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背景在可疑的囊性纤维化(CF),轻度或单症状的表型经常导致诊断困难尽管详细算法。CF跨膜电导调节器(雌性生殖道)介导的离子传输可以在直肠活检体外研究肠道电流测量(ICM)。
目标描述诊断分类的参考价值和验证ICM可疑的CF患者年龄。
方法309年ICM进行直肠活检从130年婴儿,儿童和成人患者包括已知发育不良(PI) CF (n = 34), pancreatic-sufficient (PS) CF (n = 7),不清楚诊断轻度CF患者症状,中间测试和/或出汗雌性生殖道突变筛查(n = 61)和健康对照组(n = 28)。ICM是氯化与汗水,广泛雌性生殖道基因型和记录分析诊断组中。结果与先前的ICM与CF受试者的数据相比,两国没有先天性输精管,杂合子和控制。
结果ΔI的累积氯化物分泌反应sc、氯化氨甲酰胆碱,ΔI/ forskolin sc,营地和ΔIsc,组胺是最好的诊断ICM参数(截止34μA /厘米吗2患者之间已知PS-CF和控制),鉴别可疑的CF患者到PS-CF (n = 6)和CF不可能的(n = 55)组。广泛的基因型分析检测到两个突变致病(40%)与1.8%相比,100%的人列为PS-CF列为“CF不可能”。
结论雌性生殖道功能和基因型的全面调查突显了ICM的诊断价值,尤其是对CF的确认没有两个致病雌性生殖道突变,排除CF尽管中间汗水测试和年龄不适合鼻电位差测量。ICM功能评估的一个重要工具雌性生殖道未知突变的临床意义。
- 雌性生殖道功能
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- 基因型
- 算法
- 囊性纤维化
- 儿科肺有所启发
来自Altmetric.com的统计
介绍
囊性纤维化(CF)是由突变引起的CF跨膜电导调节器(雌性生殖道基因。1> 1500描述的临床相关性在大多数突变是未知的。2目前,只有23-28显然是接受基于CFTR功能检测描述CF致病23;其他人则被认定为中性的序列变异。1的广泛的雌性生殖道CFTR突变类与不同的细胞内影响检测蛋白质基本缺陷和修改基因导致一个巨大的变化在临床CF表型。4
不同的定义提出了“温和”CF形式,包括试图区分临床CF的广泛表型严重/轻微的,“典型的/非典型”或“经典/传达”。4 - 8相比之下,single-organ疾病表型相关的示范雌性生殖道基因异常但不适合当前CF诊断标准已经被描述为CFTR-related疾病。6诊断标准对CF已建立9但往往不足以排除或确认可疑CF“传达”10 - 12由于中间或正常出汗氯(Cl−)的结果和缺乏疾病遗传学证实或排除。鼻电位差(NPD)测量被用来克服诊断困境,1314但他们产生重叠结果温和形式的CF,不适合婴幼儿使用。在这个复杂的情况下,更新的术语和诊断算法351516板提出了共识,导致区分类别的CF(包括发育不良(π)CF和pancreatic-sufficient (PS) CF), CF不可能和一个中间类别(不确定/ CF可能)。然而,缺乏足够的诊断分类和随后的临床护理在一个高度选择的边缘案例仍然是一个严重的问题。
体外肠电流测量功能(ICM)用于研究人类CF雌性生殖道的基本缺陷组织,17日至19日和已被证明有潜在的诊断价值。Mini-Ussing钱伯斯被用来记录transepithelial短路电流(Isc)在刚获得人类直肠吸活检来衡量离子运输和Cl刺激后−分泌代理。通过这种方式,雌性生殖道Cl−通道,其数量的剩余函数和替代Cl−通道可以是调查。20.21这个方法安全过程适用于所有年龄段包括新生儿,它不需要镇静或特殊处理和局限性是罕见的。21到目前为止,ICM主要与NPD在CF患者群和控制研究设置,2223所以它不包括在标准诊断算法和共识。3516然而,经验CF患者和控制建议承诺在CF的诊断敏感性和特异性。
因此,我们进行了一项研究来评估的诊断可靠性ICM群体的病人已知CF,健康对照组和个人可疑的CF出现轻微的症状标准诊断测试和模棱两可的结果。我们预期相关的完整描述雌性生殖道基因型与雌性生殖道Cl的标志−频道在首次诊断群组功能,并旨在描述参考价值和验证信息最丰富的ICM参数。
方法
主题
一百三十名婴儿,儿童和成人(平均年龄16.9±12.5年;范围0.4 - -60.5;23% < 6年;35%≥18年;54%的男性)被招募在汉诺威CF中心,参加1998年和2009年之间的研究。这是一个前瞻性研究,旨在评估诊断的准确性ICM(参见图S1在线补充),和诊断测量在整个研究期间保持不变。我们研究了已知PI-CF组(n = 34),已知PS-CF (n = 7)和健康成人志愿者(n = 28)作为疾病和正常对照组确定最佳诊断ICM截止值。作为我们的参考中心困难CF诊断在德国,可疑的CF患者(n = 61)来自德国各地随后寄给我们,包括在这项研究中。所有已知的CF患者的诊断(PI + p)已经建立了典型的CF症状+汗水Cl−> 60更易/ l和/或浓度雌性生殖道突变分析根据商定的诊断标准。所有患者明确诊断与窦肺轻度或单症状的表现型(鼻息肉、鼻窦炎、慢性咳嗽、支气管炎、肺炎、支气管扩张,铜绿假单胞菌气道殖民),胃肠道(腹泻、未能茁壮成长、复发性胰腺炎)或泌尿生殖(精子缺乏)症状兼容CF“传达”。68炎症性直肠条件如溃疡性结肠炎不在或临床怀疑我们的队列。CF可疑的对象,面对外分泌PS 92%,验证了胰腺凳子弹性蛋白酶> 200μg / g。汗水Cl−浓度后毛果芸香碱离子电渗疗法(38.2±23更易/ l;两种情况下汗水生产)和/或不足雌性生殖道突变筛选是模棱两可的,露出一个雌性生殖道变异在26%的个人。雌性生殖道最常见的突变进行了突变筛查据当地建立实验室技术和病人的种族背景(包括95%的人筛选≥21突变)。进一步的CF测试的原因情况下汗Cl−< 30更易/ l和没有雌性生殖道突变筛选后大多是由于不确定性前所述CF罕见突变的情况下在这汗水类别和家庭和照顾者的强烈愿望排除CF。
肠道电流测量
离子传输性能在所有患者和健康志愿者309年研究了ICM直肠吸活检。transepithelial我sc整个组织是在循环我们注册室详细描述。17182124短暂、肤浅的直肠吸活检被不镇静的标准化程序,安装在我们室和孵化37°C与缓冲溶液。基底电位差(PD)基底),短路电流(Isc、基底)和transepithelial阻力(Rt,基底)测定和我sc作为一个直接测量离子的净运动在上皮被记录(通常为60 - 75分钟)后将特定化合物添加到粘膜(M)和/或浆膜洗澡(S)解决方案:阿米洛利,吲哚美辛,碳酰胆碱,8-bromo-cAMP forskolin, 4, 4′-diisothiocyanostilbene-2, 2′-disulfonic酸(做),组胺。详细描述了在网上补充。测量2 - 4活检是在所有科目。意味着个人结果基底组织个人ΔI参数和最大sc反应与特定的物质刺激后所有活检没有技术问题(> 98%)被用于进一步分析。ICM的结果都是与汗水Cl−浓度。
广泛的雌性生殖道基因型和记录分析
为主题的全面描述和确认诊断ICM的可靠性,一个广泛的遗传分析可疑CF组的61名患者。的全部编码序列的突变筛查雌性生殖道基因从提取的基因组DNA进行使用雌性生殖道测序或单链构象多态性/ heteroduplex分析。25DNA样本出现异常的乐队模式在单引号或双链是测序两次,在两个方向。此外,多态TG序列米Tn在基因内区826(n = 44)和多路复用结扎依赖探针扩增子组(n = 7)测定。使用RNA来源于鼻腔上皮细胞通过刷牙,实时定量rt - pcr进行LightCycler 1.2设备来确定数量的外显子9跳过27成绩单(n = 19)。
统计分析
数据提出了均值±SD,除非另有指示。统计数据进行SPSS 17.0。比较之间的ICM PS-CF诊断和CF不可能的组,Mann-Whitney U测试因为没有使用正态分布假定,也因为PS-CF组的样本容量小。所有p值双尾和接受为显示统计学意义p < 0.05。汗水测试结果之间的相关性并分别分析了ICM的CF可能和CF (PS-CF诊断,PS-CF和PI-CF一起)组和单独所有CF子组。因为汗液测试结果之间的线性关系和ICM可以假定,采用皮尔逊相关系数。
结果
肠道电流测量:参考价值
参考数据得到的已知PI-CF, PS-CF和健康对照组。这些从先前的研究结果相比值(PI-CF n = 240;PS-CF n = 20;先天性双边没有输精管(CBAVD), n = 21;胰腺炎,n = 7;杂合子,n = 22;健康对照组(n = 191)记录与同一ICM设置在鹿特丹和汉诺威CF和协议的中心和被发现是非常相似的(表1)。通过这种方式,一个已知的明确的ΔI截止值sc、氯化氨甲酰胆碱学科之间PI-CF(< 10μA /厘米2)和控制(> 10μA /厘米2)确认。的意思是与PS-CF受试者的反应比那些PI-CF根据雌性生殖道的梯度功能障碍,和单身PS-CF个人显示大量的剩余Cl−分泌与ΔIsc、氯化氨甲酰胆碱反应到15μA /厘米2,约占最低5%的范围控制。专性杂合子和控制由ICM没有区分。
在我们目前已知PI-CF患者群,PS-CF和健康对照组,最好的诊断ICMΔI计算累积值的响应sc、氯化氨甲酰胆碱,ΔI/ forskolin sc,营地和ΔIsc,组胺(我sc,碳水化合物+ + hista营地,考虑到两个雌性生殖道和替代Cl−渠道),明确的截止值34μA /厘米2PS-CF与控制(图1);PI-CF的最大价值是16.1μA /厘米2。这新的参数提供了最好的已知PS-CF患者诊断区分和控制,敏感性和特异性为100%在当前队列与先前已知的诊断(参见图S1在线补充)。
ICM的引用值诊断参数已知PI-CF组(n = 34),已知PS-CF (n = 7),健康对照组(n = 28)和验证在目前的诊断群组分为PS-CF (n = 6)和CF不可能的(n = 55)根据广泛雌性生殖道基因型分析和前面确定的ICM截止值的34μA /厘米2因为我sc,碳水化合物+ + hista营地(线)。我的变化sc与阿米洛利刺激直肠组织后(100μM),碳酰胆碱(100μM), 8-Br-cAMP(1毫米)+ forskolin(10μM)和组胺(500μM)所示。碳水化合物+阵营+ hista表示计算个人累积ICMΔI的反应sc、氯化氨甲酰胆碱,ΔI/ forskolin sc,营地和ΔIsc,组胺。箱线图显示矩形IQR描绘,与水平线代表上四分位数上的,其次是中值和较低的水平线代表下四分位数。non-outliers的范围是由上、下胡须发起的矩形,即数据点比上四分位数+ 1.5差(或+ 3位差)和小于下四分位数−1.5差(或−3位差)被认为是离群值(圆圈)或极端值(星号),分别显示为单独的数据点。CF,囊性纤维化;ICM,肠道电流测量;差,四分位范围;我sc短路电流;π,发育不良;PS, pancreatic-sufficient。
在可疑的CF ICM:雌性生殖道功能,雌性生殖道基因型和记录分析
的基础上新成立的ICM参考数据,目前诊断组可疑的CF随后分为PS-CF (n = 6)和CF不可能的根据我(n = 55)sc,碳水化合物+ + hista营地ΔI(累计值的响应sc、氯化氨甲酰胆碱,ΔI/ forskolin sc,营地和ΔIsc,组胺)在34μA截止/厘米2(图1)。
ICM基底组织状况的诊断群组与已知值从受试者PI-CF, PS-CF和健康对照组:Rt,基底23.3±5.0Ω×厘米2vs 23.3±5.5Ω×厘米2(分别为PS-CF vs CF不可能;p = 0.97),我sc、基底44.7±37.8μA /厘米2vs 57.4±35.9μA /厘米2(p = 0.22)。与不同的促分泌素刺激直肠组织后,我transepithelial的净变化sc显示以下反应:ΔIsc,阿米洛利−5.2±2.9 vs -8.5±10.7μA /厘米2(p = 0.60);ΔIsc、氯化氨甲酰胆碱8.0±7.7 vs 40.9±18.1μA /厘米2(p < 0.001);ΔI/ forskolin sc,营地6.1±3.9 vs 19.5±13.4μA /厘米2(p < 0.001);ΔIsc,组胺8.6±6.0 vs 32.4±19.7μA /厘米2(p = 0.001)。对于ΔIsc、氯化氨甲酰胆碱,以前认为是最好的诊断参数,21在2/6(33%)列为PS-CF我们获得的反应> 10μA /厘米2,这意味着高残留Cl−分泌功能,个人显示最高的响应报告PS-CF(20.2μA /厘米2)。相比之下,6/55(11%)的患者分为有ΔI CF不太可能sc、氯化氨甲酰胆碱响应的< 20μA /厘米2,展示ΔI的极限sc、氯化氨甲酰胆碱作为诊断参数。ICM和汗水测试结果的相关性进行“CF不可能”组,CF组(PS-CF诊断,PS-CF和PI-CF一起)和所有CFΔI单独子组sc、氯化氨甲酰胆碱(图2一个),ΔI/ forskolin sc,营地(图2 b),ΔIsc,组胺(图2 c),我sc,碳水化合物+ + hista营地(图2 d)。结果给出了表2。的相关性一直低的CF可能和PI-CF团体和一贯温和的对整个CF组。中间组PS-CF诊断和PS-CF,我计算sc,碳水化合物+ + hista营地目录建立最好的诊断与汗水ICM marker-correlated Cl−浓度和证实雌性生殖道的梯度功能障碍,同时提供重要的诊断信息除了汗水单独测试。分析显示八个可疑的CF患者汗液Cl−水平> 60更易/ l(通常兼容CF诊断要是基于汗水Cl−)和一个正常的ICM(我sc,碳水化合物+ + hista营地,ΔIsc、氯化氨甲酰胆碱),说明瀑特异性Cl−分泌功能群的个体。
ICM和汗水氯(Cl−)浓度导致患者已知PI-CF (n = 25;只有汗水钠中可用),PS-CF (n = 7)和诊断可疑的CF患者,分为PS-CF (n = 6)和“CF不可能”(n = 53个;没有汗水测试:n = 2)根据累积ICMΔI的反应sc、氯化氨甲酰胆碱+ΔI/ forskolin sc,营地+ΔIsc,组胺(我sc碳水化合物+ + hista营地)和广泛的雌性生殖道基因型分析。(一)ΔIsc、氯化氨甲酰胆碱和汗水Cl−;(B)ΔI/ forskolin sc,营地和汗水Cl−;(C)ΔIsc,组胺和汗水Cl−;(D)我sc,碳水化合物+ + hista营地和汗水Cl−。线表示汗Cl−类别正常(< 30更易/ l)、中级(30 - 60更易/ l)和病理(> 60更易/ l)和最好的ICMΔI截止值sc、氯化氨甲酰胆碱(PI-CF < 10μA /厘米2,PS-CF < 20μA /厘米2、控制> 10μA /厘米2),我sc,碳水化合物+ + hista营地(PS-CF < 34μA /厘米2、控制> 34μA /厘米2)。CF,囊性纤维化;ICM,肠道电流测量;我sc短路电流;π,发育不良;PS, pancreatic-sufficient。
发现存在两个广泛的基因型分析雌性生殖道突变(40%的已推荐CF致病)23在100%的个体分类由ICM PS-CF相比之下,1.8%的人列为“CF不可能”在网上补充(见下表),支持ICM的诊断价值。功能结果没有被探索过的许多表现出突变。在所有个人汗Cl基因型分析−> 60更易/ l和正常ICM未能发现雌性生殖道突变,我们因此分类CF不太可能的。T5等位基因,这明显影响外显子拼接效果的9和决定的CFTR功能检测记录,28中检测出九个CF不可能的情况下,六人没有其他发现的突变吗雌性生殖道基因。三个患者T5等位基因有一个雌性生殖道突变(G551D / -;F508del / -;I177F / -),但TG米状态(TG11)如果可用暗示是良性的,提供进一步的证据分类的CF不太可能。与TG12 T5等位基因存在于两个主题分类CF不可能的(见表在网上补充,ID 30 - 47),其中CFTR-related疾病的可能性不能排除目前。定量记录分析,外显子9跳过的比例达到18.0±12.5%(范围2.9 - -41.6%),平均水平较高的T5等位基因的患者(29.6%)比其他(12.6%)、支持DNA分析的结果。外显子9跳过健康对照组的4.3 - -6.9%(平均5.6%)(T7和T9;n = 4)和34.0% (T5;n = 1)。
与病理诊断解释所有人,包括那些汗水测试,仔细,总是基于个人临床和雌性生殖道表型。在所有情况下我们告诉患者和合作中心,今天的CF或分类的CF可能仍然是一个临床决策基于现有诊断方法描述雌性生殖道表现型和基因型,并建议临床长期随访的所有患者病理结果至少一个诊断方法。
讨论
确认或排除诊断过程温和形式的CF是一个临床的挑战为患者和临床医生具有重要的影响。由于异质性的雌性生殖道基因型和表现型,CF产生的怀疑越来越群体的儿童和成人有轻度症状可能CF从而导致混乱,社会心理后果和误诊的CF尽管详细诊断标准及处理算法。敏感的方法至少在某些专家中心,帮助消除因此需要诊断困境。
在这项研究中我们阐明肠道Cl的诊断价值−分泌功能的ICM直肠活检。前面描述的CF的定义主要是基于临床表型和汗水测试和不包括诊断ICM数据。然而,雌性生殖道功能障碍的额外的分析ICM在目前的研究更加完整,和相结合的方法描述雌性生殖道功能在不同器官(CFTR可能不同的敏感性检测功能障碍)似乎是一个重要的诊断调查轻微或单症状的患者的表型。先前的研究在可疑的“非经典”使用NPD CF确认的重要性,描述雌性生殖道的基本缺陷的程度在不同的器官。1314然而,使用NPD的限制在幼儿和鼻息肉是一个相关的问题。ICM方法的一个重要优点是它的可行性的关键年龄< 6岁的时候,开始时新生儿筛查。因此我们包括所有年龄段的一大群病人CF和调查可疑的ICM相比,汗水Cl的可靠性−浓度和广泛的雌性生殖道第一次基因型分析。
为诊断解释,之前建议ΔI截止值sc、氯化氨甲酰胆碱作为一个ICM参数时似乎没有足够可靠应用于极端表型。对应于汗水Cl−结果在边缘或传达的CF患者的正常范围,我们报告第一PS-CFΔIsc、氯化氨甲酰胆碱反应20μA /厘米2CFTR,表明高残留检测功能。理论上存在的罕见的患者雌性生殖道突变导致损失不到80 - 85%的雌性生殖道功能水平的colonocytes ICM逃避检测的技术讨论。21然而,这项研究的结果表明ΔI的累积响应sc、氯化氨甲酰胆碱,ΔI/ forskolin sc,营地和ΔIsc,组胺(我sc,碳水化合物+ + hista营地ICM)作为最好的诊断参数。在相对较小的患者群PI-CF, PS-CF和健康对照组用于验证的参数,我sc,碳水化合物+ + hista营地显示100%的敏感性和特异性,支持证据表明ICM目前最好的诊断测试CF PS-CF患者之间没有重叠的结果和控制。虽然该研究旨在确定ICM的诊断准确性,缺乏一个更好的比一个广泛的黄金标准雌性生殖道CF可疑的基因型分析群体可能是一个限制,和新成立的ICM截止值应该进一步应用于病人的诊断调查可疑的CF。
我们都知道,即使是一个广泛的基因型调查不能作为诊断参考和100%汗水Cl−浓度> 60更易与CF / l结合可能症状,如单一患者分为CF可能由ICM和基因型分析,将兼容CF诊断。相比之下,连续梯度CF和CFTR-related雌性生殖道功能障碍的疾病,这对术语仍在辩论和诊断定义,可能还包括单个个体与假阳性汗水测试由于瀑特异性差异在雌性生殖道功能障碍。然而,据我们所知,ICM的诊断评估的局限性问题CF可以被视为次要,和相对简单的排除诊断在大多数个人建立过程的作用在未来的诊断算法。进一步的比较与其他雌性生殖道功能障碍如汗Cl的标志−NPD将丰富的讨论,ICM纯合子指数情况下有助于描述CFTR功能后果的罕见突变检测的基本缺陷和临床疾病。2329日
总之,我们建立了参考价值和证明ICM是一个优雅而可靠的方法在所有年龄段的病人的诊断调查轻度或单症状的CF表型和模棱两可的标准测试,即使在罕见的病例雌性生殖道突变与残余Cl有关−分泌。ICM提供了重要的诊断优势为这些否则不确定主题和是一个重要的工具在新生儿筛查的时代cf对CFTR功能检测评估患者雌性生殖道未知突变的临床意义。
确认
作者感谢所有病人、家庭和CF合作中心的参与和帮助在这项研究中,我和H·德容Bronsveld良好协作和有益的讨论。
引用
补充材料
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网络只是数据thx.2009.125088
在这个数据补充文件:
脚注
资金621年德意志Forschungsgemeinschaft SFB C7和瑞士国家基金会(3200 - 066767.01,310000 - 112652)。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准这个研究在当地伦理委员会的批准下,MH汉诺威,德国和所有病人和/或父母和健康对照组给他们书面知情同意。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。