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背景:减肥,主要是由于骨骼肌萎缩,是一个频繁和临床相关的问题在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。这一现象的分子机制尚不清楚。本研究试图探讨是否激活诱导的核转录因子NF-κB和upregulation形式的一氧化氮合酶(间接宾语)发生在慢性阻塞性肺病患者的骨骼肌和低体重作为潜在的分子机制导致恶病质
方法:NF-κB DNA结合活性取决于情况变化分析和抑制免疫反应性的亚基IκB-κ伊诺的免疫印迹分析七股四头肌肌肉活检标本的COPD患者与正常体重指数(BMI, 27.5(1)公斤/米2)和7个患者低BMI(18.5(1)公斤/米2)。
结果:与正常体重的患者相比,那些低BMI显示NF-κB DNA结合活性增加了30%,较低的表达IκB-αIOD的(3.37 (0.47)v5.96 (0.75)IOD, p < 0.05;平均差2.59;95%可信区间4.53−−0.65)和更高的伊诺IOD的表达式(1.51 (0.29)v0.78 (0.11)IOD, p < 0.05;平均差0.74;95%可信区间0.04到1.42)。
结论:NF-κB激活和伊诺感应发生在骨骼肌慢性阻塞性肺病的患者低体重。这些变化可能导致的分子发病机制在慢性阻塞性肺病恶病质。
- 恶病质
- 慢性阻塞性肺疾病
- 一氧化氮
- 减肥
来自Altmetric.com的统计
慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者经常减肥的过程中他们的疾病。1这具有重要的临床意义,因为它加剧他们的预后2和生活质量。3因此重要的是要制定出合理、有效的新的治疗方法在慢性阻塞性肺病减轻体重。4然而,由于其发病机制尚不清楚,5,6更好的理解底层机制是至关重要的。4
骨骼肌的萎缩是减肥在慢性阻塞性肺病的主要原因。4,7精确的细胞和分子机制导致骨骼肌萎缩在这些患者尚不清楚。5,6不活动,系统性炎症、氧化应激、组织缺氧,和增强骨骼肌细胞凋亡被认为是,其中,潜在的致病因素。8因为系统性炎症9和缺氧10慢性阻塞性肺病患者中尤为普遍低体重和都是众所周知的抗病诱导剂诱导同种型的一氧化氮合酶(间接宾语)核转录因子NF-κB通路,11日,12我们提出,激活NF-κB和伊诺upregulation可能发生在慢性阻塞性肺病患者的骨骼肌与低体重。这可能构成分子机制导致这些患者恶病质因为伊诺upregulation会导致蛋白质nitrotyrosination和支持通过ubiquitin-proteasome蛋白质降解途径13,增强骨骼肌细胞凋亡,14一个事件发生在慢性阻塞性肺病患者低体重。15
调查这个假设我们比较(1)NF-κB DNA结合活性的程度由电泳迁移率改变分析(EMSA)和抑制免疫反应性的亚基(IκB-α)通过免疫印迹分析,和(2)免疫反应性免疫印迹分析伊诺的股四头肌活检标本中获得慢性阻塞性肺病患者的正常(n = 7)或低(n = 7)体重。
方法
病人
慢性阻塞性肺病的诊断根据英国胸成立社会准则。16病人总是研究临床条件下稳定,这是缺乏定义的变化和/或需要治疗急性医疗在过去的2个月。所有患者接受吸入支气管扩张剂治疗。9名患者同时接受吸入类固醇治疗,但没有收到了口服类固醇。低体重被定义为身体质量指数(BMI) < 21公斤/米2。15
我们机构的伦理审查委员会批准了研究和所有参与者的知情同意签署。
肺功能
迫使肺量测定的参数(GS,沃伦·E·柯林斯,布伦特里,妈,美国)和动脉血气紧张(IL BG3 Izasa,西班牙)测量在所有患者(表1)。肺量测定的参考价值的地中海。17
肌肉活检
经皮穿刺活检是来自股四头肌的外侧部分(在大腿中部水平)在局部麻醉下,如前所述。15日,18肌肉样本立即在液态氮冷冻和储存在−80°C到分析。
Immunodetection伊诺,IκB-α,α-tubulin
免疫印迹进行如前所述在我们的实验室。12总之,冷冻肌肉样本(5 - 10毫克)单一化(1:10 w / v)在寒冷的10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.5包含1%钠十二烷基硫酸盐(SDS)和鸡尾酒的蛋白酶抑制剂(罗氏诊断,曼海姆,德国)。样本在12 000 g离心10分钟4°C。收集得到的上层清液和蛋白质测定的方法,布拉德福德。19一百年得到的上层清液μl与同等体积的混合加载缓冲区(125毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,4% SDS、20%甘油、10% 2-mercaptoethanol和0.005%溴酚蓝),然后煮4分钟。195至20μl产生的悬浮是装载在10%聚丙烯酰胺凝胶和提交SDS-polyacrylamide凝胶电泳。被转移到蛋白质硝化纤维素膜(免疫印迹、免疫印迹)孵化在磷酸缓冲盐(PBS)含4%脱脂奶粉(屏蔽解决方案)1小时在室温下与温和的摇摆。膜是第一次孵化晚上4°C在屏蔽解决方案包含主要的抗体,然后洗后,二次抗体。以下主要使用抗体:anti-iNOS兔多克隆抗体在1:10 0稀释(转导实验室、圣地亚哥、钙、美国),在1:1000 anti-IκB兔多克隆抗体稀释(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯、钙、美国),和anti-α-tubulin鼠单克隆抗体(西格玛化工有限公司、圣路易斯,密苏里州,美国)1:20 00稀释。二级抗体,辣根过氧化物酶与羊anti-rabbit免疫球蛋白对伊诺和IκB-α和辣根过氧化物酶与驴anti-mouse免疫球蛋白为α-tubulin (Amersham国际,白金汉郡,英国)都孵化在阻塞1:1000稀释溶液在室温下2小时。anti-iNOS抗体的特异性是由免疫印迹分析,积极控制小鼠巨噬细胞的纯化伊诺(转导实验室),通过积极的控制在我们实验室进行诱导伊诺A549细胞中表达的细胞因子和脂多糖由浅野描述等。20.免疫反应性检测和化学发光免疫印迹检测系统(美国皮尔斯,罗克福德,IL)的帮助下一个化学发光敏感的视频摄像系统(Syngene,剑桥,英国)。结果正常化α-tubulin内容。
电泳迁移率改变分析(EMSA)
因为收益率相对较低的蛋白质在骨骼肌活检针,NF-κB激活决心在池核提取物与其他调查人员之前完成。21核蛋白质(20μg)被洗涤剂溶解从肌肉中提取样本22和孵化20分钟绑定缓冲(10毫米三,50毫米氯化钾,MgCl 5毫米21毫米,德勤在pH值7.5)包含2.5%甘油、1% NP-40 20 fmol生物素标记双链寡核苷酸的共识序列包含NF-κB-DNA结合位点(5′-AGTTGAGG GGACTTTCCCAGG-3′)。特异性是由添加200倍的未标记的双链NF-κB过剩。dna蛋白质复合物解决non-denaturing 6%聚丙烯酰胺凝胶在1 x Tris-borate-EDTA缓冲区。使用LightShift的弱智乐队是由化学发光检测化学发光EMSA工具包(皮尔斯)。确认的身份NF-κB绑定,supershift实验使用anti-p65执行人类抗体(圣克鲁斯生物技术公司)。短暂,EMSA凝胶被转移到孵化的硝化纤维膜屏蔽解决方案1小时在室温下与温和的摇摆。膜被孵化一夜之间在4°C屏蔽解决方案包含anti-NF-κB p65主要在1:1000兔多克隆抗体稀释(圣克鲁斯生物技术)。二级抗体,辣根过氧化物酶与羊anti-rabbit免疫球蛋白(Amersham国际)孵化在阻塞1:1000稀释溶液在室温下2小时。减速带(EMSA)和免疫反应性与化学发光检测系统检测(皮尔斯)借助化学发光敏感视频摄像系统(Syngene)。乐队是统计的densitomery借助Genesnap和Genetools软件(英国剑桥天气学有限公司)。
统计分析
结果意味着(SE)。未配对t测试是用来评估统计学意义差异的群体。估计的规模效应,指的是差异和95%可信区间(CI)计算。变量之间的相关性进行了探讨使用斯皮尔曼系数(ρ)。p值小于0.05被认为是显著的。
结果
临床数据
表1显示了患者的主要临床和功能特征包括在这项研究。所有的病人都是男性。通过设计,体重指数显著低于低体重。年龄、吸烟史和吸烟者的比例(2/7)在两组相似。虽然两组表现出严重的气流阻塞,这是大大增强患者的BMI较低。气体交换障碍在两组相似。
伊诺表达式
如图1所示,慢性阻塞性肺病患者的伊诺表达高水平与低体重指数(1.51 (0.29)IOD)与正常体重比(0.78 (0.11)IOD, p < 0.05;平均差0.74,95% CI 0.04 to1.42)。在我们实验室,我们调查了伊诺表达骨骼肌的六个健康受试者年龄相仿的,如预期的文学,23它被发现几乎没有(IOD的0.23 (0.02);数据未显示)。
免疫印迹(A)代表伊诺三股四头肌肌肉的慢性阻塞性肺病患者正常BMI和三个患者低BMI。(B)的意思是(SE)伊诺表达式(正常化α-tubulin内容)在每个组。
NF-κB激活
与正常BMI患者相比,那些低体重会增加30% NF-κB核绑定(图2)。按照这个观察,IκB-α免疫反应性显著减少那些低BMI (IOD的3.37 (0.47)v5.96 (0.75)IOD, p < 0.05;平均差2.59,95% CI 4.53−−0.65;图3)。有趣的是,IκB-α免疫反应性显著相关的BMI和气流阻塞的程度(图4 a和B)。
代表电泳迁移率改变分析(EMSA)执行核提取物的股四头肌肌肉活检标本。(A)特异性NF-κB绑定评估竞争实验200倍非标签NF-κB寡核苷酸(巷1)和生物素标记NF-κB寡核苷酸。(B)特异性NF-κB绑定评估super-shift测定核提取没有孵化(巷1)或存在(巷2)抗体NF-κB p65亚基。(C) EMSA实验执行池核提取物从患者获得正常BMI(巷1)或低体重指数(巷2)。
(一)代表免疫印迹IκB-αCOPD患者的股四头肌肌肉正常或低体重指数。(B)的意思是(SE) IκB-α表达式(正常化α-tubulin内容)在慢性阻塞性肺病患者的股四头肌肌肉正常BMI (n = 7)或低体重指数(n = 7)。
免疫反应性的关系IκB-α和BMI (A)或(B)在1秒用力呼气量(FEV1)在慢性阻塞性肺病患者。实心圆圈表示患者低BMI和开放的圆圈表示患者正常BMI。
讨论
减肥是一个频繁和COPD患者主要临床相关问题引起的骨骼肌萎缩,4,7但其分子基础尚不清楚。5,6我们的结果有助于更好的理解这一现象显示激活的NF-κB和upregulation伊诺表达发生在慢性阻塞性肺病患者的骨骼肌和较低的身体质量指数。
最近的一些研究使用各种技术(包括免疫组织化学、免疫印迹分析和rt - pcr)已经证明,NF-κB激活和伊诺诱导发生炎性肌病患者的骨骼肌,24脓毒症,25或慢性心力衰竭。26我们所知,我们的研究首次表明,他们也发生在COPD患者的骨骼肌,特别是那些低体重(无花果1 - 3)。最近的一项研究巴雷罗等不能检测伊诺表达12股外侧肌的慢性阻塞性肺病患者。23然而,这项研究评估患者中慢性阻塞性肺病(FEV154(14)%预测),不包括患者低BMI(25(3)公斤/米2)。这显然与我们的研究中,患有严重的慢性阻塞性肺病(FEV128(2)%预测)和低得多的BMI值(18.5(1)公斤/米2)是包括在内。这是有可能的,因此,NF-κB激活和伊诺感应可能不会发生在温和的疾病患者没有骨骼肌萎缩。免疫反应性之间的相关性观察IκB-α和气流阻塞的程度(图4 b)支持这种可能性。
在人类中,伊诺表达式是核转录因子NF-κB的控制下。27日,28如果细胞NF-κB细胞质中的局部的形成是一个复杂的抑制蛋白质IκB-α。27日,28在刺激,IκB-α从这个复杂和NF-κB裂解是转移到细胞核(NF-κB激活)增强了基因转录。27日,28我们不确定具体因子(s)负责NF-κB激活和伊诺upregulation骨骼肌的病人包括在我们的研究中。然而,许多先前的研究已经表明,系统性炎症,氧化应激,和组织缺氧是NF-κB激活和伊诺表达的有效诱发者,11日,12,他们所有人在COPD患者较低的体重。5,8因此,他们可能会导致NF-κB激活和伊诺upregulation在我们的病人。
潜在影响
一氧化氮(NO)是一种自由基的分子合成的氨基酸l精氨酸的没有合成酶(NOS)。11到目前为止,三个主要的NOS亚型已经描述,表达的都是人类骨骼肌。23日,29日,30.所谓的神经元(nNOS)和内皮(以挪士)亚型表达持续出现,31日,32而诱导同种型(间接宾语)表达了许多刺激包括细胞因子,氧化剂和/或缺氧。33岁的34在低浓度,没有参与许多生理过程的调节骨骼肌32但是在高浓度细胞毒性。14增强细胞内浓度的不可以想象结果从伊诺的感应中观察到我们的研究可以促进骨骼肌萎缩,从而体重损失至少两种不同的但不是互斥的通路。一方面,它能增强骨骼肌细胞凋亡,14和我们实验室最近的结果支持这种可能性,15同时,另一方面,它会导致蛋白质nitrotyrosination通过ubiquitin-proteasome途径和促进他们的优惠退化。13根据巴雷罗等,23增加蛋白质nitrotyrosination确实发生在COPD患者的骨骼肌,和我们实验室初步结果(数据未显示)也支持这个论点。
方法的局限性
三个方法论的限制我们的研究值得评论。首先,由于侵袭性的骨骼肌活检过程用于获得样本,我们研究相对较少的患者。这限制了我们的发现的直接外推到整个人口慢性阻塞性肺病患者。其次,由于这些活检的蛋白质产量相对较低,我们确定NF-κB激活在池核提取物。虽然这并不理想,这种方法已经被其他调查人员在过去。21我们有信心与我们的结果,因为一方面,NF-κB核绑定的绝对值增加观察的范围(30%)是在以前的调查NF-κB激活其他呼吸道疾病支气管哮喘(44%增加21),另一方面,IκB表达式(间接NF-κB激活的标志28)是单独评估。此外,观察NF-κB激活可以发挥致病作用在慢性阻塞性肺病是骨骼肌萎缩的发展符合最近的结果显示,也是相关的发病机制在癌症患者肌肉腐烂和恶病质。27第三,我们没有测量没有生产,所以在伊诺显著差异蛋白表达之间的两组可能不直接转化为功能显著高于没有水平。
我们的研究表明,激活NF-κB和upregulation伊诺发生在慢性阻塞性肺病患者的骨骼肌和低体重。这可能构成分子通路导致这些患者骨骼肌萎缩。
确认
作者感谢病人他们愿意参与这个项目和河南博世,堡Bauza和天使格拉(RNs)为他们的帮助与肺功能的研究。
引用
脚注
支持部分FIS(00/0437和红色Respira (RTIC C3/011)), CICYT pb98 - 1084, SEPAR,治理Balear ABEMAR。
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