的作用效果减弱。我们对待正常的人类肺成纤维细胞的血液病中的作用剂量抑制TGF-β最小₁介导的转录(10海里,图5一个),罗格列酮(10μM)或两个在一起。独自与代理相比,低剂量的组合bortezomib TGF-β罗格列酮明显较低₁CTGF信使rna介导的增加(图5一个)。我们用慢病毒成分生成一行正常的人类肺成纤维细胞的稳定击倒PPARγ(或控制慢病毒)和治疗与TGF-β这些细胞₁在血液病中的作用存在与否。TGF-β的抑制₁介导的转录CTGF PPARγ击倒bortezomib明显减毒的细胞(图5 b)。

Bortezomib modulates fibrotic gene expression via PPARγ. (A) Primary normal human lung fibroblasts were incubated with transforming growth factor β1 (TGF-β1, 5 ng/ml) with or without low-dose bortezomib (10 nM) or rosiglitazone (10 μM) and 24 h later connective tissue growth factor (CTGF) mRNA expression was measured using RT-qPCR. (B) Primary normal human lung fibroblasts were stably transfected with a shRNA against PPARγ or a control lentivurus and PPARγ levels were measured by immunoblotting (densitometry shown to the right of the blot). These cells were treated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib (200 nM) and CTGF mRNA was measured 24 h later (RT-qPCR). p Values are indicated in italics above the bars. In addition, p=0.026 for comparison between control transfected cells treated with TGF-β1 or TGF-β1 and bortezomib and p=0.12 for comparison between PPARγ and control shRNA cells treated with TGF-β1 alone.

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图5

通过PPARγBortezomib调节纤维化的基因表达。(一)主要正常的人类肺成纤维细胞和转化生长因子β孵化₁(TGF-β_1,5 ng / ml)有或没有低剂量bortezomib (10 nM)或罗格列酮(10μM)和24 h后结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达用RT-qPCR测量。(B)主要正常的人类肺成纤维细胞是稳定转染的shRNA PPARγ或控制lentivurus和PPARγ水平衡量免疫印迹(右边的污点微显示)。这些细胞是TGF-β对待₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib (200 nM)和CTGF mRNA测量24 h后(RT-qPCR)。p值在酒吧上面斜体表示。此外,p = 0.026对比控制转染细胞TGF-β对待₁或TGF-β₁bortezomib和p = 0.12对比PPARγTGF-β处理和控制成分细胞₁一个人。

Bortezomib抑制TGF-β的自分泌释放₁

正常的人类肺fibrblasts TGF-β处理₁在血液病中的作用存在与否和TGF-β₁信使rna进行了测量。TGF-β的自分泌感应₁被bortezomib抑制(图6)。以确定是否这种机制可能是重要的体内,BAL TGF-β流体水平的活跃₁测量后的14天博来霉素治疗的老鼠在7天与bortezomib(120μg /公斤)或生理盐水。TGF-β的增加活跃₁博来霉素后落下帷幕流体在观察14天减毒老鼠接受单剂量在第七天(血液病中的作用图6 b)。

Bortezomib inhibits transforming growth factor β1 (TGF-β1) autocrine expression. (A) Primary normal human lung fibroblasts were incubated with TGF-β1 (5 ng/ml) with or without bortezomib (200 nM) and 24 h later TGF-β1 mRNA expression was measured using RT-qPCR. (B) Intratracheal bleomycin (0.075 IU) or saline was instilled into mice and intraperitoneal bortezomib (120 μg/kg) or saline was administered 7 days later. Bronchoalveolar lavage was performed 14 days after bleomycin treatment for measurement of the level of active TGF-β1 by ELISA. p Values are indicated in italics above the bars.

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图6

Bortezomib抑制转化生长因子β₁(TGF-β₁)自分泌表达。(一)主要正常的人类肺成纤维细胞与TGF-β孵化₁(5 ng / ml)有或没有bortezomib(200海里),24小时之后TGF-β₁使用RT-qPCR mRNA表达测定。(B)气管内的博来霉素(0.075 IU)或生理盐水注入到老鼠和腹腔内bortezomib(120μg /公斤)或生理盐水注射7天以后。支气管肺泡灌洗进行博来霉素治疗14天后TGF-β测量水平的活跃₁通过ELISA。p值在酒吧上面斜体表示。

Bortezomib生物样本中基因表达抑制profibrotic肺纤维化和硬皮病患者

我们检查在血液病中的作用效果profibrotic基因转录诱导BAL患者肺纤维化的流体样本。与我们以前的报告一致,TGF-β更高水平的活跃₁被球流体从肺纤维化患者比控制(参见图S7在线补充)。14矿山管理的流体从9的肺纤维化患者正常的人类活动增加的SBE-luciferase肺成纤维细胞,为每个这些九个病人,增加被bortezomib抑制(图7)。然后,我们比较了TGF-β血液病中的作用效果₁全身的皮肤成纤维细胞基因转录隔绝的地区从硬皮病患者纤维化或正常皮肤。21基线CTGF和PAI-1 mRNA水平更高的纤维在成纤维细胞分离地区的皮肤比正常皮肤。在正常和纤维化的皮肤成纤维细胞TGF-β₁这些基因介导的转录显著抑制bortezomib (图7 b)。最后,我们研究了在TGF-β血液病中的作用效果₁全身的基因转录原发性肺成纤维细胞分离三个患者肺纤维化。基底和TGF-β₁全身的转录CTGF和PAI-1被bortezomib抑制这些细胞(图7 c)。

Bortezomib inhibits profibrotic gene expression in biological samples obtained from patients with lung fibrosis or scleroderma. (A) Primary cultures of normal human lung fibroblasts transfected 24 h earlier with a plasmid containing SBE-luciferase were incubated with bronchoalveolar lavage fluid obtained from 10 patients with lung fibrosis or eight patients without evidence of lung fibrosis with or without bortezomib (200 nM). SBE-luciferase activity was measured 24 h later. (B) Primary cultures of skin fibroblasts obtained from a region of normal or fibrotic skin from a patient with scleroderma and (C) primary lung fibroblasts cultured from three patients (Pts 1, 2 and 3) with lung fibrosis were treated with transforming growth factor β1 (TGF-β1, 5 ng/ml) with or without bortezomib or bortezomib alone and the levels of connective tissue growth factor (CTGF) and plasminogen activator-1 (PAI-1) mRNA were measured using RT-qPCR. p Values are indicated in italics above the bars.

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图7

Bortezomib抑制profibrotic基因表达在生物样品从肺纤维化或硬皮病患者。(A)的主要文化正常的人类肺成纤维细胞与质粒转染24小时前含SBE-luciferase孵化与支气管肺泡灌洗液从10肺纤维化患者或获得八个肺纤维化的患者没有证据显示有或没有bortezomib(200海里)。SBE-luciferase活动测量24 h后。(B)的主要文化中,正常皮肤成纤维细胞从一个地区或纤维从硬皮病患者皮肤,(C)主要从三个病人肺成纤维细胞培养(分1、2、3)与肺纤维化治疗转化生长因子β₁(TGF-β₁5 ng / ml)有或没有bortezomib或独自bortezomib和水平的结缔组织生长因子(CTGF)和纤溶酶原activator-1物(PAI-1) mRNA使用RT-qPCR测量。p值在酒吧上面斜体表示。

讨论

这项研究表明,蛋白酶体抑制剂的系统性管理bortezomib老鼠开始后7天博来霉素政府预防肺和皮肤纤维化。在初级正常的人类肺成纤维细胞,bortezomib TGF-β抑制₁介导的转录profibrotic基因下游Smads的磷酸化和核易位。此外,bortezomib抑制Smad-mediated转录诱导BAL TGF-β流体从肺纤维化患者和预防₁全身的皮肤和肺成纤维细胞的基因转录硬皮病患者和肺纤维化。增加bortezomib-induced PPARγ的丰富和活动导致这种反应是一个重要的机制。

在动物模型中,蛋白酶体抑制剂已报告改善肝脏脂肪变性和纤维化,7骨髓纤维化,8心脏纤维化9和肾纤维化。10在这些报告,几个不同的机制被提出解释的antifibrotic影响蛋白酶体抑制包括肝星状细胞凋亡的诱导、激活NF-κB信号和基质金属蛋白酶的激活。这些机制的广泛antifibrotic影响占蛋白酶体抑制发散profibrotic刺激在多个器官的反应。我们发现bortezomib抑制TGF-β₁介导的转录提供了一个通用机制,和所有这些发现是一致的。

符合之前的报道,我们发现bortezomib并没有阻止的磷酸化和核易位Smad3 TGF-β响应₁在正常的人类肺成纤维细胞。22尽管如此,Smad记者的活动TGF-β的表达₁目标基因抑制细胞内bortezomib对待。这些发现表明,bortezomib施加其antifibrotic Smad-mediated转录水平的影响。转录反应激活Smads由两个转录控制co-activators(如p300)和体若。后者包括PPARγ、平和滑雪。3 25PPARγ核激素受体和转录因子所必需的正常脂肪形成和葡萄糖稳态,可以激活内源性脂类和类花生酸或thiazolidinedione抗糖尿病的药物如罗格列酮。26我们以前报道,PPARγ抑制TGF-β₁在成纤维细胞信号和目标基因表达作为若Smad-mediated转录。25在这项研究中我们发现,bortezomib PPARγ半衰期和转录活动的增加。在成纤维细胞窝藏稳定的PPARγ击倒,TGF-β血液病中的作用效果₁介导的转录显著减弱。此外,bortezomib行动PPARγ受体激动剂罗格列酮抑制TGF-β的增效剂₁介导的转录。集体这些数据表明,随着其他机制,增加丰富和活动TGF-βPPARγ有助于抑制₁由bortezomib介导的转录。

类似于人类血液病中的作用报道描述药效学,我们观察到只有适度降低血清和红细胞蛋白酶体活动管理药物后3小时以内。27然而,我们观察到深刻antifibrotic影响药物时每周服用一次。这一发现是类似于临床试验获得的结果使用每周剂量时间表血液学的恶性肿瘤的治疗。28血液病中的作用已经推测微分间隙的血清和组织之间的差异解释了经济复苏的动力学的蛋白酶体活动所需的血液和剂量的频率达到抗肿瘤药的效果。我们观察到治疗正常的人类肺成纤维细胞与单个剂量抑制细胞内蛋白酶体活性和TGF-β血液病中的作用₁介导的转录长达7天支持这一假说。此外,TGF-β₁据报道诱导自己的转录和释放成纤维细胞自分泌环。29日我们发现bortezomib抑制TGF-β的自分泌生产₁在体外和体内。我们推测,血液病中的作用长期效应细胞和中断的自分泌TGF-β的生产₁解释其antifibrotic效应在低剂量,减少频繁的计划给我们。

PPARγ受体激动剂罗格列酮提供适度的保护bleomycin-induced肺纤维化小鼠在接种前3天博来霉素。30.这与几乎完全保护我们观察小鼠接受bortezomib 7、博来霉素后14天。我们推测这种差异可能导致加速PPARγ的蛋白酶体降解引起的治疗与罗格列酮和其他thiazolidinediones。31日符合这个机制,我们观察到TGF-β的协同抑制作用₁介导的转录小鼠接受罗格列酮和bortezomib;完全抑制TGF-β所需血液病中的作用浓度₁介导的转录低20倍时管理结合罗格列酮。

Fineschi等报道称,bortezomib未能防止bleomycin-exposed小鼠肺纤维化;然而,这些调查人员管理bortezomib之前或同时与博来霉素的管理。22符合他们的发现,当我们观察到超额死亡率bortezomib和博来霉素与此同时管理。博来霉素的管理结果在急性肺损伤,山峰3 - 5天后,慢慢解决之后,这些发现可能提供洞察的零星报告患者肺毒性开发,包括致命的间质性肺炎,而每周接受两次bortezomib血液学的恶性肿瘤。尺码虽然投机,这可能是致命的肺事件与bortezomib导致治疗肺炎患者的管理。支持这一假说,治疗指南开发针对bortezomib-related肺部并发症的报告建议避免bortezomib患者肺炎的证据。这些指导方针的实现与减少bortezomib-related肺毒性有关。27 35

开始时我们发现bortezomib有效7天博来霉素后政府形成鲜明对比其他防止bleomycin-induced肺纤维化的药理治疗。例如,与伊马替尼治疗的老鼠(抑制剂TGF-βSmad-independent信号₁)政府之前博来霉素预防肺纤维化的后续发展36但在博来霉素时无效的管理。37最近的一项临床试验的伊马替尼在特发性肺纤维化患者未能显示改善死亡率或肺的生理参数。38根据这些和其他数据,一些研究者主张,只有药物是有效预防纤维化后,管理应该考虑博来霉素临床的发展。39

结论

Bortezomib,药物有定义良好的和可接受的毒性和明确的作用机制,5 6防止bleomycin-induced肺纤维化小鼠。它不同于其他治疗策略抑制bleomycin-induced肺纤维化是有效后,鉴于bleomycin-induced急性肺损伤和TGF-β了顶峰₁活跃于肺。血液病中的作用政府是同样有效预防bleomycin-induced皮肤纤维化。Bortezomib有效抑制TGF-β₁信号主要正常的人类肺成纤维细胞和成纤维细胞的肺和肺纤维化或硬皮病患者皮肤,分别抑制profibrotic活动落下帷幕流体诱导的肺纤维化患者。我们的研究结果表明,bortezomib-mediated TGF-β的丰度和活动的增加₁转录阻遏PPARγ有助于antifibrotic活动。考虑到缺乏证明antifibrotic疗法,临床试验评估单独或结合血液病中的作用功效PPARγ受体激动剂组织纤维化患者可能是合理的。

确认

作者感谢博士Joan Massague SBE-luciferase构造。PPRE-luciferase质粒是由罗纳德·埃文斯博士和克里斯托弗玻璃博士请提供给我们。作者感谢博士伦Ciechanover协助开发和评审的手稿。

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