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背景厌氧细菌越来越被视为重要的囊性纤维化(CF)肺部感染。本研究的目的是确定抗生素治疗的效果在有氧和厌氧微生物群落多样性和丰富在CF患者急性加重。
方法痰收集的开始和完成抗生素治疗急性加重,当临床稳定。细菌被量化,确定后文化和社区组成也检查了使用文化无关的方法。
结果铜绿假单胞菌或伯克不过复杂的24/26样品中检测到文化的治疗,22/26完成的样本处理和11/13样品稳定。厌氧细菌被发现在所有的治疗和稳定的样品,样品在23/26完成治疗。分子分析显示痰标本细菌多样性大于被文化;有相当好的协议方法等有氧细菌的存在与否P绿脓杆菌(κ= 0.74)B不过复杂的(κ= 0.92),但对厌氧菌协议是贫穷。这两种方法都表明,细菌群落的组成不同病人之间在大多数人尽管治疗但仍相对稳定。细菌丰度降低了短暂治疗后,对需氧菌这种效应更加明显(平均总活菌数下降2.3×107cfu / g, p = 0.005)比厌氧菌(平均总活菌数下降3×106cfu / g, p = 0.046)。
结论抗生素治疗针对需氧菌对大量的厌氧菌和社区的影响最小的组成、文化和分子检测方法要求全面描述微生物群落的CF肺。还需要进一步的研究来确定最佳治疗的临床意义这些新发现的细菌。
- 囊性纤维化
- 厌氧生物
- 感染
- 分子检测
- 恶化
- 细菌感染
- 支气管扩张
- 囊性纤维化
来自Altmetric.com的统计
慢性细菌性肺感染复发感染加重导致不可逆转的囊性纤维化患者的肺功能下降(CF)和早期死亡。1常规细菌培养方法识别需氧细菌铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌和伯克不过复杂的2作为成人CF肺部感染的主要病原菌。
厌氧条件下,存在于肺部的CF患者3促使搜索CF粘液由专性厌氧菌感染。研究使用由PCR分子检测和末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)表明,厌氧生物出现在CF痰和是一个高度多元化的社区和新陈代谢活跃幼童腹壁薄弱。4 - 7在最近的一项研究中我们用严格的厌氧细菌培养技术和光谱检测到潜在的致病性厌氧物种包括普氏菌,韦永氏球菌属和放线菌高数(最多9×107cfu / g痰)42/66(64%)的患者痰液样本收集的临床稳定的CF。8随后的文化910和分子91112研究也发现厌氧菌降低气道分泌物从成人和儿童稳定的CF,表明厌氧生物可能贡献的CF肺部疾病阶段。厌氧细菌因此潜在CF下呼吸道感染的重要病原体,它们在疾病进展中的作用可能被低估了。811
如果厌氧细菌活跃,导致肺感染和炎症的CF,他们的存在在大量可能需要改变的抗生素用于治疗肺患者急性加重,确保最优的结果。在这项研究中,我们评估有氧和厌氧细菌群落组成在起始和完成标准的抗生素治疗急性恶化。此外,评价抗菌治疗这些不同生物的影响,我们研究了纵向细菌负荷的变化和多样性在恶化,当临床稳定。鉴于大多数细菌物种是耐火材料文化,13我们还比较了使用有氧和厌氧文化和文化无关分子技术确定微生物群落组成。
方法
病人的选择和收集样本
12个月期间(2006年2月到2007年1月),患者肺恶化前一年被招募了研究门诊访问期间如果他们临床稳定住进医院或恶化的抗生素治疗。后续的样本收集这些患者提供恶化或在他们的下一个访问常规门诊,分别。“临床稳定”被定义为在症状没有改变,用力呼气量在1 s (FEV1)在10%的最佳值在前6个月,没有新的抗生素开始。福克斯的发作是根据定义的标准等。14恶化,患者样本收集在起始的抗生素(24小时前最多48 h后的第一剂量静脉注射抗生素),在完成抗生素治疗(24小时前最多48 h后最后一次剂量的静脉注射抗生素)。
自发咯血痰收集和运输在15分钟到实验室进行处理的厌氧内阁。所有样本划分一个整除立即处理文化和第二个整除冷冻和储存在−80°C为后续分子检测在北卡罗莱纳大学教堂山分校。
分子检测
详细的分子细菌检测程序中提供在线补充。短暂,从冷冻提取的DNA (−80°C)痰液样本和接受两个定量实时PCR (qPCR)分析来确定总细菌负荷和末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)评估细菌多样性和细菌类群的分类。1617qPCR,样本分析重复使用先前发表在三个不同的浓度16的通用引物和TaqMan探测器放大的保守片段细菌16 s rRNA核糖体RNA基因。T-RFLP分析,16 s rRNA基因PCR扩增使用Bac8f和Bac926r引物5′端荧光标记的。结果PCR产品消化与限制性内切酶在两个不同的反应有三世和铁道我和标签终端片段的长度是由毛细管电泳。
病人的特点
对于每一个病人,性别、年龄、体重、肺功能(FEV1)和血清炎症标记物(C反应蛋白(CRP),白细胞计数(WCC))在每个时间点获得。静脉注射抗生素治疗急性恶化的信息也被收集。
统计分析
的详细描述统计方法在网上补充提供。抗生素治疗之前和之后,参与者特征比较采用配对样本t检验或魏克森讯号等级测试。Kappa统计计算测量细菌的存在与否之间的协议被文化和T-RLFP。可行的数量在每个时间点相比,抗生素治疗之前和之后使用魏克森讯号等级测试。比较三个时间点同时使用弗里德曼测试。日志10qPCR比较治疗前后采用配对样本t检验。
结果
病人特点和痰液样本
23个患者登记和痰液样本收集静脉抗生素治疗的起始和完成。的平均年龄为24.9岁(范围18-41)。恶化的患者治疗两次三个研究过程中导致26配对的起始/样品完成治疗。痰也收集了来自13个患者(平均年龄27.0岁(范围19-41)临床稳定的时候,有七个样品收集在恶化之前,五个样品收集后恶化和一个样本收集治疗之间的两个单独的发作。集合之间的平均时间间隔稳定和恶化的痰样本是155天(范围19 - 281)和137天(15 - 231)恶化后收集的样本。
病人特点提出了表1。静脉注射抗生素治疗的平均持续时间是13天(范围7-24),所有患者改善临床。肺功能(FEV1)显著增加平均0.4 l和c反应蛋白和“抗生素治疗后显著降低恶化的中位数是7.6μg / dl和2.5×109分别/ l (表1)。由于广泛的抗生素疗法用于治疗急性加重在线补充(见表1)和小样本大小,我们无法确定其是否有特定的抗生素使用和变化之间的关系在厌氧细菌负荷后治疗。患者主要是口服阿奇霉素或吸入粘菌素或妥布霉素作为长期维持治疗。同样,由于小样本大小,我们无法确定是否有相关性抗生素预防和存在/没有任何特定的细菌物种。
分离出的细菌培养和鉴定
主要有氧病原体中丰度高(高达5×108cfu / g痰)在24/26样品的治疗(P绿脓杆菌16;B不过复杂,治疗(8),22/26完成P绿脓杆菌,15;B不过复杂,7)和稳定的样品(11/13P绿脓杆菌,9;B不过复杂的,2)(参见图1在网上补充表2)。只有一个病人(病人19),经历过两次发作在研究期间,既没有P绿脓杆菌也不B不过复杂的痰培养五个时间点。此外,P绿脓杆菌培养从一个病人(病人7)开始抗生素治疗但不稳定,时在完成治疗。同样的,B不过培养出复杂的一个病人(病人3)在启动而不是完成抗生素治疗。这些异常,患者有相同的需氧细菌以连续的痰样本(见图1和表3的在线补充)。
厌氧细菌被发现在高数(3×107cfu / g痰)在样本所有患者抗生素治疗开始之前五个不同物种发现每痰样本在线补充(见图1)。厌氧菌的检测到,韦永氏球菌属(14个样本)和物种普氏菌物种样本(6)是主要的。在完成抗生素治疗,厌氧细菌被检测到文化在23/26样品,韦永氏球菌属(14)样品普氏菌(7)样品最普遍。厌氧细菌也被发现在所有13个样本稳定患者韦永氏球菌属(2)样品,放线菌(3)样品普氏菌(2)样品的物种是最常见的。链球菌,成长在有氧或无氧条件下,检测到文化在12和7起始和完成治疗的样本,分别。文化结果表明,总的来说,尽管细菌群落的组成不同病人之间,它保持相对稳定在大多数人尽管抗生素治疗,与类似的数字和属的有氧和无氧物种在每个采样时间点(见检测图1和在线表3)。
属被文化和末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)囊性纤维化患者痰液样本收集从成人在启动(恶化)和完成静脉抗生素治疗(治疗)年底恶化,当稳定(稳定)。
文化无关T-RFLP检测微生物群落组成和比较,总从文化数据可行的计数
细菌的组成社区也在64份痰液样本分析T-RFLP(请参见图1 b和网上在线表3)。一般来说,所有的样本包含众多终端限制片段表明痰标本细菌多样性大于被文化。为了比较文化和T-RFLP结果,T-RFLP模式每个样本与模式产生16 s rRNA基因克隆在网上补充(见表2)代表22属经常发现在CF痰。在此基础上比较,生物属于22属预测存在共64个样本(251倍图1和表2)。
主要有氧病原体(假单胞菌和洋葱)检测到文化被T-RFLP预测发生在相应的患者样本(请参见图1 b在在线补充)。严格厌氧菌被T-RFLP预计在22/26承认样品,20/25完成处理样品和9/13稳定样品有八个不同的厌氧属中发现一个痰液样本。类似文化的结果,韦永氏球菌属和普氏菌经常被检测到。此外,大量的厌氧属被T-RFLP多个样本包括专门检测Granulicatella(45/64),Porphyromonas(6/64),巴斯德氏菌科(5/64)。与培养结果一致,分子检测也显示,细菌的组成社区保持相对稳定在大多数患者类似T-RFLP生成模式(参见图1 b在网上补充)和类似的数字和属有氧和厌氧物种的发现。单独的光谱在不同的时间点相同的病人比较,证明该方法的重现性在线补充(见图2)。
之间的协议存在与否的细菌T-RFLP光谱和tvc文化等需氧细菌的比较好P绿脓杆菌(κ= 0.74)B不过复杂(κ= 0.92)但贫穷链球菌(κ= 0.05)和厌氧属等韦永氏球菌属(κ= 0.14)普氏菌(κ= 0.00)。
需氧菌和厌氧菌的比较可行的计数和抗生素治疗对细菌丰度的影响
有氧细菌培养条件下使用,是目前在比厌氧菌大量样品的起始抗生素治疗(平均差异TVC 4.9×107cfu / g (95% CI 1.8×10714.5×107);p < 0.001,魏克森讯号等级测试),当患者稳定(中位数差异TVC 3.8×107cfu / g (95% CI 1.1×1077.8×107);p = 0.01),但低所以在完成抗生素治疗(平均差异TVC 1.3×107cfu / g (95% CI−0.01×1076.2×107);p = 0.07;图2)。还有TVC减少好氧细菌的抗生素治疗(平均减少TVC 2.3×107cfu / g (95% CI 6.5×10712.8×107);p = 0.005,对应于一个值比例减少85%)和厌氧细菌减少一些类似的证据(中位数下降TVC 3×106cfu / g (95% CI 0.3×1067×106);p = 0.046,对应于一个值减少51%;图2)。比较的数字(弗里德曼测试)的13个病人三个样本(稳定、起始和完成抗生素治疗)收集证据显示不同的有氧(p = 0.016),但不是厌氧细菌在三组之间(p = 0.15)。生成一个更taxa-specific视图的细菌物种丰度变化与抗生素治疗,可行的计算个别物种在不同的时间点进行比较。P绿脓杆菌6.7×10的下降保持紧密的关系7cfu / g在抗生素治疗2.5×107cfu / g抗生素治疗后的16个样本匹配对P绿脓杆菌已经检测到入院治疗(平均减少TVC 2.0×10吗7cfu / g (95% CI 0.5×1076.8×107);p = 0.01,对应于一个值减少89%;图3)。没有明显的TVC的差异对于任何其他物种。
完全可行的计数/ g痰的有氧和厌氧细菌培养从痰标本收集成人患有囊性纤维化起始(恶化)和完成静脉抗生素治疗(治疗)年底恶化,当稳定(稳定)。那么,克隆形成单位。
总额的比较可行的计数/ g痰铜绿假单胞菌。那么,克隆形成单位。
除了与TVC量化细菌负荷,我们还利用qPCR、低成本的高度敏感和可再生的分子技术针对守恒的16 s rRNA的基因。16虽然这个方法不区分细菌物种,有证据显示减少总细菌与抗生素治疗浓度的在线补充(见图3)日志10qPCR值平均0.53 (95% CI 0.13 - 0.94)高于起始与结束治疗(p = 0.01,配对样本t检验)。
讨论
在这项研究中我们用好氧/厌氧培养和分子(T-RFLP)技术探讨微生物群落多样性和丰富痰从起始和完成的CF患者抗生素治疗急性恶化,当临床稳定。多个厌氧物种被两种方法检测,进一步确认和扩大在先前的研究的结果4 - 8101118 - 20有报道说,社区内存在一个高度多样化的幼童腹壁薄弱CF肺。此外,这两种方法都证明细菌的组成社区保持相对恒定的大多数病人抗生素治疗前后临床稳定的时候,这恶化之间有相似的成分和稳定状态。在之前的研究中稳定的CF患者我们还演示了持久性厌氧物种的多个样本相同的病人。8不幸的是,由于小样本大小,我们无法确定其是否有关联特定物种的存在与否,重要的是,未来的研究更大的病人数字解决这个问题。这些结果提供进一步的证据表明CF患者建立肺病长期遭到一系列的殖民细菌物种,包括厌氧生物,它坚持尽管抗生素治疗。
尽管细菌的组成社区保持相对不变,我们定量的文化结果表明,细菌丰度的变化可以发现抗生素治疗后,与这种效应更明显比厌氧菌为需氧菌。证实了这一发现qPCR显示减少细菌16 s rRNA基因拷贝/ g痰后抗生素治疗。此外,我们的研究结果还表明,P绿脓杆菌比其他成员更容易受到当前抗生素疗法只有属的微生物群落中有显著减少大量的抗生素治疗。这可能是因为大多数患者的抗生素治疗是针对P绿脓杆菌,(妥布霉素和头孢他啶)使用的抗生素主要有可怜的体外对厌氧细菌的活动。1021我们的发现与先前的报道是一致的,表明细菌负荷减少痰后抗生素治疗与临床改善。22日至25日发作与广泛的抗生素疗法治疗,所以我们uable来确定是否有特定抗生素的使用之间的关系如meropenem-which具有良好的体外活性对厌氧菌培养从CF痰810——厌氧细菌负荷治疗后的变化。
T-RFLP和文化之间有相对好的协议检测方法的识别更加丰富有氧病原体,P绿脓杆菌和B不过复杂。这一发现证实了以前的研究结果也报道优秀的有氧文化之间的一致性和细菌核糖体rna基因检测方法。711然而,与好氧细菌的发现,有可怜的协议T-RFLP厌氧菌和TVC文化数据存在于更大的多样性和低丰度。这些发现表明,这些非常不同的方法都同样有效地检测生物丰富,但是需要捕捉更丰富的全谱文化厌氧菌和潜在的困难。作为我们的识别预测涉及大量的细菌类群中缺乏特点和不足16 s rRNA基因序列数据库,我们鉴定到属级别限制。未来的厌氧细菌鉴定物种水平可能是重要的,当评估任何潜在的致病性厌氧菌。这进一步强调文化的重要性在厌氧细菌的检测数据中,这两种方法是互补的。T-RFLP作业,没有相应的文化作业可能是由于在样品的细菌培养的方法。此外,细菌属T-RFLP仅限于预言,这些生物的参考模式。包含额外的参考光谱将因此增加细菌属被T-RFLP的范围。然而,更昂贵的深度测序等方法26和微阵列(如16 s rRNA PhyloChip27)允许更全面的描述CF肺部微生物群落。
在目前的研究中,链球菌的链球菌milleri集团(SMG)和年代草绿色组识别出19个样品通过文化、链球菌检测到T-RFLP在47/64样品。这不是意外,我们的研究集中在厌氧细菌,我们没有使用选择性的媒体或孵化条件优化文化检测链球菌。先前的研究同样表明,链球菌从SMG可能无法检测到常规CF微生物协议。28一个案例研究报告29日和最近的纵向研究28都显示出有益的临床反应的治疗主要SMG有机体在加重,表明社区链球菌也可能导致幼童腹壁薄弱CF呼吸道的细菌病原体。文化协议在后续研究中应该修改优化这些生物的检测和定量。
潜在的致病细菌的作用,如厌氧菌和CF肺部感染链球菌仍不清楚。然而,其中的一些厌氧细菌已被证明是在其他肺部疾病致病30 -初步研究,我们小组已经表明他们也出现在患者的肺部non-CF支气管扩张。33最终,厌氧细菌的CF的临床相关性肺只能解决临床试验的病人接受抗生素只针对需氧细菌与抗生素针对需氧菌和厌氧菌。随后减少细菌负荷的确定结合分析肺功能和炎症标记物可以确定anti-anaerobe治疗导致改善临床结果。然而,一些抗生素对厌氧细菌与假定的抗菌活性并不是有效的体外对厌氧菌分离CF痰。810抗生素治疗中使用这些试验因此需要考虑厌氧菌的独特的敏感模式出现在CF肺。
总之,我们的结果表明,我们可以检测微生物群落内的细菌丰度的变化后抗生素治疗,但这些变化仅仅是大到足以能够单独P绿脓杆菌。他们还表明,好氧/厌氧培养和分子检测方法都需要全面描述微生物群落的CF肺。分子方法是敏感和准确,并提供一个更完整的细菌社区现在和直接改善特有的文化也可能是有用的方法。然而,他们不删除需要文化检测哪个更量化,并提供机会进行抗生素敏感性测试,随后可以使用抗生素治疗目标。CF进一步更大的研究幼童腹壁薄弱肺部感染,包括改变当前抗生素治疗的CF治疗这些新发现的细菌,迫切需要更全面地阐明他们的临床意义和提高CF患者的治疗策略和结果。
确认
作者承认格里先生的技术援助McGrillen(学院制药、贝尔法斯特女王大学)。我们也要感谢教授约翰·摩尔(贝尔法斯特健康与社会保健信托)有用的有关本研究的讨论。
引用
补充材料
脚注
相关文章157875年。
MMT,市场和调幅波的贡献同样的研究。
资金由英国囊性纤维化信任格兰特(PJ533)和来自美国国立卫生研究院的资助(HL084934)。MMT是支持健康和社会保健研发、公共卫生机构、北部Ireland-funded英国国家健康研究所职业科学家奖。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准本研究对研究伦理办公室批准,北爱尔兰。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
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